Nama: Rifa Zakiyah Arifah

NPM : 1706026065
Kelas: ASF – B

Kuis Materi KCKT

1. Apa metode pemisahan KCKT yang sebaiknya digunakan untuk analisis KCKT
senyawa organik ionik lemah? Jelaskan alasannya!
Metode pemisahan KCKT pada senyawa ionik lemah yang paling baik adalah
dengan menggunakan partisi fase terbalik ion suppression atau dengan ion pairing.
Alasan pemakaian metode ini didasarkan adanya pada pemisahan sampel-sampel yang
mudah terdisosiasi dalam larutan air. Adanya peristiwa ini mengakibatkan konsentrasi
dari sampel yang terpisah menjadi berkurang (dilihat dari profil puncak pada
kromatogram yang kurang tajam). Maka dari itu dilakukan proses optimasi dengan
menghalangi terjadinya disosiasi dan zat terlarut dapat terelusi dengan baik untuk
memperoleh profil puncak yang tajam. Proses optimasi yang dilakukan dengan
mengatur fase diam atau fase bergeraknya dan dengan menambahkan ion-ion
pengimbang pada fase diam atau fase bergeraknya untuk memperbesar pembentukan
garam antara sampel dan fase diam atau bergerak.
- Ion suppression (ionik lemah) → dilakukan dengan pengontrolan pH, pemilihan
pH didasarkan pada keasaman atau kebasaan analit.
- Ion pairing (ionik lemah-sedang) → didasarkan pada pembentukan suatu
pasangan ion antara sampel dan fase gerak maupun fase diamnya.
2. Perubahan pH fasa gerak KCKT fase terbalik dapat memperbaiki pelebaran
puncak, waktu retensi dan keterpisahan analit-analit senyawa yang bersifat
asam/basa lemah. Jelaskan alasannya!
Pada reverse phase atau fase terbalik, fase gerak yang dimiliki bersifat polar dan
fase diam bersifat non-polar dengan urutan elusi yang bersifat polar akan terjadi di awal
dan yang bersifat non polar akan di akhir. Perubahan pH fase gerak ini akan
mempengaruhi kepolaran dari asam/basa lemah tersebut karena apabila pH fase gerak
asam dan pH sampel merupakan asam lemah, maka sampel akan cenderung
mempertahankan protonnya dan tertahan di fase geraknya, hal ini menyebabkan waktu
retensinya akan lebih lama. Sebaliknya apabila sampel asam berada pada suasana basa
(pH fase gerak basa) proton di dalam pelarut akan berkurang sehingga asam akan
berdisosiasi menjadi bentuk konjugat basa sehingga waktu retensi akan lebih cepat
(menurun).
Adanya perbedaan pH yang signifikan terhadap sampel akan menyebabkan
bentuk peak yang lebar karena sampel mengalami pH gradient. Hal ini akan
menyebabkan keterpisahan analit-analit senyawa yang kurang baik dan tidak
memberikan hasil yang reprodusibel. Penyesuaian pH pada fase gerak dapat
menggunakan buffer. Buffer yang sering digunakan adalah sitrat, fosfat, dan asetat.

3. Penambahan pasangan ion dapat memperbaiki pemisahan analit dalam analisis

KCKT. Jelaskan apa penyebabnya!
 Karena pada saat ditambahkan pasangan ion atau counter ion, contohnya
Tetrabutil amin untuk asam, Pentana sulfonat, Heksana sulfonat, Heptana sulfonat
untuk basa akan menyebabkan pemanjangan rantai karbon. Sesuai teori, semakin
panjang rantai C akan menyebabkan suatu senyawa semakin nonpolar yang akan
menyebabkan waktu retensi (tR) semakin panjang. Tanpa adanya pasangan ion,
pemisahan analit dalam analisis hanya akan berdasarkan lipofilitas.

4. Optimasi pemisahan (R) dalam KCKT dilakukan dengan mengubah nilai

parameter k’, α, atau N.
a) Apa yang dimaksud dengan parameter-parameter tersebut?
k’ (retention) adalah nilai yang menunjukkan seberapa kuat komponen-
-
komponen dalam sampel yang dibawa oleh fase gerak berinteraksi dalam
kolom (fase diam)
- α (selectivity) adalah nilai yang menunjukkan seberapa baik sistem
kromatografi dapat memisahkan dua komponen
- N (efficiency) adalah nilai menunjukkan jumlah piringan teoritis (Theoretical
Plate) dari column yang digunakan dalam sistem KCKT
b) Apa yang dilakukan untuk mengubah nilai parameter-parameter tersebut?
1. Optimasi α (selectivity) → mengganti jenis fasa gerak atau kolom
2. Optimasi N (effeciency) → Dapat dipengaruhi oleh:
a. Sifat fisik kolom:
o ukuran partikel → makin kecil ukuran, makin tinggi efisiensi
o distribusi ukuran partikel
o bentuk partikel
o panjang kolom
o diameter kolom
o kualitas packing kolom
o volume injeksi
o masa injeksi
b. Laju aliran (flow rate)
3. Optimasi k’ (retention) → mengganti fase gerak/ kekuatan fase gerak
c) Bagaimana urutan perubahan yang biasanya dilakukan.
 Urutan: optimasi K’ → optimasi ∝ → optimasi N

5. Apa efek yang ditimbulkan akibat masih adanya gugus silanol bebas pada kolom
oktadesilsilana (ODS) pada KCKT fase terbalik? Bagaimana cara-cara untuk
mengatasi efek tersebut pada analisis senyawa basa organik?
Pada umumnya, gugus yang ditempelkan pada silanol adalah hidrokarbon rantai
panjang. Panjangnya rantai karbon mempengaruhi terhambatnya senyawa pada fase
diam. Gugus silanol yang tidak bereaksi karena adanya halangan sterik dapat
memberikan kepolaran yang tidak dikehendaki dan menyebabkan tailing peak. Cara
mengatasinya adalah dengan menambahkan trimetilklorosilan yang dapat mencapai
gugus silanol karena ukurannya yang lebih kecil dibandingkan organoklorosilan lain.
Penambahan trimetilklorosilan dapat menutupi banyak gugus silanol yang masih bebas,
naum tidak semua gugus tersebut dapat tertutupi.

6. Apa pengaruh dari: a) sampel load; b) volume injeksi; c) laju alir fase gerak; pada
efisiensi?
a. Sampel Load  Sampel load akan mempengaruhi efisiensi dan hasil akhir dari
pemisahan. Pemisahan akan semakin baik jika konsentrasi semakin kecil namun
dalam keadaan tertentu, seperti perbandingan kedua komponen yang terlalu
jauh maka akan dihasilkan pemisahan yang tidak akurat. Dapat dilihat pada
gambar berikut, semakin kecil konsentrasi sampel load maka hasil kromatogram
semakin akurat
b. Volume injeksi  Volume injeksi akan mempengaruhi efisiensi dan hasil akhir
pemisahan. Hasil pemisahan akan semakin baik jika volume yang dipakai saat
injeksi sekecil mungkin. Batasan volume injeksi manual sebesar 10µl. Untuk
hasil yang leih akurat dapat menggunakan autoinjektor. Pengaruh volume
injeksi terhadap efisiensi dapat terlihat pada gambar berikut :

c. Laju alir fase ferak  Pada pemisahan menggunakan KCKT sering dihasilkan
puncak yang lebar yang menunjukkan bahwa pemisahan yang terjadi kurang
efisien. fenomena ini disebut band broadening (pelebaran puncak) yang
dipengaruhi oleh kondisi sistem KCKT, yaitu laju alir. dapat dijelaskan melalui
persamaan van Deemter:
 Difusi eddy menjelaskan bahwa terdapat molekul analit yang mencapai
ujung kolom lebih cepat sementara yang lain lebih lambat, fenomena ini
menyebabkan terjadinya pelebaran puncak karena perbedaan waktu molekul
mencapai detektor. Hal ini disebabkan distribusi ukuran partikel fase diam tidak
merata (tidak dipengaruhi laju alir).
Difusi longitudinal merupakan kecenderungan molekul analit untuk
difusi ke daerah di kolom yang tidak ditempati oleh molekul lain (konsentrasi
tinggi ke rendah). Hal ini terjadi karena molekul yang berdifusi searah dengan
aliran fase gerak akan tiba lebih cepat di ujung kolom dibanding dengan
molekul yang berdifusi ke arah berbeda. Peningkatan laju alir akan menurunkan
kemungkinan terjadinya difusi longitudinal.
Pengaruh laju alir terhadap efisiensi pemisahan bahwa untuk mencapai
efisiensi yang optimum (HETP paling kecil), bukan berarti laju alir harus diatur
paling kecil ataupun paling besar, namun harus diatur sedemikian rupa,
sehingga pengaruh difusi longitudinal dan transfer massa menjadi kecil.

Referensi:
 Hayun. (n.d). Optimasi Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Fakultas
Farmasi Universitas Indonesia.
 Hendyana, S., 2006. Kimia Pemisahan: Metode Kromatografi dan Elektroforesis
Modern. Rosda, Bandung.
 Snyder, L. R., Kirklan, J.J., and Dolan, J.W., 2010. Introduction of Modern Liquid
Chromatography, 3rd ed. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken.
Kuis Materi KLT Densitometri
1. Apa kriteria pelarut untuk KLT agar bercak memenuhi syarat untuk dianalisis
secara densitometri?
- memberikan nilai Rf antara 0,2 - 0,8
- memberikan selektifikas yang cukup baik kepada komponen zat aktif yang akan
dipisahkan
- harus memiliki kemurnian yang sangat tinggi dan stabilitas yang baik
- memiliki viskositas yang rendah
- tidak toksik

2. Jarak elusi KLT lempeng biasa (20x20 cm) sebaiknya antara 12-15 cm. Jelaskan
apa alasannya?
Karena pada jarak 12-15 cm ekstensinya tidak mempengaruhi bercak, jadi tidak
meningkatkan hasilnya.

3. Jelaskan faktor apa saja yang dapat menyebabkan tailing dan bagaimana cara
mengatasinya?
❏ Apabila substansi overload atau berlebih pada lempeng. Hal tersebut dapat
diatasi dengan mengurangi jumlah substansi tersebut.
❏ Aktivitas sorbent (fase diam) tinggi yang ditandai dengan zat yang terelusi
hanya sedikit atau naiknya hanya sedikit. Hal ini diatasi dengan pre-
conditioning atau saturasi yaitu penggunaan fase gerak yang telah diasamkan
(ditambahkan ammonia).
❏ Reaksi antara substansi dengan fase diamnya. Terjadi karena salah memilih
lempeng sehingga dapat diatasi dengan pemodifikasian lempeng.
❏ Residu pelarut polar (adanya air dalam fase gerak). Hal ini dapat diatasi dengan
drying untuk menghilangkan residu pelarut polar.
❏ Convex partition/adsorption isotherm. Hal ini dapat diatasi dengan merubah
sistem atau dengan mengurangi jumlah substansi.
❏ Disosiasi asam atau basa lemah. Hal ini dapat diatasi dengan penambahan asam
atau basa ke dalam pelarut atau dengan pembuatan buffer pada layer.
❏ Perubahan kimia pada substansi. Hal ini dapat diatasi dengan modifikasi
lempeng dan pengerjaan dilakukan di suasana yang mendukung (tidak ada
faktor yang menyebabkan reaksi pada substansi).
4. Apa yang dimaksud dengan pre washing dan activation sebelum lempeng KLT
digunakan?. Bagaimana caranya dan apa tujuannya?
Prewashing adalah teknik pencucian yang diperlukan pada KLT untuk
menghilangkan kotoran pada lempeng baik pengotor dari bahan pengikat maupun dari
atmosfer yang teradsorbsi ke dalam lempeng. Hal ini dilakukan agar KLT memiliki
latar belakang yang lebih bersih dan lebih seragam saat diamati secara visual maupun
saat dengan bantuan lampu deteksi, serta dapat meningkatkan rasio sinyal bila KLT
dideteksi dengan KLT scanner atau densitometri. Cara pencucian lempeng dengan
mengelusi lempeng menggunakan methanol, campuran methanol dengan kloroform,
atau dengan eluen yang digunakan. Setelah itu, lempeng dikeringkan dan lempeng siap
digunakan.
Aktivasi lempeng merupakan proses pemanasan lapisan adsorb untuk mengusir
air pada lempeng dan mengkonversinya menjadi keadaan paling aktratif atau retentive.
Aktivasi dilakukan agar kelembapan air yang ada pada lempeng menghilang. Contoh
pengaktivan lempeng : pengeringan lempeng silika gel 30 menit pada 120 ° C, lalu
didinginkan pada suhu ruang baru dikondisikan.

5. Apa saja yang bisa terjadi pada hasil KLT bila chamber tidak jenuh oleh fase gas
dari fase gerak.
Tujuan dari penjenuhan chamber agar seluruh permukaan di dalam chamber/bejana
terisi oleh uap eluen sehingga rambatan yang dihasilkan pun baik dan beraturan. Hal
yang dapat dipengaruhi jika chamber tidak jenuh oleh fase gas dari fase gerak adalah :
● Pemisahan senyawa menjadi tidak baik
● Fase gerak
Chamber harus dijenuhkan untuk menghilangkan uap air atau gas lain karena
uap air atau gas lain akan mengisi fase penjerap yang akan menghalangi laju
fase gerak.
● Proses demixing
Proses demixing yaitu kurang bercampurnya eluen. Efek demixing eluen pada
lempeng KLT dapat mengganggu kromatogram yang dihasilkan. Analit yang
berada berada tepat atau di dekat garis depan eluen α dan β akan membentuk
noda yang jelek (pecah).
● Mempengaruhi nilai Rf
Pada KLT, ketika lempeng KLT dimasukkan dalam chamber kejenuhan sedikit
berubah dan butuh beberapa waktu untuk mengkondisikan kejenuhan baru.
Proses pengembangan diawali dengan meningkatnya aliran molekul eluen
melewati sorben lempeng. Dibagian atas chamber terjadi adsorbsi uap eluen
oleh lempeng KLT kering (bagian lempeng yang tidak terbasahi eluen) sehingga
uap eluen semakin tak jenuh. Terjadi penguapan dari eluen yang ada dalam
lempeng menuju ruangan dalam chamber yang menyebabkan kecepatan alir
eluen berkurang. Analit dengan Rf rendah tidak terpengaruh oleh efek tersebut
tetapi analit dengan Rf mendekati batas depan eluen akan mengalami perubahan
bentuk noda dari bulatan menjadi pita tipis. Eluen yang terdiri dari pelarut
dengan titik didih rendah dan sangat mudah menguap dapat menyebabkan
terjadinya efek tepi dan melengkungnya bentuk garis depan eluen. Hal ini
dikarenakan penguapan tidak hanya terjadi dari atas ke bawah tapi juga dari
samping tepi chamber ke tengah chamber.
Penggunaan chamber jenuh akan memiliki nilai Rf yang berbeda dibanding
chamber tak jenuh. Chamber jenuh memiliki nilai Rf lebih rendah bila
dibandingkan dengan chamber tak jenuh dengan kondisi pengembangan yang
sama. Pada chamber jenuh terdapat dua pengamatan garis depan eluen yaitu
garis depan eluen nyata dan garis depan eluen teramati. Adanya kondensasi uap
eluen menyebabkan munculnya garis depan baru di depan garis depan eluen
nyata yaitu garis depan eluen teramati
 6. Bagaimana pemilihan fase gerak secara try and error dilakukan?
Tahap yang harus dilakukan untuk memilih fase gerak secara try and error:
● larutkan sampel dalam pelarut (setidaknya polar)
● Terapkan beberapa tempat (autosampler)
● totolkan 20μL dari berbagai pelarut ke tengah spot
● mengevaluasi kromatogram sirkuler
coba campuran pelarut (jika fase diam polar maka gunakan fase gerak (campuran
pelarut) yang lebih non polar)

Referensi:
 Hayun. TLC SCANNER KLT DENSITOMETRI. Fakultas Farmasi Universitas
Indonesia.
 Ganjar, IG dan Abdul R. Kimia Farma Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar, 2007:
353-362.
 Wulandari, Lestyo. (2011). Kromatografi Lapis Tipis. Jember: Taman Kampus
Presindo. Diakses pada 27 Maret 2020, dari
http://repository.unej.ac.id/bitstream/handle/123456789/77393/Lestyo%20W_Buku_I
SBN%20978-979-17068-1-
0_Kromatografi%20Lapis%20Tipis_%28Farmasi%29.pdf?sequence=1