1

KATA PENGANTAR

Syukur Alhamdulillah kami panjatkan kehadirat Allah SWT atas karunia-

NYA sehingga penyusunan penuntun praktikum ini dapat kami selesaikan.

Penuntun praktikum Mikrobiologi terapan ini mencakup analisis bahan makanan,

minuman, obat tradisional sedian non steril dan kosmetik hingga uji sensitivitas

dan potensi antibiotik. Penuntun praktikum ini merupakan acuan atau panduan

dalam melakasanakan praktikum Mikrobiologi terapan pada Program Studi

Farmasi Universitas Megarezky sehingga diharapkan dapat membantu mahasiswa

dalam kegiatan praktikum.

Akhir kata kami berharap penuntun Praktikum Mikrobiologi terapan ini

bermanfaat bagi mahasiswa sebagai langkah awal dalam mempelajarai dan

mengkaji ilmu-ilmu Farmasi bidang Mikrobiologi.

Makassar, 2019

Penulis

2
 KARTU KONTROL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI TERAPAN
PROGRAM STUDI S1 FARMASI
UNIVERSITAS MEGA REZKY MAKASSAR

NAMA :
Poto
NIM :
3x4
KELOMPOK :

KELAS :

No Tanggal PRAKTIKUM NILAI Paraf KET

Praktikum R TP LKM KEAKTIFAN
Asisten

FOTO

3X4

Makassar , 2019
Penanggung Jawab Praktikum Mikrobiologi terapan

Nurfiddin Farid, S.Farm., M.Si

NIDN: 0915109002

3
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR

I. ANALISIS BAHAN MAKANAN, MINUMAN, OBAT

TRADISIONAL, SEDIAAN NON STERIL DAN KOSMETIK
II. MIC (Minimum Inhibitory Concentration)

III. KOEFISIEN FENOL

IV. UJI STERILITAS

V. UJI SENSITIVITAS ANTIMIKROBA

VI. UJI POTENSI ANTIMIKROBA

VII. LEMBAR KERJA

DAFTAR PUSTAKA

4
 PRAKTIKUM I

ANALISIS BAHAN MAKANAN, MINUMAN, OBAT TRADISIONAL,

SEDIAAN NON STERIL DAN KOSMETIK

Pengujian mikrobiologi terhadap produk perbekalan farmasi dan

makanan yang beredar harus dilakukan dengan mengingat bahwa produk tersebut
sangat mudah terkontaminasi oleh mikroorganisme. Keberadaan mikroorganisme
dalam pembekalan farmasi dan makanan tidak diharapkan karena dapat
berdampak negatif terhadap kesehatan konsumen.
Terdapatnya cemaran mikroorganisme dalam perbekalan farmasi dan
makanan dan kosmetik kemungkinan disebabkan oleh cara pengolahan yang tidak
bersih atau higienis, cara pengepakan yang kurang baik, cara penyimpanan tidak
baik dan lain-lain. Sumber-sumber asal yang memungkinkan terjadinya cemaran
mikrobiologik pada produk tersebut: dari udara, air, tanah, peralatan yang
digunakan pada waktu pengolahan ataupun petugas yang melakukan pengolahan.
Mikroorganisme dapat menyebabkan banyak masalah dan kerusakan. Hal
ini nampak pada kemampuan menginfeksi manusia, hewan, serta tanaman
menimbulkan penyakit berkisar infeksi ringan sampai kepada kematian.
Mikroorganisme mencemari makanan dan minuman dengan menimbulkan
perubahan kimiawi didalamnya, membuatnya tidak dapat dikonsumsi atau
beracun. Adanya mikroorganisme pada obat non steril dan kosmetik dapat
menyebabkan perubahan karakter organoleptis atau kemunduran bahan aktifnya
yang dikandungnya. Selain itu meski mengandung bakteri non patogen namun
dalam jumlah yang banyak juga akan menimbulkan hal yang tidak diinginkan.
Demikian juga pada obat tradisional yang telah banyak beredar, demi
meningkatkan keamanan dan kualitas pemakaian maka perlu dilakukan pengujian
uji laboratorium sebelum izin beredar.

5
Pengujian
Bahan dan Alat :
1. Contoh sampel yang digunakan.
2. Medium NA (Natrium Agar), PDA (Potato Dekstrosa Agar), LB (Lactosa
Broth), PW (Pepton Water), TSB (Triptic Soy Broth), SCB (Slenite Cystine
Broth), EMBA (Eosin Methyln Blue), VJA (Vogel Johnsen Agar), SSA
(Salmonella Shigella Agar) dan CETA (Cetremi Agar), BTB (Brom Timol
Blue) dan Air Steril.
3. Cawan petri steril, tabung reaksi steril, pipet tetes, spoit dan Bunsen.

Cara Kerja :
Penyiapan Sampel
1. Disiapkan alat dan bahan yang digunakan.
2. Dilakukan pengerjaan secara aseptis yaitu tangan dan meja disemprotkan
dengan alkohol 70%.
3. Untuk sampel padatan digerus sampai halus, kemudian ditimbang sebanyak 10
mg, untuk sampel cair dipipet 1 ml dan dimasukkan ke dalam botol
pengenceran 10-1 yang telah berisi aquadest 9 ml yang telah disterilkan, lalu
dihomogenkan.
4. Dari botol pengencer 10-1 diambil 1 ml sampel lalu dimasukkan ke dalam botol
pengencer 10-2, berturut-turut hingga 10-3, 10-4.

Pengujian Sampel
A. Pengujian Kuantitatif
ALT Bakteri
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Dilakukan pengerjaan secara aseptis yaitu tangan dan meja disemprotkan
dengan alkohol 70%.
3. Diambil 1 ml sampel dari tiap tingkat pengenceran yaitu 10-2, 10-3, 10-4,
kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam cawan petri steril.

6
 4. Dituang medium NA hingga menutupi semua dasar cawan petri.
Dihomogenkan dengan cara memutar cawan petri secara perlahan
membentuk angka 8 lalu dibiarkan memadat.
5. Di inkubasi pada inkubator pada suhu 37°C selama 1x24 jam. Diamati dan
dihitung jumlah koloni bakteri.

ALT Kapang
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Dilakukan pengerjaan secara aseptis yaitu tangan dan meja disemprotkan
dengan alkohol 70%.
3. Diambil 1 ml sampel dari tiap tingkat pengenceran yaitu 10-1, 10-2, 10-3,
kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam cawan petri steril.
4. Dituang medium PDA hingga menutupi semua dasar cawan petri.
Dihomogenkan dengan cara memutar cawan petri secara perlahan
membentuk angka 8 lalu dibiarkan memadat.
5. Di inkubasi pada inkubator pada suhu 37°C selama 3x24 jam. Diamati dan
dihitung jumlah koloni bakteri.

B. Pengujian Kualitatif
Pengujian Escherichia coli
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Dilakukan pengerjaan secara aseptis yaitu tangan dan meja disemprotkan
dengan alkohol 70%.
3. Diambil 1 ml sampel dari tiap tingkat pengenceran yaitu 10-2, 10-3, 10-4,
kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam 3 seri tabung reaksi yang
berisi 9 ml medium LB dan tabung Durham, ditetesi 1-3 tetes BTB.
4. Tiap tabung reaksi ditutup dengan sumbat kapas dan masing-masing seri
tabung di ikat dengan karet.
5. Di inkubasi pada inkubator pada suhu 37°C selama 1x24 jam. Diamati jika
timbul gas dan terjadi perubahan warna dari hijau menjadi kuning maka
positif untuk Escherichia coli.

7
Pengujian Staphylococcus aureus
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Dilakukan pengerjaan secara aseptis yaitu tangan dan meja disemprotkan
dengan alkohol 70%.
3. Diambil 1 ml sampel dari tiap tingkat pengenceran yaitu 10-2, 10-3, 10-4,
kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam 3 seri tabung reaksi yang
berisi 9 ml medium PW.
4. Tiap tabung reaksi ditutup dengan sumbat kapas dan masing-masing seri
tabung di ikat dengan karet.
5. Di inkubasi pada inkubator pada suhu 37°C selama 1x24 jam. Diamati jika
timbul kekeruhan dan endapan maka positif untuk Staphylococcus aureus.

Pengujian Pseudomonas aeruginosa

1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Dilakukan pengerjaan secara aseptis yaitu tangan dan meja disemprotkan
dengan alkohol 70%.
3. Diambil 1 ml sampel dari tiap tingkat pengenceran yaitu 10-2, 10-3, 10-4,
kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam 3 seri tabung reaksi yang
berisi 9 ml medium TSB.
4. Tiap tabung reaksi ditutup dengan sumbat kapas dan masing-masing seri
tabung di ikat dengan karet.
5. Di inkubasi pada inkubator pada suhu 37°C selama 1x24 jam. Diamati jika
timbul kekeruhan dan endapan maka positif untuk Pseudomonas
aeruginosa.

Pengujian Salmonella thypi

1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Dilakukan pengerjaan secara aseptis yaitu tangan dan meja disemprotkan
dengan alkohol 70%.

8
 3. Diambil 1 ml sampel dari tiap tingkat pengenceran yaitu 10-2, 10-3, 10-4,
kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam 3 seri tabung reaksi yang
berisi 9 ml medium SCB.
4. Tiap tabung reaksi ditutup dengan sumbat kapas dan masing-masing seri
tabung di ikat dengan karet.
5. Di inkubasi pada inkubator pada suhu 37°C selama 1x24 jam. Diamati jika
timbul kekeruhan dan endapan maka positif untuk Salmonella thypi.

C. Pengujian Lanjutan
Pengujian Escherichia coli
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Dilakukan pengerjaan secara aseptis yaitu tangan dan meja disemprotkan
dengan alkohol 70%.
3. Dituang medium EMBA ke dalam cawan petri steril sehingga tertutupi
dasarnya dan dibiarkan memadat.
4. Dengan ose bulat steril diambil sampel uji positif dari medium LB dan
digoreskan pada medium EMBA.
5. Di inkubasi pada inkubator pada suhu 37°C selama 1x24 jam. Diamati jika
timbul koloni merah dalam hijau metalik maka positif untuk Escherichia
coli.

Pengujian Staphylococcus aureus

1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Dilakukan pengerjaan secara aseptis yaitu tangan dan meja disemprotkan
dengan alkohol 70%.
3. Dituang medium VJA ke dalam cawan petri steril sehingga tertutupi
dasarnya dan dibiarkan memadat.
4. Dengan ose bulat steril diambil sampel uji positif dari medium PW dan
digoreskan pada medium VJA.

9
5. Di inkubasi pada inkubator pada suhu 37°C selama 1x24 jam. Diamati jika
timbul koloni hitam dan zona bening maka positif untuk Staphylococcus
aureus.

Pengujian Pseudomonas aeruginosa

1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Dilakukan pengerjaan secara aseptis yaitu tangan dan meja disemprotkan
dengan alkohol 70%.
3. Dituang medium CETA ke dalam cawan petri steril sehingga tertutupi
dasarnya dan dibiarkan memadat.
4. Dengan ose bulat steril diambil sampel uji positif dari medium TSB dan
digoreskan pada medium CETA.
5. Di inkubasi pada inkubator pada suhu 37°C selama 1x24 jam. Diamati jika
timbul koloni floresensi hijau biru maka positif untuk Pseudomonas
aeruginosa.

Pengujian Salmonella thypi

1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Dilakukan pengerjaan secara aseptis yaitu tangan dan meja disemprotkan
dengan alkohol 70%.
3. Dituang medium SSA ke dalam cawan petri steril sehingga tertutupi
dasarnya dan dibiarkan memadat.
4. Dengan ose bulat steril diambil sampel uji positif dari medium SCB dan
digoreskan pada medium SSA.
5. Di inkubasi pada inkubator pada suhu 37°C selama 1x24 jam. Diamati jika
timbul koloni coklat hitam dengan zona bening maka positif untuk
Salmonella thypi.

10
Tabel Pengamatan :

1. ALT Bakteri

∑ Koloni
No. Sampel
10-1 10-2 10-3
1.
2.
3.
4.

2. ALT Kapang

∑ Koloni
No. Sampel -2
10 10-3 10-4
1.
2.
3.
4.

3. Uji Bakteri Patogen

Sampel
No. Bakteri Uji Medium

Escherichia LB
1.
coli EMBA

Staphylococcus PW
2.
aureus VJA

Pseudomonas TSB
3.
aeruginosa. CETA

Salmonella SCB
4.
thypi SSA

Keterangan : + = Positif (Timbul kekeruhan pada medium)

- = Negatif (Tidak timbul kekeruhan pada medium)

≠ = Tidak dilakukan

11
 PRAKTIKUM II

MIC (Minimum Inhibitory Concentration)

Desinfektan merupakan suatau bahan yang dapat membunuh atau

menghambat pertumbuhan suatu mikroorganisme, terutama mikroba atau bakteri
yang patogen atau membahayakan. Kemampuan desinfektan dapat ditentukan
dengan melihat konsentrasi terendah yang masih mampu membunuh atau
penghambat pertumbuhan mikroorganisme patogen, uji kemampuan itu disebut
dengan MIC (Minimum Inhibitory Concentration).
MIC didefinisikan sebagai konsentrasi terendah bahan antimikrobial
yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba, MIC dapat ditentukan dengan
menggunakan konsentrasi antibiotik dan membandingkan dengan kecepatan
pertumbuhan mikroorganisme dalam tabung kontrol dan tabung yang berisi
antibiotik.
Ciri-ciri suatu disinfektan yang ideal :
1. Aktivitas antimikrobial. Persyarat yang pertama ialah kemampuan substansi
untuk mematikan mikroorganisme. Pada konsentrasi rendah, zat tersebut harus
mempunyai aktivitas antimikrobial dengan spektrum luas; artinya harus dapat
mematikan berbagai macam mikroba.
2. Kelarutan. Substansi itu harus dapat larut dalam air atas pelarut-pelarut lain
sampai pada taraf yang diperlukan untuk digunakan secara efektif.
3. Stabilitas. Perubahan yang terjadi pada substansi itu bila dibiarkan beberapa
lama harus seminimal mungkin dan tidak boleh mengakibatkan kehilangan
sifat antimikrobalnya dengan nyata.
4. Tidak bersifat racun bagi manusia maupun hewan lain. Idealnya persenyawaan
itu harus bersifat letal bagi mikroorganisme dan tidak berbahaya bagi manusia
maupun hewan lain.
5. Keserbasamaan (homogeneity). Di dalam penyiapannya, komposisinya harus
seragam sehingga bahan aktifnya selalu terdapat pada setiap aplikasi. Bahan

12
 kimia murni memang seragam, tetapi campuran berbagai bahan belum tentu
serba sama.
6. Tidak bergabung dengan bahan organik. Banyak desinfektan bergabung
dengan protein atau bahan organik lain. Apabila desinfektan semacam itu
digunakan di dalam keadaan yang banyak mengandung bahan organik, maka
sebagian besar dari desinfektan itu akan menjadi aktif.
7. Aktivitas antimikrobal pada suhu kamar atau suhu tubuh. Tidaklah perlu
menaikkan suhu sampai di atas suhu yang biasanya dijumpai di lingkungan
tempat diinginkannya senyawa itu.
8. Kemampuan untuk menembus. Kecuali bila substansi itu dapat menembus
permukaan, maka aksi antimikrobalnya hanya terbatas pada situs aplikasinya
saja.
9. Tidak menimbulkan karat dan warna.
10. Kemampuan menghilangkan bau yang kurang sedap.
11. Berkemampuan sebagai deterjen.
12. Ketersediaan dan biaya. Senyawa itu harus tersedia dalam jumlah besar dengan
harga pantas.

13
Pengujian
Bahan dan Alat :
1. Contoh sampel yang digunakan.
2. Medium NB, bakteri Staphylococcus aureus.
3. Cawan petri, tabung reaksi steril, pipet tetes, spoit dan bunsen.

Cara Kerja :
1. Disiapkan alat dan bahan yang digunakan.
2. Sediakan 8 tabung reaksi steril, dimana tabung 1 diisi dengan 9,5 ml medium
NB steril dan tabung 2-8 diisi dengan 5 ml NB steril.
3. Ditambahkan dalam tabung 1 sebanyak 0,5 ml sampel yang diujikan, sehingga
diperoleh pengenceran 1 : 20.
4. Dari tabung 1 diambil 5 ml dan dimasukkan dalam tabung 2, dicampur hingga
homogen.
5. Dari tabung 2 diambil 5 ml dimasukkan dalam tabung 3, dilakukan hal yang
sama sampai tabung ke 6. Setelah homogen diambil 5 ml dari tabung 6 dan
disimpan dalam wadah lain/dibuang.
6. Ditanam ke dalam tabung 1-6 sebanyak 1 ose/ 0,02 ml bakteri suspensi biakan
bakteri.
7. Untuk tabung 7 digunakan sebagai kontrol positif dimana hanya berisikan
medium NB 5 ml dan 1 ose/ 0,02 ml bakteri, sedangkan tabung 8 digunakan
sebagai kontrol negatif yang berisikan medium NB 5 ml dan 0,5 ml sampel
yang diujikan.
8. Di inkubasi selama 1x24 jam semua tabung pada suhu 37°C pada inkubator,
amati kekeruhan pada tiap tabung.

14
Tabel Pengamatan :
Pengenceran
No. Sampel Klp
Kontrol + Kontrol -

1.

2.

3.

Keterangan : - = Bening tidak ada pertumbuhan

+ = Keruh, ada pertumbuhan

Nilai MIC tiap sampel

No. Sampel Kelompok Nilai MIC

1.
2.
3.

Gambar Pengamatan

Sampel :
Medium :
Biakan :
Ket : a : Kapas (penutup)
b : Medium
c : Pengamatan (ada tidaknya kekeruhan)

15
 PRAKTIKUM III

KOEFISIEN FENOL

Pada saat ini telah banyak beredar dan ditawarkan berbagai macam
desinfektan kepada konsumen. Desinfektansia secara umum diartikan sebagai
pembasmi mikroorganisme terutama ditujukan kepada benda mati. Pada
penandaannya yang memenuhi persyaratan telah dicantumkan cara penggunaan
produk yang sesuai sebagai bahan untuk desinfeksi. Namun demikian banyak pula
produk desinfektansia yang membuat cara-cara penggunaan dan komposisinya.
Sehubungan dengan hal tersebut diatas, maka setiap bahan dan sediaan
desinfektansia perlu dilakukan pengawasan secara laboratorium untuk melindungi
konsumen dari pemalsuan sediaan tersebut. Menurut SNA 06-1872-1990, syarat
mutu cairan desinfektan sebagai pembersih lantai dan lain-lain adalah koefisien
fenol, pH, kelarutan dalam air sadah, dan daya memucatkan sebagai indikator
kekuatan desinfektan dalam membasmi mikroorganisme adalah koefisien fenol.
Josep Lister (1817) menggunakan desinfektan yang mengandung
persenyawaan fenol yaitu asam karbol untuk desinfeksi peralatan bedahnya pada
saat melakukan operasi. Sampai sekarang pun sebagai larutan baku penentu
keampuhan desinfektansia, sehingga dikembangkan metode untuk pengujian
kekuatan desinfektansia dengan uji koefisien fenol.
Nilai koefisien fenol adalah perbandingan pengenceran tertinggi
desinfektansia dengan pengenceran tertinggi baku fenol 5 %, dimana pengenceran
tersebut dapat mematikan bakteri uji dalam kontak waktu 10 menit, tetapi tidak
mematikan bakteri uji dalam kontak waktu 5 menit. Mikroorganisme yang di
pakai menurut FDA adalah galur Salmonella thypi dan Staphylococcus aureus
yang khas.

16
Rumus Koefisien Fenol

Pengenceran tertinggi zat kimia uji yang mematikan

mikroba uji dalam 10 menit tapi tidak mematikan mikroba
uji dalam 5 menit.
Koefisien Fenol =
Pengenceran tertinggi larutan fenol yang mematikan
mikroba uji dalam 10 menit tapi tidak mematikan mikroba
uji dalam 5 menit.
Adapun persyaratan hasildari uji koefisien fenol adalah :
1. Jika di peroleh koefisien fenol lebih kecil dari 0,005 maka contoh yang di
periksa bukan termasuk antiseptik dan desinfektan.
2. Jika diperoleh koefisien fenol kurang dari 1 berarti bahan tersebut adalah sama
atau kurang efektif dari pada fenol. Dan jika di peroleh koefisien fenol lebih
besar dari 1 berarti bahwa bahan kimia tersebut lebih efektif dari fenol dibawah
kondisi test yang sama.
3. Jika diperoleh koefisien fenol yang diperoleh dikalikan dengan faktor 20
menghasilkan angka yang lebih kecil dari angka pengenceran yang tertera pada
etiket, maka pengenceran antiseptik atau deinfektan tidak memenuhi syarat.
4. Jika diperoleh koefisien fenol yang diperoleh dikalikan dengan faktor 20
menghasilkan angka sesuai dengan angka pengenceran yang tertera pada etiket,
maka pengenceran antiseptik atau deinfektan tidak memenuhi syarat.

17
 Pengujian
Bahan dan Alat :
1. Contoh sampel yang digunakan berdasarkan uji MIC.
2. Medium NB, kultur bakteri Salmonella thypi dan Staphylococcus aureus,
larutan fenol, dan es batu/air es.
3. Tabung reaksi steril, pipet tetes, spoit, stopwatch, ose dan bunsen.

Cara Kerja :
Pembuatan Larutan Baku Fenol 5 %
1. Disiapkan alat dan bahan yang digunakan.
2. Ditimbang fenol sebanyak 0,5 g, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur
100 ml.
3. Dibuat pengenceran baku fenol dalam tabung reaksi dengan perbandingan 1 :
80, 1 : 90, dan 1 : 100 untuk deret 1.
4. Untuk deret I, II, III disiapkan tabung reaksi masing-masing 3 yang berisi 5 ml
medium Nutrient Broth (NB).
5. Pada deret I dimasukkan suspensi bakteri sebanyak 1 ose/ 0,02 ml pada tabung
1 kemudian didiamkan selama 30 detik.
6. Setelah 30 detik dilakukan hal yang sama pada tabung 2, didiamkan 30 detik
dan dilanjutkan untuk tabung 3 pada deret I. Kemudian diistirahatkan selama 3
menit di wadah yang berisi air es.
7. Ke dalam tabung ke-1 dari deret II, dimasukkan 1 ose larutan dari tabung ke-1
deret I, kemudian didiamkan selama 30 detik.
8. Ke dalam tabung ke-2 dari deret II, dimasukkan 1 ose larutan dari tabung ke-2
deret I, kemudian didiamkan selama 30 detik. Hal sama dilakukan pada tabung
ke-3 kemudian diistirahatkan selama 3 menit di wadah yang berisi air es.
9. Ke dalam tabung ke-1 dari deret III, dimasukkan 1 ose larutan dari tabung ke-1
deret I, kemudian didiamkan selama 30 detik.
10. Ke dalam tabung ke-2 dari deret III, dimasukkan 1 ose larutan dari tabung ke-2
deret I, kemudian didiamkan selama 30 detik. Hal sama dilakukan pada tabung

18
 ke-3 dari deret III. Kemudian diistirahatkan selama 3 menit di wadah yang
berisi air es.
11. Semua tabung di inkubasi dalam incubator pada suhu 37°C selama 1x24 jam.
Di amati perubahan yang terjadi berupa kekeruhan medium atau terbentuknya
endapan.

Pembuatan Larutan Baku

1. Disiapkan alat dan bahan yang digunakan.
2. Disiapkan 5 tabung reaksi yang berisi pengenceran sampel (dimisalkan nilai
MIC sebelumnya) 1 : 100, 1 : 140, 1 : 180, 1 : 220 dan 1 : 240 untuk deret I,
dan tabung yang berisi 5 ml medium Nutrient Broth (NB) yang dibagi menjadi
3 deret (deret II, deret III, dan deret IV) masing-masing 5 tabung.
3. Pada deret I dimasukkan suspensi bakteri sebanyak 1 ose/ 0,02 ml pada tabung
1 kemudian didiamkan selama 30 detik.
4. Setelah 30 detik dilakukan hal yang sama pada tabung 2, didiamkan 30 detik
dan dilanjutkan untuk tabung 3, 4, dan 5 pada deret I. Kemudian diistirahatkan
selama 3 menit di wadah yang berisi air es.
5. Ke dalam tabung ke-1 dari deret II, dimasukkan 1 ose larutan dari tabung ke-1
deret I, kemudian didiamkan selama 30 detik.
6. Ke dalam tabung ke-2 dari deret II, dimasukkan 1 ose larutan dari tabung ke-2
deret I, kemudian didiamkan selama 30 detik. Hal sama dilakukan pada tabung
ke-3, ke-4, dan ke-5 dari deret II, kemudian diistirahatkan selama 3 menit di
wadah yang berisi air es.
7. Ke dalam tabung ke-1 dari deret III, dimasukkan 1 ose larutan dari tabung ke-1
deret I, kemudian didiamkan selama 30 detik.
8. Ke dalam tabung ke-2 dari deret III, dimasukkan 1 ose larutan dari tabung ke-2
deret I, kemudian didiamkan selama 30 detik. Hal sama dilakukan pada tabung
ke-3, ke-4, dan ke-5 dari deret III. Kemudian diistirahatkan selama 3 menit di
wadah yang berisi air es.

19
9. Semua tabung di inkubasi dalam incubator pada suhu 37°C selama 1x24 jam.
Di amati perubahan yang terjadi berupa kekeruhan medium atau terbentuknya
endapan.

Tabel Pengamatan :
Desinfektan

Lama Kontak
No. Pengenceran
5 menit 10 menit 15 menit

1.

2.

3.

4.

5.

Fenol 5 %

Lama Kontak
No. Pengenceran
5 menit 10 menit 15 menit

1.

2.

3.

Keterangan : - = Tidak ada pertumbuhan bakteri (jernih)

+ = Ada pertumbuhan bakteri (keruh)
- = Mematikan dalam waktu kontak 10 menit
+ = Tidak mematikan dalam waktu kontak 5 menit

20
Gambar Pengamatan

Deret

Sampel : Nutrient Broth (NB)

Medium : ………………

Keterangan :
Deret ke …..
Tabung ke …
( - ) = Jernih (# tumbuh)
( + ) = Keruh (ada pertumbuhan)
1. Sumbat Kapas
2. Tabung Reaksi
3. Medium
4. Kolom Bakteri

21
 PRAKTIKUM IV

UJI STERILITAS

Mikroorganisme dapat menyebabkan banyak bahaya dan kerusakan. Hal

ini Nampak dari kemampuannya menginfeksi, menimbulkan penyakit yang
berkisar dari infeksi ringan sampai kematian. Karena itu adanya prosedur untuk
mengendalikan pertumbuhan dan kontaminasi oleh mikroorganisme merupakan
suatu keharusan. Yang dimaksud dengan pengendalian disini ialah kegiatan yang
dapat menghambat, membasmi atau menyingkirkan mikroorganisme.
Mikroorganisme dapat disingkirkan, dihambat atau dibunuh dengan
sarana atau proses fisik atau bahan kimia. Tersedia berbagai teknik dari sarana
yang bekerja menurut berbagai macam cara yang berbeda-beda dan masing-
masing mempunyai keterbatasan sendiri-sendiri didalam penerapan praktisnya.
Suatu sarana fisik dapat diartikan sebagai keadaan atau sifat fisik yang
menyebabkan suatu perubahan.
Beberapa contoh sarana fisik ialah suhu, tekanan, radiasi atau
penyaringan. Suatu proses fisik ialah suatu prosedur yang mengakibatkan
perubahan, misalnya sterilisasi, pembakaran dan sanitasi. Suatu bahan kimia ialah
suatu substansi (padat, cair dan gas) yang dicirikan oleh komposisi molekular
yang pasti dan menyebabkan terjadi reaksi seperti senyawa fenolik, alokohol.
Alasan utama pengendalian mikroorganisme sebagai berikut :
1. Mencegah penyebaran penyakit dan infeksi
2. Membasmi mikroorganisme pada inang yang terinfeksi
3. Mencegah pembusukan dan perusakan bahan oleh mikroorganisme
Salah satu faktor yang harus diperhatikan adalah ruangan, ruang yang
digunakan harus steril dalam artian keadaan ruangan yang bebas dari semua
bentuk kehidupan bakteri baik patogen maupun non patogen termasuk sporanya.
Mikroorganisme dapat hidup dimana-mana, tidak hanya di ruang terbuka,
tapi juga di ruang tertutup. Kehidupan mikroorganisme di ruang tertutup lebih
mudah dikendalikan dibanding ruang terbuka. Jika mikroorganisme dapat

22
dikendalikan maka tergolong sebagai ruangan steril. Sehingga perlu dilakuan
pencegahan, atau pengendalian dari kontaminasi mikroorganisme yang dapat
mempengaruhi secara langsung maupun tidak langsung proses industri farmasi
atau produk yang dihasilkan oleh industri farmasi.
Selain ruangan yang harus steril, alat-alat kesehatan dan porsenil juga
sangatlah penting. Hal ini mengingat tentang keberhasilan suatu produk farmasi
dalam industri farmasi yang dipengaruhi oleh kondisi alat, proses pembuatan dan
porsenilnya sendiri.

23
Pengujian
Bahan dan Alat :
1. Medium NA dan PDA steril.
2. Cawan petri steril, spoit steril, dan bunsen.

Cara Kerja :
Penyiapan Medium
1. Disiapkan alat dan bahan yang digunakan.
2. Cawan petri steril diisi dengan medium NA dan PDA cair secara aseptik
sebanyak kurang lebih 10 ml, lalu dibiarkan memadat.
3. Semua cawan petri yang berisi medium NA di inkubasikan terbalik dengan
suhu 37°C selama 1x24 jam pada inkubator sedangkan untuk medium PDA
pada suhu kamar selama 3x24 jam.
4. Cawan petri yang tidak mempunyai mikroba digunakan untuk uji sterilitas
ruangan.

Penyiapan Sterilisasi Ruangan (LAF, ENKAS, Lampu UV)

1. Lampu UV (Ultraviolet)
a. Alat dan bahan disiapkan.
b. Cawan petri steril yang berisi medium NA dan medium PDA tutupnya
dibuka 1/3 bagian, didamkan selama 15 menit.
c. Cawan petri steril tersebut diinkubasikan terbalik pada inkubator bersuhu
37°C selama 1x24 jam. Diamati ada tidaknya koloni mikroba.

2. Laminary Air Flow (LAF)

a. Alat dan bahan disiapkan.
b. Cawan petri steril yang berisi medium NA dan medium PDA tutupnya
dibuka 1/3 bagian, didamkan selama 15 menit.
c. Cawan petri steril tersebut diinkubasikan terbalik pada inkubator bersuhu
37°C selama 1x24 jam. Diamati ada tidaknya koloni mikroba.

24
3. Enkas
a. Alat dan bahan disiapkan.
b. Cawan petri steril yang berisi medium NA dan medium PDA tutupnya
dibuka 1/3 bagian, didamkan selama 15 menit.
c. Cawan petri steril tersebut diinkubasikan terbalik pada inkubator bersuhu
37°C selama 1x24 jam. Diamati ada tidaknya koloni mikroba.

Pengujian Kedua Sterilisasi Ruangan (LAF, ENKAS, Lampu UV)

1. Lampu UV (Ultraviolet)
a. Alat dan bahan disiapkan.
b. Disemprot ruang lampu UV dengan alkohol 70%, dinyalakan lampu UV
254 nm an 366 nm selama 15 menit.
c. Cawan petri steril yang berisi medium NA dan medium PDA tutupnya
dibuka 1/3 bagian, didamkan selama 15 menit.
d. Cawan petri steril tersebut diinkubasikan terbalik pada inkubator bersuhu
37°C selama 1x24 jam. Diamati ada tidaknya koloni mikroba.

2. Laminary Air Flow (LAF)

a. Alat dan bahan disiapkan.
b. Disemprot dengan alkohol 70%, dinyalakan lampu UV selama 5 menit
selanjutnya dialiran udara steril selama 15 menit.
c. Cawan petri steril yang berisi medium NA dan medium PDA tutupnya
dibuka 1/3 bagian, didamkan selama 15 menit.
d. Cawan petri steril tersebut diinkubasikan terbalik pada inkubator bersuhu
37°C selama 1x24 jam. Diamati ada tidaknya koloni mikroba.

3. Enkas
a. Alat dan bahan disiapkan.
b. Cawan petri steril yang berisi medium NA dan medium PDA tutupnya
dibuka 1/3 bagian, didamkan selama 15 menit.
c. Cawan petri steril tersebut diinkubasikan terbalik pada inkubator bersuhu
37°C selama 1x24 jam. Diamati ada tidaknya koloni mikroba.

25
Tabel Pengamatan :

Ruangan Uji

Kelompok UV LAF ENKAS

NA PDA NA PDA NA PDA

Gambar Pengamatan
Pengujian Pertama

koloni koloni koloni koloni

LAF ENKAS LAF ENKAS

koloni koloni

Lampu UV Lampu UV

Medium NA Medium PDA

Keterangan : Hitung jumlah koloni

26
Pengujian Kedua

koloni koloni koloni koloni

LAF ENKAS LAF ENKAS

koloni koloni

Lampu UV Lampu UV

Medium NA Medium PDA

Keterangan : Hitung jumlah koloni

27
 PRAKTIKUM V

UJI SENSITIVITAS ANTIMIKROBA

Antimikroba adalah bahan-bahan atau obat-obat yang digunakan untuk

memberantas infeksi mikroba pada manusia. Prodak dari antimikroba salah
satunya adalah antibiotik yang merupakan antimikroba yang dihasilkan dari
mikroorganisme untuk membunuh atau menghambat pertumbuhan
mikroorganisme lainnya.
Obat-obat yang digunakan untuk membasmi mikroorganisme yang
menyebabkan infeksi pada manusia, hewan atau tumbuhan bersifat toksisitas
selektif artinya obat atau zat tersebut harus bersifat toksik terhadap
mikroorganisme penyebab penyakit tetapi tidak toksik terhadap jasad inang atau
hospes.
Antimikroba banyak digunakan dalam mengobati penyakt, namun tidak
semua antimikroba dapat digunakan dalam pengobatan penyakit. Sebelum
diberikan sebagai pengobatan sebaiknya ditentukan dulu antimikroba mana yang
digunakan yang paling ampuh untuk mengobati penyakit. Masalah yang dihadapi
sekarang adalah resistensi antimikroba, dimana suatu antimikroba gagal dalam
terapi mengobati penyakit infeksi.
Adanya hal tersebut maka dilakukanlah uji sensitivitas antimikroba untuk
mengetahui kemampuan antimikroba. Cara digunakan dalam menguji kemampuan
antimikroba adalah antibiogram atau uji kepekaan antimikroba terhadap patogen
penyebab penyakit.
Metode yang biasa digunakan adalah meode Kirby-Bauer, pada uji ini
lempengan agar disemai dengan mikroorganisme penguji. Penghambatan
mikroorganisme oleh antimikroba terlihat jernih sekitar pertumbuhan
mikroorganisme.

28
Pengujian
Bahan dan Alat :
1. Medium NA dan GNB atau NB steril.
2. Suspensi bakteri uji Vibrio sp., Salmonella thypi, Escherichia coli,
Streptococcus mutans, dan Pseudomonas aeruginosa.
3. Sampel Ampicillin®, Ciprofloxacin®, Kloramfenikol®, Rifampisin®, Sabun
Mandi, Alkohol 70%, Sabun Cuci Piring dan Hand sanitaizer.
4. Cawan petri steril, spoit steril, ose, vial steril, botol, piper disk dan bunsen.

Cara Kerja :
Peremajaan Mikroba Uji
1. Diambil bakteri dan biakan murni masing-masing satu ose kemudian
diinokulasikan pada medium cair (Medium GNB atau NB).
2. Di inkubasi pada suhu 37°C pada inkubator selama 1x24 jam.
3. Mikroba hasil peremajaan disuspensikan dengan larutan NaCl 0,9% steril.
4. Mikroba tersebut diukur transmitannya menggunakan spektofotometer dengan
panjang gelombang 580 nm pada 25% T untuk bakteri, sebagai blanko
digunakan larutan NaCl 0,9% steril.
5. Bakteri tumbuh disimpan pada lemari pendingin sebagai stok mikroba uji.

Penyiapan Antimikroba Uji

1. Ditimbang antimikroba uji.
2. Kemudian dilarutkan atau disuspensikan dengan pelarut atau surfaktan yang
cocok dengan jumlah tertentu hingga diperoleh konsentrasi yang iinginkan.
3. Untuk sampel yang mudah larut dalam air dilarutkan dengan aquadest
sedangkan yang sukar larut dibuat suspensi dengan Na-CMC.

Pengujian Sensitivitas Antimikroba

1. Alat dan bahan disiapkan.
2. Medium NA dimasukkan 10 ml kedalam vial steril.
3. Cawan petri di garis dan dibagi menjadi 4 bagian.

29
4. Suspensi biakan bakteri diambil sebanyak 20 µl/ l ose dan dimasukkan ke
dalam vial steril yang berisi dengan medium NA kemudian dituang kedalam
cawan petri steril, dihomogenkan dan biarkan memadat.
5. Medium NA dibiarkan memadat, piper disk yang telah dimasukkan ke dalam
suspensi antibiotik diambil dan diletakkan dipermukaan medium NA yang
telah memadat dalam cawan petri.
6. Cawan petri dimasukkan dalam inkubator pada suhu 37°C selama 1x24 jam.
7. Diameter zona hambatannya (bening) diamati dan diukur.

30
Tabel Pengamatan :

Bakteri Uji

Nama Diameter zona hambatan (mm)

Ket.
Sampel
I II III IV
Bakteri Bakteri Bakteri Bakteri

Gambar Pengamatan

A
B

Bakteri :

Keterangan : A = Piper disk yang telah direndam dalam sampel

B = Medium
C = Zona Hambat
D = Cawan Petri

31
 PRAKTIKUM VI

UJI POTENSI ANTIMIKROBA

Keberhasilan penggunaan sediaan farmasi yang mengandung senyawa

antibiotika tergantung pada ketepatan diagnosis dokter dan mutu sediaan farmasi.
Mutu sediaan terutama antibiotika, mulai dari bahan baik, selama proses
pembuatannya sampai diedarkan biasanya potensinya masih cukup tinggi, tetapi
setelah diedarkan beberapa waktu sering mengalami penirunan mutu terutama
potensinya. Sehubungan dengan hal tersebut maka pengawasan mutunya harus
diperhatikan agar pada penggunaan dapat dipertanggung jawabkan.
Uji atau penetapan potensi antibiotika dapat dilakukan dengan cara
kimia, fisikokimia dan mikrobiologik atau biologik. Pada uji atau penetapan
secara mikrobiologik lebih menggambarkan tentang khaiat antibiotika.
Uji potensi antibiotika secara mikrobiologik adalah suatu teknik untuk
penetapan potensi suatu antibiotika dengan mengukur efek senyawa tersebut
terhadap pertumbuhan mikroorganisme uji yang peka dan sesuai. Efek yang
ditimbulkan pada mikroba uji dapat berupa hambatan pertumbuhan. Terdapat dua
cara yang umum digunakan dalam uji potensi secara mikrobiologik yaitu metode
difusi agar dan metode tabung atau turbidimetri.
Pada uji metode turbidimetri pengamatan dilakukan terhadap kekeruhan
yang terjadi sesuai dengan tingkat pengenceran dari senyawa yang diujikan.
Metode ini menggunakan medium cair yang diinokulasikan dengan bakteri.
Untuk metode dengan difusi agar menggunakan medium agar pada
medium yang telah diinokulasikan dengan bakteri secara merata. Pada medium
tersebut diletakkan pencadang atau reservoir yang selanjutnya dipipet senyawa
antibiotik yang diujikan. Selain pencadang dapat pula digunakan piper disk
dimana piper disk tersebut direndam pada senyawa yang diujikan kemudian
diletakkan diatas medium yang telah diinokulasikan dengan bakteri. Pada
praktikum ini akan dilakukan percobaan dengan menggunakan difusi agar dengan
menggunakan piper disk.

32
Pengujian
Bahan dan Alat :
1. Medium NA dan GNB atau NB steril.
2. Suspensi bakteri uji Salmonella thypi, Escherichia coli, Streptococcus mutans,
dan Pseudomonas aeruginosa. Sampel Kloramfenikol.
3. Cawan petri steril, spoit steril, ose, vial steril, botol, piper disk dan bunsen.

Cara Kerja :
Peremajaan Mikroba Uji
1. Diambil bakteri dan biakan murni masing-masing satu ose kemudian
diinokulasikan pada medium cair (Medium GNB atau NB).
2. Di inkubasi pada suhu 37°C pada inkubator selama 1x24 jam.
3. Mikroba hasil peremajaan disuspensikan dengan larutan NaCl 0,9% steril.
4. Mikroba tersebut diukur transmitannya menggunakan spektofotometer dengan
panjang gelombang 580 nm pada 25% T untuk bakteri, sebagai blanko
digunakan larutan NaCl 0,9% steril.
5. Bakteri tumbuh disimpan pada lemari pendingin sebagai stok mikroba uji.

Penyiapan Antimikroba Uji

1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Ditimbang kloramfenikol sebanyak 100 mg dilarutkan dalam 100 ml setara
dengan 1 mg/ml.
3. Di buat 3 dosis pengenceran. Dosis I dipipet 0,15 ml dari larutan yang telah
dibuat dan dicukupkan dengan aquadest steril hingga 10 ml (15µg/ml).
4. Dosis II dipipet 0,3 ml dari larutan yang telah dibuat dan dicukupkan dengan
aquadest steril hingga 10 ml (30µg/ml).
5. Dosis III dipipet 0,6 ml dari larutan yang telah dibuat dan dicukupkan dengan
aquadest steril hingga 10 ml (60µg/ml).

33
Pengujian Sensitivitas Antimikroba
1. Alat dan bahan disiapkan.
2. Medium NA dimasukkan 10 ml kedalam vial steril.
3. Cawan petri di garis dan dibagi menjadi 4 bagian.
4. Suspensi biakan bakteri diambil sebanyak 20 µl/ l ose dan dimasukkan ke
dalam vial steril yang berisi dengan medium NA kemudian dituang ke dalam
cawan petri steril, dihomogenkan dan biarkan memadat.
5. Piper disk dicelupkan ke dalam masing-masing dosis pengenceran
kloramfenikol, selanjutnya diletakkan diatas cawan petri, sebagai kontrol
digunakan piper disk tanpa antimikroba.
6. Cawan petri dimasukkan dalam inkubator pada suhu 37°C selama 1x24 jam.
7. Diameter zona hambatannya (bening) diamati dan diukur.

34
Tabel Pengamatan :
Bakteri Uji (Diameter zona bening mm)
Dosis Salmonella Escherichia Streptococcus Pseudomonas
thypi coli mutans aeruginosa

II

III

Kontrol

Gambar Pengamatan

A
B

Bakteri :

Keterangan : A = Piper disk yang telah direndam dalam sampel

B = Medium
C = Zona Hambat
D = Cawan Petri

35
 DAFTAR PUSTAKA

Badan POM. Metode Analisi PPOMN 2000 Mikrobiologi. Pusat Pengujian Obat
dan Makanan Nasional Badan POM. Jakarta. 2001.

Bibiana W. Lay. Analisis Mikroba Di laboratorium. PT. Raja Grafind Persada

Jakarta. 1994.

Dwyana, Z. Mikrobiologi Farmasi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam, Universitas Hasanuddin. Makassar. 2008.
Djide, M. N. Sartini, Kadir S. H. Analisis Mikrobiologi Farmasi. Makassar :
Laboratorium Mikrobiologi Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin. Makassar. 2008.
Djide, M. N. Sartini. Dasar-dasar Mikrobiologi Farmasi. Makassar : Lembaga
Penerbit Universitas Hasanuddin. Makassar. 2008.
Jutono, dkk. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum. Untuk Perguruan Tinggi.
Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada
Yogyakarta. Yogyakarta. 1980.
Pelczar. Michael J. and Chan. E.C.S, Dasar-dasar Mikrobiologi, Terjemahan oleh
Hadioetomo, Ratna Sari dkk, Jakarta : Universitas Indonesia. 2008.

36