TUGAS KPA

PERTEMUAN 9
RINGKASAN KKT & KR

Dosen Pengampu : Dr. Apt. Maulita Cut Nuria, M.Sc

Disusun Oleh :
Nama : Savio Ricardus Kabur
NIM : 175010031
Kelas :A

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS WAHID HASYIM
SEMARANG
2020
 RINGKASAN

1. Tujuan Proses Pemurnian pada tahapan isolasi senyawa bahan alam

a) Memisahkan berbagai jenis senyawa dari sumber organik
b) Memisahkan senyawa yang bercampur sehingga dapat menghasilkan senyawa tunggal
yang murni
c) Mendapatkan senyawa metabolit sekunder dari tumbuhan karena senyawa metabolit
sekunder telah terbukti dapat memberikan manfaat terhadap kehidupan manusia.
d) Mendapatkan sebuah senyawa baru yang digunakan untuk pengobatan
2. Prinsip Kerja KKT (Kromatografi Kolom Tekan) dan KR (Kromatografi Radial)
 Prinsip Kerja KKT : Prinsipnya adalah bahwa eluen, di bawah tekanan gas (biasanya
nitrogen atau udara terkompresi) dengan cepat didorong melalui kolom kaca pendek
dengan diameter bagian dalam yang besar. Kolom kaca dikemas dengan adsorben
dengan ukuran partikel yang ditentukan. Fasa diam yang paling sering digunakan adalah
gel silika 40 - 63 μm. (Roge et al. 2011)
 Prinsip Kerja KR : Fungsi kromatografi radial didasarkan pada prinsip-prinsip
kromatografi partisi cair / cair, di mana dua fase cair bercampur dicampur bersama-sama
dan kemudian dipisahkan beberapa kali. Pelarut tunggal diisolasi berdasarkan pada
koefisien partisi yang berbeda dari masing-masing senyawa dalam fase pelarut versus
fase pengencer. Salah satu fase cair dari sistem dua fase digunakan sebagai fase cair
stasioner dimasukkan ke dalam kolom (rotor) sementara yang terakhir berputar pada
kecepatan rotasi yang dimodifikasi. Fasa diam dipertahankan di dalam rotor oleh gaya
sentrifugal yang dihasilkan. Fase kedua dari sistem dua fase digunakan sebagai fase
gerak yang mengandung zat terlarut untuk diekstraksi, hal Ini dimasukkan di bawah
tekanan ke dalam rotor dan dipompa melalui fase diam. Kedua fase dicampur bersama.
Pada saat itulah terjadi pertukaran molekul antara dua fase. Pemisahan zat terlarut
dicapai sebagai fungsi dari koefisien partisi spesifik (Kd) dari masing-masing zat
terlarut antara fase gerak dan stasioner. Fase seluler kemudian dituang di setiap outlet
sel sehingga memasuki sel berikutnya. Fraksi yang dielusi dari fase gerak dan stasioner
dikumpulkan selama beberapa menit sampai beberapa jam. Fraksi-fraksi ini, atau
dielusi, akan mengandung zat terlarut yang dimurnikan secara individu. (Mahesh et al.
2014)
3. Tahapan Pelaksanaan KKT
1) Analisis KLT untuk pencarian eluen/fase gerak.
Prinsipnya :
 dicari eluen yang memisahkan noda kromatogram yang terbaik, dengan Rf = 0,2
– 0,3 (untuk noda yang ingin dimurnikan).
  untuk senyawa flavonoid & turunannya, lazimnya dipakai campuran
(kloroform:n-heksana), (kloroform:etilasetat) atau (kloroform:metanol)
tergantung sifat polaritas dari chemical marker yang akan dimurnikan.
 Untuk senyawa terpenoid, lazimnya dipakai campuran n-heksana:etilasetat atau
n-heksana:kloroform.
2) Penyiapan kolom KKT
Prinsipnya :
 Berat sampel yang akan dipisahkan akan menentukan pemilihan diameter kolom
KKT yang akan digunakan, dengan arahan ketentuan :
Berat Sampel (mg) Diameter Kolom KKT (cm)
< 50 1
100 - 250 2
250 - 500 3

 Tinggi silica dalam kolom 15 – 17 cm (Silica G 60 mesh 60 – 200, Katalog

Merck : 7734)
 Silica dalam kolom KKT dihomogenkan dengan eluen (fase gerak) yang telah
terpilih untuk pemurnian, hingga tidak nampak adanya gelembunggelembung
udara (eluen boleh diulang-ulang untuk dimasukkan dalam kolom KKT).
 Catatan : selama mengelusi tidak boleh kering, eluen tidak boleh melewati batas
atas silica dalam kolom.
3) Penyiapan sampel dengan silica impreg (mesh 30 – 70, Katalog : 7733)
Prinsipnya : sama dengan impregnasi pada KVC
4) Fraksinasi/pemurnian dengan KKT
Eluen yang digunakan lazimnya hanya satu sistem campuran pelarut polaritasnya tetap),
lazimnya dibutuhkan 250 – 500 mL.
 Masing-masing fraksi ditampung dengan volume = 5 – 20 mL.
 Sebelum dihentikan atau dibongkar, fraksi yang terakhir dianalisis KLT dengan
dibandingkan dengan sampelnya. Jika semua senyawa atau chemical marker
target sudah keluar semua, proses fraksinasi dapat dihentikan.
5) Analisis KLT hasil fraksinasi/pemurnian => mirip pada KVC
6) Analisis kemurnian hasil isolasi
Fraksi-fraksi yang memberikan noda kromatogram tunggal dengan nilai Rf sama
dengan standarnya, digabung dicek kemurniannya, dielusi dengan 3 (tiga) sistem eluen
yang berbeda-beda (sifat polaritasnya).
Misal; sistem I campuran heksana : etilasetat; sistem II campuran kloroform :
metanol; sistem III campuran heksana : kloroform : etilasetat.

4. Analisis KLT hasil pemurnian secara KKT

 Analisis KLT untuk mengetahui hasil pemurnian KKT dilakukan dengan menggunakan
fase diam lempeng silica gel GF254 berukuran 7×10 cm untuk setiap fraksi dan fase gerak. Pada
analisis KLT ini untuk setiap fraksi dibuat 6 spot yang akan dideteksi dengan menggunakan 6
macam pereaksi semprot. Deteksi hasil bercak hasil elusi dilakukan dengan dilihat dibawah
sinar UV 254 nm, UV 366 nm, dan dengan 6 macam pereaksi semprot yaitu reagen FeCl 3; 2,4-
DNPH, Dragendorf, vanillin-asam sulfat, antimony (III) klorida, dan sitroborat.
Elusi dilakukan dengan fase gerak yang berbeda tiap fraksinya sampai mencapai batas
akhir. Deteksi pertama adalah dengan sinar UV 366 nm dan 254 nm. Kemudian lempeng dibagi
menjadi 6 bagian, dan tiap bagian disemprot dengan reagen : FeCl3, 2,4-DNPH, dragendorf,
vanilin-asam sulfat dengan pemanasan 105°C selama 5 menit, antimon (III) klorida ( sebelum
dan sesudah pemanasan 105°C selama 5 menit), dan sitroborat ( dideteksi pada sinar tampak
dan sinar UV 366 nm.
Fungsi dari digunakannya pereaksi semprot ini adalah untuk uji kualitatif senyawa aktif
sampel. Fungsi dari pereaksi semprot FeCl3 adalah untuk mendeteksi adanya gugus fenol pada
tanin atau polifenolat, reaksi positif adanya senyawa ini adalah dengan terbentuknya kompleks
berwarna biru, merah ungu, hijau, atau hitam kuat; pereaksi semprot dragendorf digunakan
untuk mendeteksi komponen alkaloid, reaksi positif dari uji ini adalah dengan ditunjukkan
warna coklat atau jingga-coklat dan merah-jingga dengan latar belakang kuning sampai kelabu;
pereaksi semprot sitroborat digunakan untuk mendeteksi keberadaan senyawa golongan
flavonoid dari glikosida saponin reaksi positif ditunjukkan dengan berpendar di bawah sinar UV
366nm.
Pereaksi semprot Antimon (III) klorida digunakan untuk mendeteksi turunan terpen dari
mono terpen sampai politerpen dan steroid, selain itu dapat juga digunakan untuk mendeteksi
glikosida jantung, saponin, lisnogin. Reaksi positif dari uji ini ditunjukkan dengan bercak
berwarna ungu atau coklat pada sinar tampak, apabila dibawah sinar UV 366 nm umumnya
bercak berpendar ungu merah, biru, dan hijau.
Vanilin-asam sulfat dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa atsiri (terpenoid, fenol
dan turunannya serta fenilpropan) dengan mekanisme abstraksi H+ sehingga terbentuk senyawa
ikatan rangkap terkonjugasi, peristiwa ini tidak terjadi sekaligus tetapi satu persatu secara
berurutan yang menyebabkan warnanya semakin lama semakin tidak stabil, dapat juga untuk
mendeteksi senyawa saponin yang ditunjukkan dengan adanya bercak berwarna biru, violet biru
atau terkadang berwarna kekuningn bila diamati pada sinar biasa.
Pereaksi semprot 2,4-DNPH dapat digunakan untuk mendeteksi secara kualitatif gugus
karbonil  dari keton atau aldehid, hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning.
2,4-NDPH tidak bereaksi dengan gugus karbonil pada asam karboksilat, amida, dan ester.

5. Analisis kemurnian hasil isolasi secara KKT

 Fraksi-fraksi yang memberikan noda kromatogram tunggal dengan nilai Rf sama dengan
standarnya, digabung dicek kemurniannya, dielusi dengan 3 (tiga) sistem eluen yang berbeda-
beda (sifat polaritasnya).
Misal; sistem I campuran heksana:etilasetat; sistem II campuran kloroform:metanol;
sistem III campuran heksana:kloroform:etilasetat.