10.

1 PENDAHULUAN

Proses mengidentifikasi senyawa yang dikenal bertanggung jawab untuk aktivitas

ekstrak sebelum isolasi disebut sebagai dereplikasi. Salah satu tujuan utama dari prosedur
dereplikasi adalah untuk mengidentifikasi bioaktif sampai pada tingkat yang akan berhasil
menyimpulkan proses ekstraksi secara efisien. Selain itu, ini juga memberikan informasi
tentang bagaimana kemajuan melalui proses pasca ekstraksi. Identifikasi dalam kasus
seperti itu biasanya bergantung pada perbandingan bioaktif yang diekstrak dengan senyawa
penanda standar. Dereplikasi berfungsi dalam menyederhanakan proses penemuan obat
produk alami. Secara keseluruhan proses dereplikasi melibatkan pemisahan metabolit
tunggal dengan metode kromatografi, identifikasi senyawa (s) dengan metode spektroskopi,
bioassay untuk evaluasi aktivitas biologis, dan pencarian database untuk verifikasi kebaruan
senyawa(s).

10.2 TEKNIK-TEKNIK DIPERLUKAN SECARA ROUTINELY STUDI DEREPLKASI

10.2.1 Teknik Pemisahan

10.2.1.1 Penggunaan Partisi Solvent

Selama tahap ekstrasi awal dan tahap konsentrasi berikutnya, karakteristik fisik
senyawa yang tidak diketahui ditentukan terlebih dahulu. Partisi pelarut sederhana
menyediakan beberapa informasi tentang polaritas dan daya pengion dari senyawa aktif
biologis dalam ekstrak, dan sedikit informasi ini mempengaruhi pemilihan metode
pemisahan kromatografi nantinya. Namun, harus diingat bahwa teknik partisi pelarut tidak
menghasilkan identifikasi senyawa, tetapi membantu dalam mengesampingkan kelas-kelas
yang tidak dapat dimiliki oleh prinsip-prinsip aktif.

10.2.1.2 Kromatografi Lapis Tipis, Kromatografi Lapis Tipis Berkinerja Tinggi, dan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Jika senyawa yang diteliti dianggap sebagai senyawa yang dikenal yang tersedia sebagai
standar, maka berbagai teknik kromatografi yang tersedia seperti kromatografi lapis tipis
(TLC), kromatografi lapis tipis kinerja tinggi (HPTLC), dan kromatografi cair kinerja tinggi
( HPLC) dapat digunakan. Jika senyawa yang diteliti menunjukkan tR berbeda (waktu
retensi untuk HPLC) dan Rf (retensi faktor untuk TLC) nilai pada sistem kromatografi yang
identik, maka mereka tidak dapat menjadi senyawa yang sama di sisi lain, dua sampel
dengan karakteristik yang sama akan memiliki nilai tR dan Rf yang sama. Perawatan harus
diambil untuk memastikan tingkat kepastian saat mengidentifikasi sampel dan standar.
Untuk mencapai hal yang sama, keduanya harus disuntikkan bersama (coinjection / spiking /
over spiking). Pada kromatogram, jika lebih dari satu puncak terlihat, maka kedua senyawa
itu pasti berbeda. Perilaku kromatografi juga menyediakan beberapa informasi yang berguna
tentang sifat senyawa. Kehadiran asam lemak dalam kolom sering menghasilkan waktu
retensi yang lama dalam medium asam saat menggunakan kolom fase terbalik.

10.2.1.2.1 TLC Overlay Bioassay

Ketika TLC dikombinasikan langsung dengan bioassay, beberapa informasi lebih lanjut
tentang senyawa yang tidak diketahui dapat dikumpulkan. Jenis teknik ini dapat dengan
mudah digunakan untuk menyaring senyawa antimikroba. Setelah pengembangan, lempeng
dilapisi dengan lapisan tipis agar yang mengandung organisme uji terhadap senyawa yang
diteliti dianggap memiliki beberapa aktivitas. Setelah periode inkubasi yang tepat, zona
pertumbuhan inhibisi dalam agar-agar dapat dilihat di daerah pelat TLC yang mengandung
senyawa aktif. Dengan menggunakan teknik seperti itu, suatu senyawa yang tidak diketahui
dapat dikarakterisasi dalam suatu campuran terhadap senyawa standar tanpa persyaratan
untuk isolasi preparatif.

10.2.1.2.2 Metode Bioautografi untuk Penyaringan Efek-Direkayasa

Bioaktif

Kromatografi lapis tipis sering dikombinasikan dengan bioassay lain dan umumnya
didasarkan pada penghambatan / stimulasi pertumbuhan atau aktivitas organisme uji seperti
bakteri, sel ragi, spora jamur, organel sel, misalnya, kloroplas atau enzim.

Pelat HPTLC atau TLC disemprotkan atau dicelupkan secara berurutan dalam larutan enzim
dan substrat (kadang-kadang juga pewarna) untuk memberikan bintik-bintik yang berbeda
warnanya dari latar belakang. Tes enzimatik yang paling populer adalah tes penghambatan
acetylcholinesterase. Tes enzimatik lainnya menggunakan penghambatan glukosidase atau
xantin oksidase.

Aktivitas pemulungan antioksidan dan radikal dapat diuji dengan menggunakan β-karoten,
DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) atau ABTS (2,2′-azino-bis (3-etilbenzthiazoline- 6-sulfonat
asam)) reagen. Ketika pelat HPTLC atau TLC disemprotkan dengan larutan β-karoten, zona
oranye pada latar belakang berwarna putih krem menunjukkan adanya antioksidan. Dalam
kasus DPPH, bintik-bintik kuning pada latar belakang ungu diamati di tempat pemulung
radikal. Reagen DPPH dapat digantikan oleh ABTS, yang memberikan bintik-bintik merah
muda atau tidak berwarna pada latar belakang hijau. Mirip dengan bioautografi biasa, baik
TLC-bioluminescence dan metode yang dijelaskan di atas dapat digabung dengan
spektrometri massa (MS), inframerah, atau resonansi magnetik nuklir (NMR) teknik untuk
mendapatkan informasi yang konstruktif tentang struktur dan bioaktivitas dari senyawa yang
diteliti.

Bioassay, bersama dengan metode spektroskopi, memberikan informasi lengkap

tentang bioaktivitas dan struktur analit.

10.2.2 Teknik Spectroscopic dan Hyphenated

Berbagai jenis teknik spektroskopi umumnya digunakan untuk melakukan identifikasi
senyawa bioaktif parsial atau penuh yang telah dimurnikan, tetapi banyak metode
spektroskopi juga dapat digunakan pada tahap awal untuk identifikasi senyawa dalam
campuran.

Teknik hyphenated juga memainkan peran utama dalam identifikasi produk alami dan
senyawa organik lainnya. Teknik-teknik ini menggabungkan metode pemisahan (yaitu,
kromatografi gas, GC; kromatografi cair, LC) dengan teknik identifikasi struktural (yaitu, MS;
ultraviolet-terlihat spektroskopi, UV-vis; NMR). Meskipun sejumlah pendekatan yang
berhubungan dengan dereplication produk alami telah didasarkan pada GC-MS, LC-UV
(spektroskopi kromatografi cair UV), dan LC-NMR (kromatografi cair NMR), LC-MS telah
teknik yang paling banyak digunakan untuk tujuan ini.

Tujuannya adalah untuk "menghilangkan" senyawa yang tidak diinginkan, untuk

menetapkannya ke kelas atau kelompok tertentu, atau untuk mendeteksi ada / tidaknya
suatu kelompok bahan kimia tertentu dalam suatu campuran.