Nama : Aliyya Khairunnisa Adzahra

NIM : 1810120220010
Kelas : A2 2018
Mata Kuliah : Analisis Instrumen

High Performance Liquid Chromatography

A. Pengertian HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)/HPLC merupakan bentuk

kromatografi kolom yang memompa campuran sampel atau analit dalam suatu pelarut
(dikenal sebagai fase gerak) pada tekanan tinggi melalui kolom kromatografi dengan
bahan kemasan (fase diam).

B. Jenis - Jenis HPLC

Seringkali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain itu, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau
berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi
2. Kromatografi Fase Terikat
3. Kromatografi Penukar Ion
4. Kromatografi Pasangan Ion
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
6. Kromatografi Afinitas

C. Instrumen HPLC

HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran
partikel penunjang 50 mikrometer, sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan tinggi

Keterangan :

1. Wadah Pelarut 7. Loop Injeksi Sampel

2. Degasser Pelarut 8. Kolom Pengaman
3. Katup Gradien 9. Kolom Analisis
4. Wadah Pencampuran 10. Detektor (misalnya : IR, UV)
5. Pompa Bertekanan Tinggi 11. Pengolahan Data
 6. Katup dalam Posisi Injeksi 12. Wadah Sisa atau Fraksi
6’. Katup Dalam Posisi Load

D. Fasa Gerak dalam Wadah dan Fasa Diam

Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut.
Berbeda dengan kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak,
dibandingkan dengan fasa gerak untuk kromatografi gas. Dalam HPLC, fasa gerak selain
berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detector, fasa gerak dapat
berinteraksi dengan solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu
faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun
labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,
silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan
silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). fasa diam
adalah cairan film yang dilapiskan pada material kemasan yang terdiri dari partikel silica
berpori 3-10 .

Fasa diam mungkin sebagian akan larut dalam fasa gerak. Untuk mencegah
hilangnya fasa diam ini, maka fasa diam diikat secara kovalen pada partikel silica. Ikatan fasa
diam diperoleh dengan mereaksikan partikel silica dengan organochlorosilane dengan bentuk
Si(CH3)2RCl dimana R adalah alkil atau alkil yang tersubstitusi.

E. Pompa dalam HLPC

Pompa yang digunakan dalam HPLC haruslah pompa bertekanan tinggi agar dapat
mendorong fase gerak dalam reservoir menuju kolom fase diam dan melewati detektor.
Tekanan yang digunakan beragam tergantung dari dimensi kolom, ukuran partikel fase diam,
serta laju alir dan komposisi dari fase gerak yang akan dipakai. Pompa dalam HLPC memiliki
tipe kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement).
Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu:

1. Pompa reciprocating.
2. Pompa syringe

F. Teknik Pemasukan Sampel

Sampel dimasukkan dengan cara disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari
tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)
internal atau eksternal.
Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel

G. Injektor

Injektor merupakan tempat masuknya sampel ke dalam sistem HPLC. Proses injeksi
dapat dilakukan secara manual dengan syringe atau dengan menggunakan sistem injeksi
otomatis. Injektor pada HPLC harus dapat menampung sampel cairan dalam kisaran volume
0.1-100 mL.

H. Detektor

Detektor berfungsi untuk mendeteksi keberadaan komponen yang telah melewati

kolom dan memberikan sinyal elektronik pada pengolah data. Terdapat beberapa jenis
detektor HPLC tergantung dari karakteristik yang hendak dibaca. Misalnya pada detektor
jenis UV-vis, maka karakteristik yang dibaca oleh detektor adalah absorbansinya. Detektor
jenis lain yang bisa digunakan adalah detektor indeks bias, fluoresensi, serta detektor
elektrokimia.

I. Kelebihan dan Kekurangan HPLC

Kelebihan :

1. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya

pemisah yang tinggi.
2. Dapat menghindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
3. Dapat menggunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
4. Waktu analisa cukup singkat.
5. HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat
yang tidak stabil.
6. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Kekurangan :

1. Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.

2. Sering ada larutan standar yang tertinggal di injektor.
3. Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan
3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus
seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.