Abstrak :

Sementara keluarga p6 ribosom S6 kinase (RSK) telah terlibat dalam beberapa fungsi sel
tumor, pemahaman penuh tentang keluarga kinase ini telah dibatasi oleh kurangnya
penghambat yang sangat selektif. Pirazol bis-fenol diidentifikasi dari skrining throughput
tinggi sebagai penghambat N-terminal kinase RSK2. Perancangan obat berbasis struktur
menggunakan kristalografi, analisis konformasi, dan perancah morphing menghasilkan
inhibitor piridin difluorofenol yang sangat optimal pada keluarga kinase RSK seperti yang
ditunjukkan secara seluler oleh penghambatan fosforilasi YB1. Senyawa ini menyediakan
alat in vitro untuk pertama kalinya dengan selektivitas dan potensi profil yang lebih baik
untuk memeriksa pentingnya pensinyalan RSK pada sel kanker dan untuk mengevaluasi RSK
sepenuhnya sebagai target terapeutik.

Pendahuluan :

P90 ribosomal S6 kinase (RSK) adalah keluarga dengan empat serin / treonin kinase
yang diekspresikan secara luas di seluruh jaringan dan dideskripsikan untuk memfosforilasi
sejumlah protein yang terkait dengan fungsi yang beragam seperti proliferasi, apoptosis,
motilitas, transkripsi, dan EMT (transisi epitelial mesenkhimik ) .1-9 RSK kinase memiliki
struktur yang tidak biasa dimana kinase N-terminal yang bertanggung jawab atas fosforilasi
substrat yang digambarkan RSK disatukan dengan kinase C-terminal yang tampaknya
didedikasikan untuk mengaktifkan kinase RSK N-terminal. Pemahaman skema aktivasi saat
ini menunjukkan bahwa ERK (MAPK) memfosforilasi dan mengaktifkan kinase C-terminal,
yang kemudian menciptakan situs docking berlobot untuk PDK1 untuk mengikat dan
mengaktifkan kinase N-terminal. Skema aktivasi ini telah diterima sebagai kanonik, namun
kejadian fosforilasi pengaktifan tambahan telah dijelaskan dan dapat mentransfer kontrol
aktivitas RSK yang ketat dari jalur pensinyalan MAP kinase ke jalur sinyal lainnya.

Meskipun RSK tidak diragukan lagi memfosforilasi substrat yang dijelaskan pada
garis sel model, tidak jelas yang mana dari substrat ini dan di mana konteks pensinyalan
fosforilasi RSK sangat penting untuk fungsi substrat. Komplikasi pemahaman kita tentang
fosforilasi substrat RSK dalam konteks mutasi kanker yang berbeda adalah peringatan alat
yang ada untuk menghambat isoform RSK. Keempat isoform RSK terkait erat, diekspresikan
secara luas, dan kemungkinan setidaknya sedikit berlebihan dalam fosforilasi substratnya.
Dengan demikian, efek fungsional yang kuat dengan si / shRNA tradisional yang
menargetkan isoform tunggal dicurigai.
 Penghambat kimia isoform RSK juga mengalami kekurangan, karena hanya
menargetkan subset isoform atau karena menghambat penambahan kinase selain
RSK.10-12 Sebagai contoh, BI-D187013 berpotensi menghambat kinase lain seperti
PLK1, yang mana Membatasi kegunaannya dalam mengidentifikasi garis sel yang
sensitif terhadap RSK. Selanjutnya, sebuah publikasi baru-baru ini menunjukkan
bahwa sebagian besar efek pemberian sinyal sel yang dikaitkan dengan BI-D1870
disebabkan oleh efek nonspesifik.14 RK inhibitor RSK inhibitor C-terminal kinase
yang tidak dapat diperbaiki, 15 bagaimanapun, sangat selektif namun bukan
penghambat pan-RSK Karena RSK3 kekurangan rantai samping sistein yang
ditemukan di RSK1, 2, dan 4 yang diperlukan untuk membentuk selokan kovalen
dengan FMK. Karena tidak menghambat isoform RSK3, ada kekhawatiran bahwa
aktivitas RSK3 dapat menyelamatkan kejadian fosforilasi dan fungsi yang dibagi di
antara empat isoform RSK3. Sementara FMK berpotensi menghambat fosforilasi
substratnya YB1, gagal mencapai penghambatan penuh, menunjukkan bahwa
aktivitas residualnya disebabkan oleh RSK3.15 Untuk mengatasi keterbatasan ini,
senyawa alat in vitro yang lebih baik dengan potensi yang baik pada keempat isoform
RSK dan diperbaiki. Selektivitas memang diinginkan.

Dalam upaya untuk mengidentifikasi titik awal kimia baru untuk mengidentifikasi
molekul alat yang lebih baik, sebuah layar throughput yang tinggi (HTS) dilakukan, yang
menghasilkan berbagai perancah termasuk bis-phenolpyrazole (1, Gambar 1) sebagai
domain kinase N-terminal Penghambat RSK2 Senyawa 1 merupakan pukulan yang menarik
karena efisiensi ligannya yang tinggi (0,54) dan selektivitas yang sangat baik terhadap panel
dengan 69 kinase. Fitur-fitur ini menyarankan bahwa ini akan menjadi titik awal yang baik
untuk meningkatkan potensi sambil mempertahankan selektivitas. Meskipun fenol fenol
akan menjadi perhatian dalam upaya penekanan obat kimia khas karena mereka biasanya
menunjukkan stabilitas metabolik yang buruk yang berarti separuh usia in vivo yang buruk,
tujuan dari upaya ini adalah untuk mengembangkan senyawa alat in vitro yang berkurang.
Keprihatinan ini Karena saya adalah hit tunggal di dek screening kami, kami mulai dengan
memverifikasi integritas kimia dari hit tersebut dengan mensintesis beberapa analog jarak
dekat. Senyawa ini menunjukkan potensi biokimia yang serupa dan membantu
mengkonfirmasikan 1 sebagai titik awal yang sangat baik untuk pengembangan senyawa
perkakas untuk membantu penyelidikan biologi RSK dalam setting onkologis. Selama proses
kerja ini, rangkaian pirazol berubah menjadi seri piridil 3,4 biaril yang ditunjukkan dengan 2
(Gambar 2).
KIMIA

Analog pirazol disintesis oleh kopling Suzuki-Miyaura17 dari 3 dan 4 diikuti oleh brominasi
karbon C4 pirazola dengan NBS (Skema 1). Kopling Suzuki-Miyaura kedua memberikan
analog yang diinginkan (1, 26-29). Untuk reaksi Suzuki-Miyaura yang kedua, PdCl2 (dppf) ·
DCM bukanlah katalis yang efisien untuk sistem ini, dan bis (di-tert-butylphosphino)
ferrocene dikloropalladium (II) [PdCl2 (dtbpf)] ditemukan secara konsisten berhasil
Transformasi ini

Seri piridin disintesis dengan salah satu dari dua cara (Skema 2). Pada rute pertama (Skema
2, rute 1), dua kopling Suzuki-Miyaura berturut-turut menghasilkan sebagian besar analog
piridin yang diinginkan (30-49). Bergantung pada ketersediaan bahan awal, beberapa
senyawa disintesis melalui rute alternatif (Skema 2, rute 2) di mana urutan kopling Suzuki-
Miyaura dibalik dimulai dengan asam boron aril (atau heteroaril) (7) dan 3- Chloro-4-
bromopyridine (8).

Skema umum untuk sintesis analog 2-aminopiridin digambarkan dalam Skema 3. Untuk
piridin amin tersubstitusi alifatik (Skema 3, rute 1), sintesis dimulai dengan 2-fluoro-4-
bromopyridine (11) yang mengalami reaksi Suzuki, diikuti oleh SNAr dengan amina dan
brominasi yang sesuai untuk memberikan zat antara (13). Senyawa (13) kemudian
direaksikan dengan ester boronik (14a atau 14b) untuk menghasilkan senyawa akhir (51-52).
Untuk 50, fenol dilindungi dengan gugus metil, namun umumnya, reaksi Suzuki akan
dilanjutkan tanpa perlindungan fenol. Untuk piridin tersubstitusi amino aromatik (Skema 3,
rute 2), senyawa disintesis dengan melakukan kopling Suzuki 2-kloro-4- (4,4,5,5-tetrametil-
1,3,2-dioksaborolan- 2-yl) - piridin (16) dengan aril bromida (17) diikuti oleh reaksi Buchwald
untuk memberikan zat antara (18). Setelah brominasi dan kopling Suzuki terakhir, 53
diproduksi.

Menunjukkan dua metode untuk sintesis seri 2-aminoprimidin. Sintesis 56 dan 57 dicapai
dimulai dengan 2,4-dichloropyrimidine (19). Reaksi Suzuki diikuti oleh SNAr dan brominasi
untuk menghasilkan intermediate 21 dan kopling Suzuki terakhir memberikan produk yang
diinginkan (Skema 4, rute 1). Dalam rangkaian aminopiridinid, reaksi SNAr berjalan dengan
lancar, yang memungkinkan kita menghindari reaksi Buchwald. Namun, reaksi Buchwald
diperlukan untuk memasang amina dalam rangkaian aminopiridin.

Sintesis 54 (Skema 4, rute 2) dimulai dengan 4- chloropyrimidin-2-amine (22), sehingga

menghilangkan reaksi SNAr. Senyawa 22 dirombak dan kemudian digabungkan dengan 14a
untuk memberi 23. Reaksi Suzuki pertama yang memberi 23 bergerak selektif pada posisi
ke-5, dan reaksi Suzuki kedua berlanjut pada posisi ke 4 untuk memberi 54
■ HASIL DAN PEMBAHASAN

Struktur Kristal RSK2 dengan Senyawa 1. Struktur kokana senyawa 1 dalam kompleks
dengan domain kinase Nterminal RSK2 (Gambar 3) bertekad untuk memperoleh wawasan
struktural ke dalam farmakope utama dan untuk memandu kegiatan desain kimia kami.
Senyawa 1 mengikat di saku ATP dalam bentuk nonplanar, konformasi berbentuk baling-
baling dengan satu fenol diproyeksikan ke gatekeeper Leu147 dan fenol kedua yang
diproyeksikan di bawah loop-P. Pirazola membuat dua ikatan hidrogen di engsel dengan
oksigen karbonil dari Asp148 dan amida Leu150. Senyawa ini terikat pada konformasi inaktif
kinase yang sebagian mirip dengan konformasi tipe II, "DFG-out" yang terlihat dengan
senyawa seperti Gleevec yang terikat pada Abl.18,19 Phe212 motif DFG yang dibalik seperti
pada Diamati dalam struktur biaya tipe II klasik; Namun, berbeda dengan Abl yang terikat
pada Gleevec, rantai samping Asp211 menutupi akses ke kantong hidrofobik yang biasanya
dibuat oleh perpindahan rantai samping fenilalanin. Rantai sisi Asp211 membentuk ikatan
hidrogen ke salah satu fenol dalam 1 sambil membuat jembatan garam ke lisin katalitik,
Lys100.