Pert.

3: Produksi Protein Rekombinan

Produksi Protein pada Host Prokariotik
➢Regulasi transkripsi
➢Meningkatkan efisiensi terjemahan
➢ Meningkatkan stabilitas protein
➢Meningkatkan sekresi protein
➢ Memfasilitasi pemurnian protein
➢ Integrasi DNA ke dalam kromosom inang

•Produksi Protein pada inang eukariotik

➢ Modifikasi eukariotik pasca-translasionalprotein
➢ Sistem ekspresi eukariotik (fitur umum,ragi, sel serangga baculovirus, sel mamalia)

•Rekayasa Protein
➢ Mutagenesis yang diarahkan
➢ Mutagenesis acak
➢ Contoh rekayasa protein
Tabel 3.1 Untuk banyak aplikasi bioteknologi, tujuan utamanya adalah menghasilkantingkat
tinggi protein dari gen kloning yang diekspresikan dalam organisme inang. Setiap tuan
rumahorganisme, memiliki kelebihan dan kekurangan spesifik.

Produksi Protein pada Host Prokariotik

Meningkatkan Stabilitas Protein

1. Dengan memfasilitasi pelipatan protein (misalnya, suhu rendah ataubersama dengan gen
yang mengkode protein yang berfungsi dalamlipatan protein yang tepat seperti chaperone)
2. Dengan mengurangi degradasi protein (misalnya, tambahkan amino spesifikasam ke
terminal-N untuk mengurangi pencernaan protease ataumengekspresikan protein sebagai
protein fusi)
Meningkatkan Sekresi Protein
Sekresi ke dalam periplasma dengan menambahkanurutan peptida sinyal bakteri
untukterminal-N umumnya memungkinkanpemurnian protein lebih mudah dan
dikurangidegradasi protein karena jumlahnya lebih sedikitprotein dan protease
dalamlingkungan ekstraseluler.
Gambar 3.10 Sekresi protein dalambakteri. (A) Jalur sekresi diBakteri gram negatif seperti E.
coli .B. Sekresi protein dalam Gram-positifbakteri seperti Lactococcus lactis .
Gambar 3.15 Situs pembelahan proteolitik dapat dengan rekayasa genetika menjadi
fusiprotein untuk memfasilitasi pelepasan protein target dari setiap tag afinitas. Pembekuan
darahfaktor XSebuahadalah salah satu protease tersebut. Instansi pemerintah yang mengatur
farmasiprotein membutuhkan protein yang bebas dari label afinitas.
Gambar 3.18 Integrasi DNA ke dalam kromosom inang. Gen hasil kloning bisadiintegrasikan
ke dalam situs kromosom bakteri untuk mengurangi beban metabolismedikenakan pada
bakteri oleh vektor plasmid.

Produksi Protein dalam Hosti Eukariotik

• Tidak seperti prokariota, eukariota melaksanakan sejumlah modifikasi posttranslasional
(PTMs) protein, yaitu sering penting untuk fungsi protein yang tepat.
• PTM ini meliputi:
• Glikosilasi
• Pemrosesan propeptida
• Fosforilasi
• Asetilasi
• Metilasi
• Hidroksilasi
• Sulfasi
• Asilasi
• -Karboksilasi
• Myristoylation (C14 penambahan asam lemak)
• Palmitoylasi (C 16 penambahan asam lemak)
• Pembentukan ikatan disulfida

Gambar 3.25 Vektor ekspresi eukariotik umum.p = promotor eukariotik; MCS = beberapa
situs kloning; t = transkripsi eukariotikurutan pemutusan; ESM = penanda dipilih eukariotik;
ori euk = asal eukariotikatau replikasi; ori E = E.coli asal replikasi; Gen Amp r = penanda
yang dipilih E. Coli
Gambar 3.40 Sistem Ekspresi Sel Mammalian.Vektor ekspresi mamalia umum.P = promotor
eukariotik; I = intron (yang meningkatkan produksi protein); MCS = bergandasitus kloning;
SMG = gen penanda dipilih eukariotik; pa = penambahan polyadenylationurutan; TT =
terminasi eukariotik dari urutan transkripsi.
Gambar 3.41 Elemen kontrol translasi untuk produksi protein eukariotik,sekresi, dan
pemurnian.K = Urutan Kozak [GCCGCC (A atau G) CC AUG G] ; S = urutan peptida
sinyal;T = tag afinitas protein; P = situs pembelahan proteolitik; SC = stop codon
Gambar 3.47 Rekayasa protein untukmeningkatkan atau meningkatkan fungsi proteindapat
dilakukan dengan mutagenesis terarah(seperti yang ditunjukkan di sini) atau secara
acakmutagenesis.

Pert. 4: Hewan Transgenik

Hewan Transgenik
• tikus transgenik:metodologi
• tikus transgenik: aplikasi
• Ternak transgenik
• Unggas transgenik
• Ikan transgenik

Membangun tikus transgenikoleh microinjection DNA

• Metode yang paling umum digunakan
• Hanya 5% atau kurang dari yang dirawattelur menjadi keturunan transgenik
• Perlu memeriksa anak-anak tikusDNA (oleh PCR atau Selatan), RNA(oleh northerns atau
RT-PCR), danprotein (oleh barat atau oleh beberapametode pengujian khusus)
• Ekspresi akan bervariasi dalamketurunan transgenik: karenaefek posisi dan nomor salin

Gambar 12.1Membanguntikus transgenik olehMikroinjeksi DNA.Perhatikan bahwa hanya

5% ataukurang daridisuntik secara mikrotelur menjadiketurunan transgenik.
Gambar 12.3 Pembentukantikus transgenik denganvektor retroviral.
Gambar 12.6Membangun transgeniktikus dengan genetikembrio direkayasasel induk.

Transgenik hewan-batang embyronic Direkayasametode sel (digunakan untuk KO gen)

Langkah 1: Dapatkan sel ES
Langkah 2: Secara genetik merekayasa sel-sel ES
Transgenik Hewan: Menggunakan yang CRE lox Prekombinasi sistem untuk jaringan atau
spesifik waktu KO gen
Tikus Transgenik: Aplikasi
• Model tikus transgenik untuk penyakit Alzheimer, amyotrophicsclerosis lateral, penyakit
Huntington, radang sendi, distrofi otot,tumorigenesis, hipertensi, gangguan
neurodegeneratif,disfungsi endokrinologis, penyakit koroner, dll.
• Menggunakan tikus transgenik sebagai sistem uji (misalnya, menggunakan RNAi untuk
mengurangikadar protein [amiloid β peptida] yang berkontribusi terhadap
Alzheimerpenyakit, mengoreksi mutasi penyebab penyakit di distrofingen menggunakan
CRISPR-Cas9, perlindungan terhadap infeksi, sepertivirus pseudorabies, dengan
mengekspresikan protein reseptor virus yang larut)
• Pengaturan bersyarat ekspresi gen (diinduksi tetrasiklinsistem)
• Kontrol kondisional kematian sel (digunakan untuk memodelkan dan mempelajari
organkegagalan; melibatkan rekayasa organ khusus dari reseptor toksinke dalam tikus dan
kemudian penambahan racun untuk membunuh organ itu)

Alih-alih meningkatkan waktu dengansepersekian detik, ituditingkatkan secara genetikTikus

"maraton" (di atas, padatreadmill di San Diego)berlari dua kali lebih jauh dan hampirdua kali
lebih lama dari biasanyatikus. Peroxisomeproliferator diaktifkangen reseptor (PPAR-
delta)diekspresikan berlebihan dalam hal initikus transgenik. Untuk detail,Lihat

Ternak Transgenik
• Mengkloning ternak dengan sel somatiktransfer nuklir
• Farmasi
• Organ donor
• Ternak tahan penyakit
• Kualitas susu
• Sifat produksi hewan
• Unggas transgenik
• Ikan transgenik

Gambar 12.29Kloning ternak olehnuklir sel somatiktransfer seperti yang digambarkandi sini
dengan domba. Itudomba kloning pertamadiproduksi di1996 dan diberi nama"Boneka".

Ternak transgenik, domba,kambing, dan babi

• Menggunakan kelenjar sususebagai bioreaktor (lihatangka yang berdekatan)
• Meningkatkan konten casein disusu
• Ekspresikan laktase dalam susu (kehapus laktosa)
• Ketahanan terhadap bakteri,virus, dan parasitpenyakit
• Kurangi fosfor pengeluaran

Protein eksogen diekspresikan dalam kelenjar susu binatang transgenik

• Erythropoietin
• Faktor IX
• Faktor VIII
• Fibrinogen
• Hormon pertumbuhan
• Hemoglobin
• Insulin
• Antibodi monoklonal
• Aktivator plasminogen jaringan (TPA)
• α1-antitrypsin• Antitrombin (ATyrn) - mencegah pembekuan; 1 st disetujuiobat rekombinan
yang diproduksi pada hewan (kambing);disetujui oleh FDA pada tahun 2009

Gambar 12.30 Bangun untuk ekspresi antitrombin manusia pada kambingsusu yang
mengarah ke produksi obat rekombinan pertamadiproduksi pada hewan dan disetujui oleh
FDA pada tahun 2009.

“Enviropigs”
• Babi transgenik yang mengekspresikangen phytase dalam saliva merekakelenjar
• Gen phytase diperkenalkanmelalui microinjection dan penggunaan DNAprotein sekresi
parotispromotor untuk secara khusus mengemudiekspresi di kelenjar ludah
• Phytate adalah yang utamabentuk penyimpanan fosfor dipakan ternak nabati
(misalnya,makanan dari kacang kedelai)
• Babi dan unggas tidak bisa dicernafitat dan dengan demikian mengeluarkan besarjumlah
fosfor
• “Enviro-babi” mengeluarkan 75% lebih sedikitfosfor
Ikan Transgenik
• Gen dimasukkan ke dalam sel telur yang dibuahi oleh Mikro injeksi atau elektroporasi
DNA• Tidak perlu menanamkan embrio;pengembangan bersifat eksternal
• Direkayasa secara genetik untuk lebih cepatpertumbuhan menggunakan gen hormon
pertumbuhan(salmon, trout, lele, tuna, dll.)
• Direkayasa secara genetik untuk penyakit yang lebih besarperlawanan• Direkayasa secara
genetis untuk berfungsi sebagai abiosensor untuk polusi air

Dari mana asal ikan zebra fluorescent GloFish®?Ikan GloFish® fluorescent zebra awalnya
dibiakkan untuk membantu mendeteksipolutan lingkungan. Dengan menambahkan gen
fluoresensi alami keikan, para ilmuwan berharap suatu hari dengan cepat dan mudah
menentukan kapan kitasaluran air terkontaminasi. Langkah pertama dalam mengembangkan
iniikan yang mendeteksi polusi adalah menciptakan ikan yang akan menjadi neon
semuawaktu. Baru-baru ini para ilmuwan menyadari hal ituminat berbagi manfaat dari
penelitian ini. Kami menyebutnya iniIkan neon GloFish®.

Salmon transgenik yang mengekspresikan GH secara berlebihan

• Gambar ini menunjukkan masing-masingpertumbuhan salmon transgenik dan anon-GM
pada usia yang sama(Kredit: Aqua Bounty).
• FDA menyetujui GM inisalmon di November 2015
Tetapi mengapa ikan RG ini tumbuh begitu cepat? Salmon transgenik ini tumbuh sangat
cepat karena perubahan yang dilakukan terhadap salah satu dari yang kurang-lebih40.000 gen
dalam DNA mereka. Pada salmon normal, gen yang mengontrol produksihormon
pertumbuhan (GH) diaktifkan oleh cahaya, sehingga ikan umumnya hanya tumbuh
selamabulan-bulan musim panas yang cerah. Tetapi dengan melampirkan "urutan promotor"
konstitutif, AquaBounty berakhir dengan salmon yang membuat hormon pertumbuhan
sepanjang tahun.Konstruksi gen: promotor AFP Ocean Pout - salmon GH cDNA - gen AFP
Ocean 3 PoutCatatan AFP = protein antibeku

Salmon AquaBounty yang direkayasa secara genetika yang ditampilkan di sini berukuran
sekitar dua kali lipatkerabat liar, meskipun keduanya kira-kira seusia. Salmon ini disetujui
oleh ASFDA pada November 2015 dan oleh otoritas Kanada pada Mei 2016. Salmon
sekarangdijual di Kanada, tetapi tidak di AS karena pertempuran politik, termasuk ketentuan
di ASundang-undang anggaran pemerintah untuk 2017 untuk memberi label salmon rekayasa
genetika ini.Pembaruan Salmon Transgenik: Agustus 2017

Gambar 12.42 Bangun untuk ekspresi berlebih hormon pertumbuhan di Atlantiksalmon

menggunakan cDNA hormon pertumbuhan salmon Chinook di bawah kendalisinyal
promotor dan terminator-poligenisilasi darigen protein antibeku (AFP) dari ikan lain, cibiran
lautan.
Gambar 12.43 Ikan medaka transgenik sebagai biosensor pencemar lingkungan.Promotor gen
vitellogenin digunakan untuk mendorong ekspresi reporter GFPgen pada ikan medaka.
Perhatikan bahwa promotor vitellogenin diaktifkan hanya dalamadanya senyawa estrogenik
alami dan sintetis.
Gambar 12.41Transgenikayamdirekayasa denganRNA kecilmolekul itumenghambat RNA-
RNA tergantungpolimerasedibutuhkan untukproduksiunggas baruvirus influenza.