(A) Salah satu cara untuk meningkatkan kepadatan sel adalah dengan

meningkatkan luas permukaan yang sel dapat melampirkan;

ini adalah pandangan dari ujung botol dilapisi dengan
kumparan plastik spiral. botol diputar perlahan-lahan, pada
sekitar 5 rev / h, sehingga volume kecil cairan budaya
dapat digunakan. Sel mentolerir berada di luar budaya
cairan untuk periode singkat. . (B, c) Sel yang tumbuh di
manik-manik microcarrier. (B) mikrograf Scanning electron
sel ginjal babi. (Courtesy of G. Charlier.)
(C) Penghapusan sel dari manik microcarrier oleh
inkubasi dengan tripsin. Sel-sel yang mengumpulkan
dan sudah banyak yang terpisah. Setiap manik adalah tentang
200 m diameter.
The microcarriers ditampilkan adalah
Cytodex (Pharmacia Ltd) (direproduksi dengan izin).
Tingkat medium kultur
Sel-sel tumbuh pada panjang
dari sisipan plastik heliks
rotasi lambat

BAB 2 BEBERAPA METODE UNTUK MEMPELAJARI HEWAN VIRUS 25

antibodi
virus A
tes untuk
infektivitas di:
hewan atau
budaya organ atau
kultur sel
tidak
terinfeksi
terinfeksi
hewan atau
budaya organ atau
kultur sel
antibodi
virus A
AA
BB
+
+

Gambar. 2.6 Tes netralisasi. Virus A kehilangan infektivitas setelah menggabungkan dengan A-
antibodi spesifik (itu dinetralkan). A-antibodi spesifik tidak mengikat virus B, sehingga infektivitas
virus B tidak terpengaruh. Tes lengkap membutuhkan reaksi timbal balik.

Gambar. 2,7 Hemagglutination titrasi. Berikut virus influenza serial diencerkan dari kiri ke kanan
dalam sumur di piring plastik. Sel darah merah (sel darah merah) kemudian ditambahkan ke 0,5% v /
v dan dicampur dengan masing-masing pengenceran virus. Di mana ada sedikit atau tidak ada virus,
sel darah merah mengendap tombol (dari 1/128) tidak dapat dibedakan dari sel darah merah yang
tidak ada virus ditambahkan (baris 3). Di mana virus yang cukup hadir (sampai 1/64), sel-sel
menggumpalkan dan menetap dalam pola difus. (Foto oleh Andy Carver.)

Gambar. 2.8 Pada uji hemaglutinasi-hambatan, antibodi diencerkan dari kiri ke kanan. Empat unit
hemaglutinasi (Haus) dari virus influenza ditambahkan ke masing-masing dengan baik. Reaksi
antibodi virus masuk ke selesai dalam 1 jam pada 20 ° C. Sel-sel darah merah kemudian ditambahkan
untuk mendeteksi virus yang tidak terikat antibodi. Dalam tes ini, hemaglutinasi dihambat hingga
pengenceran antibodi 1/3200. (Foto oleh Andy Carver.)

Antibodi juga dapat digunakan untuk mendeteksi antigen virus di dalam sel yang terinfeksi. Ketika
sel hidup, antibodi tidak dapat melintasi membran plasma dan karena itu akan bereaksi hanya
dengan antigen terpapar pada permukaan sel. penghalang permeabilitas ini dihancurkan oleh
"memperbaiki" sel dalam pelarut organik seperti aseton atau metanol, yang permeabilized membran
plasma dan memungkinkan antibodi untuk memasuki sitoplasma dan nukleus dan melampirkan
antigen.

Antibodi yang "ditandai" sebelum digunakan dengan zat penanda dan karenanya dapat dideteksi in
situ. Tag seperti pewarna fluorescent dapat dideteksi secara mikroskopis ketika diterangi dengan
ultraviolet (UV) cahaya (Gambar 2.9.); enzim (misalnya peroksidase, fosfatase) yang meninggalkan
deposit berwarna pada reaksi dengan substrat dapat dilihat dengan mikroskop cahaya; zat radioaktif
dapat dideteksi oleh pengendapan butir perak dari emulsi fotografi; dan molekul elektron-padat
(misalnya partikel koloid emas atau feritin, protein yang mengandung besi) dapat divisualisasikan
dengan mikroskop elektron.

Antibodi kovalen terkait dengan enzim penanda sekarang umum digunakan dalam tes kuantitatif
disebut enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) (Gambar. 2.10). Dalam contoh yang ditunjukkan,
panel antibodi yang digunakan untuk mengidentifikasi virus yang tidak dikenal yang menempel pada
permukaan plastik dengan baik. Berikut dua antibodi yang digunakan: antibodi primer spesifik untuk
virus dan unlabelled; antibodi sekunder spesifik untuk epitop dilestarikan pada antibodi primer dan
kovalen terkait dengan enzim. Hal ini membuat ELISA lebih sensitif karena beberapa molekul
antibodi sekunder (dan enzim yang terkait) dapat mengikat satu molekul antibodi primer. Produk
berwarna yang dihasilkan dari reaksi enzim dengan substrat ditambahkan sebanding dengan jumlah
antibodi primer terikat dan dapat diukur secara spektrofotometri. ELISA memiliki keuntungan bahwa
mereka dengan mudah dapat otomatis untuk menangani num besar

26 BAGIAN I APAKAH VIRUS?

Gambar. 2,9 pewarnaan antibodi Fluorescent. Antibodi kovalen terikat dengan pewarna
fluorescent telah digunakan untuk mendeteksi antigen hadir terutama dalam inti (panah) dari
sel yang terinfeksi virus influenza.
yang tidak diketahui
virus terpasang
ke permukaan
mikrotiter dengan baik
Antibodi diketahui
spesifisitas adalah terikat
dan sisanya
hanyut
Enzim - linked
anti - imunoglobulin
ditambahkan. cuci lagi
Enzim substrat
menambahkan dan memberikan
produk berwarna
pada reaksi dengan
enzim yang dapat
kuantitatif menilai menggunakan
spektrofotometer

Gambar. 2.10 Identifikasi virus yang tidak dikenal oleh ELISA dengan antiserum spesifik. Virus yang
tidak diketahui akan digunakan secara paralel dengan persiapan virus kontrol yang dikenal untuk
bereaksi dengan antibodi. Virus yang tidak dikenal diidentifikasi positif ketika reaksi antibodi identik
dengan yang menggunakan virus kontrol. bers sampel rutin. ELISA juga dapat digunakan untuk
mengukur konsentrasi antibodi oleh titrasi antibodi dan menambahkan pengenceran serial ke
sebuah konstanta, konsentrasi rendah dari virus yang telah terikat baki.

2.3 DETEKSI, IDENTIFIKASI,

DAN KLONING genom VIRUS
MENGGUNAKAN PCR DAN RT-PCR
Seperti dibahas di atas, semua teknik memiliki kelebihan dan keterbatasan mereka. Misalnya,
metode serologis deteksi virus yang efektif dan cepat tetapi memberitahu kami apa-apa
tentang genom virus. tes netralisasi sederhana, namun terbatas pada virus yang dapat
dibudidayakan, dan lambat untuk memberikan hasilnya. Hal ini tergantung pada waktu virus
dibutuhkan untuk membunuh sejumlah terdeteksi sel, dan ini dapat berkisar dari beberapa
hari sampai beberapa minggu. Situasi semacam ini jauh dari ideal, dan masalah ini
diselesaikan dengan penemuan teknik yang membuat banyak, banyak salinan dari bagian
yang dipilih dari genom virus
Ini adalah reaksi berantai polimerase (PCR) yang mensintesis DNA dari DNA
Template, dan dirancang pada tahun 1985 oleh Kari Mullis. Jika virus bunga memiliki genom RNA,
daerah bunga memiliki pertama yang dikonversi menjadi DNA menggunakan primer (lihat di bawah)
dan enzim retrovirus, reverse transcriptase (Bagian 8.3). Jika urutan unik dipilih dan ada hasil positif,
virus ini segera diidentifikasi. Sistem ini sangat sensitif dan dapat mendeteksi satu salinan dari
genom DNA atau sekitar 1.000 eksemplar dari genom RNA. Jadi itu adalah sistem deteksi dan
identifikasi semua dalam satu. Biasanya wilayah 100 bp (pasang basa) atau lebih diperkuat, tetapi
dengan hati-hati seluruh genom hingga 15.000 bp dapat disalin. PCR memiliki keuntungan tambahan
mendeteksi virus dalam jaringan primer, sehingga mutasi terkait dengan adaptasi kultur sel
dihindari. Hal ini tidak lebih mahal daripada alat tes netralisasi. Satu-satunya prasyarat untuk PCR
adalah mengetahui urutan daerah mengapit bagian dari genom untuk dideteksi, sehingga primer
oligonukleotida yang melengkapi urutan pada setiap untai DNA dapat dibuat. PCR membutuhkan
dua primer, masing-masing sekitar 20-30 nukleotida panjang, dan ini disintesis secara kimia. DNA
adalah didenaturasi dengan pemanasan sekitar 90 ° C dan primer menambahkan lebih molar tinggi
bersama-sama dengan deoxyribonucleotide trifosfat (dNTP; Gambar 2.11.). di