DNA Rekombinan

Epi Supri Wardi, M.Si

Sekolah Tinggi Farmasi Indonesia (STIFI)

Perintis Padang
PENGERTIAN

DNA rekombinan
teknologi

Rekombinasi in vitro
Rekayasa genetika
Operasi genetik
PENGERTIAN

Pakaian prosedur yang

digunakan untuk menggabungkan
bagian-bagian DNA pada kondisi tertentu.
PRINSIP DASAR

Teknologi DNA rekombinan merupakan salah satu

kemajuan terkini dalam bidang bioteknologi yang
dikembangkan oleh dua ilmuwan bernama Boyer dan
Cohen pada tahun 1973.
DNA REKOMBINAN

• Rekombinasi sering diartikan sebagai pengaturan

kembali komposisi molekul DNA.

• Dalam bentuk nyatanya rekombinasi adalah sebuah proses

yang berakibat sebuah segmen DNA terputus dari segmen
DNA yang biasanya menjadi lanjutannya, dan bersambung
dengan segmen DNA yang lainnya. Sebagai hasil
DNA REKOMBINAN

• akhirnya adalah urutan dan urutan nukleotida

menjadi berubah.

• Lain dengan mutasi, rekombinasi dapat menyebabkan

perubahan urutan nukleotida DNA yang signifikan dan
termasuk lokus yang panjang

• Hal ini terjadi karena dengan rekombinasi perubahan

urutan nukleotida di dalam genome dapat berubah
secara drastis dan dalam jumlah yang besar.
PRINSIP DASAR

• DNA dimasukkan ke dalam molekul DNA lain

yang disebut 'vektor'

• Vektor rekombinan kemudian dimasukkan ke

dalam sel inang dimana ia mereplikasi dirinya
sendiri, gen tersebut kemudian diproduksi
PRINSIP DASAR
KOMPONEN DASAR

Enzim

Vektor

Tuan rumah
ENZIM
1. PEMBATASAN ENZIM

mengenali dan membelah urutan DNA

tertentu (enzim restriksi Tipe II)
ENZIM
1. PEMBATASAN ENZIM
ENZIM
1. PEMBATASAN ENZIM

• Tata nama
- EcoRI
• E = Escherichia nama genus

• co = coli nama spesies

• R = regangan RY12 regangan atau serotipe

• I = angka romawi satu = enzim pertama

- HinDIII
• Enzim serotipe d Haemophilus influenza 3
ENZIM
1. PEMBATASAN ENZIM
ENZIM
2. ENZIM LIGASI

• T4 DNA Ligase
- memperbaiki torehan pada untaian DNA

(mereformasi ikatan fosfodiester)

- menggunakan energi dari ATP

- bekerja pada ujung yang tumpul atau lengket

• Enzim lain yang digunakan dalam teknologi rDNA

ENZIM
2. ENZIM LIGASI
VEKTOR

- Molekul asam nukleat yang mengantarkan gen ke dalam sel

- Properti yang berguna

• Cukup kecil untuk dimanipulasi di lab

• Bertahan hidup di dalam sel

• Berisi penanda genetik yang dapat dikenali

• Pastikan ekspresi genetik gen

- Termasuk genom virus, transposon, dan plasmid

VEKTOR

• DNA rekombinan perlu direplikasi dalam sel

bakteri
• Sepotong DNA yang menggandakan diri

- disebut kendaraan kloning

- bisa berupa plasmid atau fag
VEKTOR

• Sepotong kecil DNA melingkar

• Ada terpisah dari kromosom
• Berasal dari plasmid alami

• Jumlah salinan tinggi = 10-100 salinan / sel

• Nomor salinan rendah = 1-4 salinan / sel
VEKTOR

• Berasal dari plasmid alami

• Fitur yang diubah
- ukuran kecil (pengangkatan DNA non-esensial)
• efisiensi transformasi yang lebih tinggi

- situs enzim restriksi unik

- satu atau lebih penanda yang dapat dipilih

- asal replikasi (dipertahankan dari plasmid asli)

- fitur lain: promotor, dll.
VEKTOR

pBR322
gaya lama
umum
tujuan
plasmid
VEKTOR
VEKTOR
TUAN RUMAH

• rDNA yang dibuat di lab harus dimasukkan ke

dalam sel "inang"
• Sel harus dapat mengambil DNA - " KOMPETEN
”
• Bakteri yang tumbuh akan menghasilkan banyak salinan DNA
TUAN RUMAH
TRANSFORMASI

• Dua metode dasar untuk menghasilkan bakteri yang kompeten

(mampu mengambil DNA tambahan)

- Kompeten kimia
- Elektroporasi
TUAN RUMAH
TRANSFORMASI

• Kompeten kimia
- Ion logam divalen Ca ++, diperlukan
- obati sel dengan CaCl dingin 2 solusi
- Ion Ca ++ mengubah membran sehingga permeabel terhadap DNA
TUAN RUMAH
TRANSFORMASI

• Elektroporasi
- Campuran sel / DNA diberi kejutan listrik tegangan tinggi

- 2.5kvolts, ~ 5msec
- berguna untuk transformasi efisiensi tinggi
- 10 9 transforman / µg DNA
DNA REKOMBINAN

1) Enzimatis
pencernaan
DNA REKOMBINAN

2) Ligasi
Target dan
vektor
DNA Ligase
DNA REKOMBINAN

3) Transformasi
DNA yang diligasi

menjadi Bakteri
APLIKASI DNA REKOMBINAN
PRODUKSI INSULIN
1) Memperoleh gen insulin manusia
Gen insulin manusia dapat diperoleh dengan membuat salinan DNA
pelengkap (cDNA) dari messenger RNA (mRNA) untuk insulin manusia.
APLIKASI DNA REKOMBINAN
PRODUKSI INSULIN
2) Menggabungkan gen insulin manusia menjadi vektor plasmid

• Plasmid bakteri dan cDNA bercampur. Gen insulin manusia (cDNA) dimasukkan ke dalam plasmid melalui
pasangan basa komplementer di ujung yang lengket.
APLIKASI DNA REKOMBINAN
PRODUKSI INSULIN

3) Memperkenalkan plasmid DNA rekombinan ke dalam bakteri

Bakteri E.coli digunakan sebagai sel inang. Jika E. coli dan plasmid rekombinan dicampur
bersama dalam tabung reaksi.
APLIKASI DNA REKOMBINAN
PRODUKSI INSULIN

4) Memilih bakteri yang telah mengambil bagian DNA yang benar

Bakteri disebarkan ke nutrient agar. Agar-agar juga mengandung zat seperti antibiotik yang
memungkinkan pertumbuhan hanya bakteri yang ditransformasi.