Pengumpulan dan Pemrosesan Sampel Lingkungan

Ian L. Pepper dan Charles P. Gerba

TANAH DAN SEDIMEN

Tanah adalah lingkungan heterogen yang tidak teratur yang mengandung sejumlah besar organisme
yang beragam. Seperti yang dijelaskan dalam Bab 4, komunitas mikroba tanah bervariasi dengan
kedalaman dan jenis tanah, dengan cakrawala tanah permukaan umumnya memiliki lebih banyak
organisme daripada cakrawala bawah permukaan. Komunitas juga bervariasi dari situs ke situs, dan
bahkan di dalam situs karena variasi microsite alami yang dapat memungkinkan mikroorganisme
yang sangat berbeda untuk hidup berdampingan. Karena variabilitas yang besar dalam komunitas,
seringkali perlu mengambil lebih dari satu sampel untuk mendapatkan sampel mikroba yang
representatif di situs tertentu. Oleh karena itu, strategi pengambilan sampel secara keseluruhan
akan tergantung pada banyak faktor, termasuk tujuan analisis, sumber daya yang tersedia, dan
karakteristik situs. Pendekatan yang paling akurat adalah mengambil banyak sampel dalam situs
tertentu dan melakukan analisis terpisah dari setiap sampel. Namun, dalam banyak kasus waktu dan
upaya dapat dikonserved dengan menggabungkan sampel yang diambil untuk membentuk sampel
komposit yang dianalisis, sehingga membatasi jumlah analisis yang perlu dilakukan. Pendekatan lain
yang sering digunakan adalah mencicipi situs secara berurutan dari waktu ke waktu dari lokasi kecil
yang ditentukan untuk menentukan efek temporal pada mikroba. Karena begitu banyak pilihan
yangmampu,pentinguntuk mendeskrilasi strategi pengambilan sampel untuk memastikan bahwa
jaminan kualitas ditangani. Hal ini dilakukan dengan mengembangkan quality assurance project plan
(QAPP) sesuaidengan pedoman yang ditunjukkan dalam Kotak Informasi 8.1.

8.1.1 Strategi dan Metode Pengambilan Sampel untuk Tanah Permukaan

Sampel tanah massal mudah diperoleh dengan sekop atau, lebih baik lagi, auger tanah (Gambar 8.1).
Auger tanah lebih tepat daripada sekop sederhana karena mereka memastikan bahwa samples
dibawa ke kedalaman yang sama persis pada setiap kesempatan. Ini penting, karena beberapa faktor
tanah dapat bervariasi secararapi dengan kedalaman, seperti oksigen, kadar air, kandungan karbon
organik dan suhu tanah. Auger tangan sederhana berguna untuk mengambil sampel tanah dangkal
dari area yang tidak jenuh. Mengingat kondisi yang tepat, auger tangan dapat digunakan untuk
mengambil sampel hingga kedalaman 180 cm dengan kenaikan 30 cm. Namun, beberapa tanah
terlalu padat atau mengandung terlalu banyak batu untuk memungkinkan pengambilan sampel ke
kedalaman ini. Ketika mengambil sampel untuk analisis mikroba, pertimbangan harus diberikan pada
kontaminasi yang dapat terjadi saat auger didorong ke dalam tanah. Dalam hal ini, mikroba yang
menempel di sisi auger karena dimasukkan ke dalam tanah dan didorong ke bawah dapat
contaminate inti berikutnya yang diambil. Untuk meminimalkan kontaminasi tersebut, seseorang
dapat menggunakan spatula steril untuk mengikis lapisan luar inti dan menggunakan bagian dalam
inti untuk analisis. Kontaminasi juga dapat terjadi antara samples, tetapi ini dapat dihindari dengan
membersihkan auger setelah setiap sampel diambil. Prosedur pembersihan melibatkan mencuci
auger dengan air, kemudian membilasnya dengan anol 75% atau pemutih 10%, dan akhirnya dibilas
dengan air steril.

Kotak Informasi 8.1 Koleksi dan Spesifikasi Penyimpanan untuk Rencana Proyek Penjaminan Mutu
(QAPP) QAPP melibatkan delineasi rincian pengambilansampel strategy,metode
pengambilansampel, dan penyimpanan berikutnya dari semua sampel. QAPP biasanya juga
mencakup rincian analisis mikroba yang diajukan pro untuk dilakukan pada sampel tanah.
 A. Strategi pengambilan sampel: Jumlah dan jenis sampel, lokasi, kedalaman, waktu, interval.
B. Metode pengambilan sampel: Teknik dan peralatan khusus yang akan digunakan
C. Penyimpanan sampel: Jenis kontainer, metode pelestarian, waktu penahanan maksimum

Sampel komposit dapat diperoleh dengan mengumpulkan jumlah tanah yang sama dari sampel yang
diambil alih area yang luas dan menempatkannya dalam ember atau kantong plastik. Seluruh massa
tanah kemudian dicampur dan menjadi sampel komposit. Untuk mengurangi volume sampel yang
akan disimpan, sebagian sampel komposit dapat dihapus, dan ini menjadi sampel untuk analisis.
Dalam semua kasus, sampel harus disimpan di atas es sampai diproses dan dianalisis.

Dalam beberapa kasus, serangkaian plot eksperimental atau bidang perlu dicicipi untuk menguji efek
amandemen tanah, seperti pupuk, pestisida atau lumpur limbah, pada masyarakat mikroba. Dalam
hal ini, sampel tanah harus diambil dari masing-masing dari beberapa plot atau bidang untukcom
pare mengontrol plot nontreated dengan plot yang telah menerima amandemen. Misalnya, seorang
peneliti mungkin salingterpanas dalam pengaruh pupuk nitrogen anorganik pada populasi nitrifying
tanah. Penyelidik kemudian akan mencicipi plot (kontrol) yang belum selesai untuk dibandingkan
dengan plot yang telah diperlakukan dengan pupuk anorganik. Contoh lain adalah kasus di mana
tanah yang diubah dengan lumpur limbah diambil sampel untuk analisis patogen virus berikutnya.
Dalam kedua contoh, beberapa samples atau replikasi selalu memberikan perkiraan yang lebih halus
dari parameter yang menarik. Namun, pekerjaan lapangan bisa mahal dan jumlah sampel yang
diambil harus ditimbang terhadap biaya analisis dan dana yang tersedia. Dalam contoh yang
diberikan, paket pengambilan sampel dua dimensi dapat digunakan untuk menentukan jumlah dan
lokasi sampel yang diambil. Dalam pengambilan sampel dua dimensi, setiap plot ditetapkan
koordinat spasial dan set sampling point dipilih sesuai dengan rencana yang ditetapkan. Beberapa
pola sampling duadimensi yang khas, termasuk acak, sekte tran,sampling dua tahap dan grid,
diilustrasikan dalam Gambar 8.2.

Random sampling melibatkan pemilihan titik acak dalam plot minat, yang kemudian dicicipi ke
kedalaman yang ditentukan. Pengambilan sampel transek melibatkan pengumpulan sampel dalam
satu arah. Misalnya, transect sampling mungkin berguna di daerah riparian, di mana transek dapat
dipilih berdekatan dengan dasar sungai dan pada sudut kanan ke sungai. Dengan cara ini, pengaruh
aliran pada komunitas mikroba dapat dievaluasi. Dalam pengambilan sampel dua tahap, area
dipecah menjadi sub unit reguleryang disebut unitprimer. Dalam setiap unit utama, subsample
dapat diambil secara acak atau sistematis. Pendekatan ini mungkin berguna ketika situs terdiri dari
lereng lereng bukit dan dataran tingkat, dan kemungkinan ada variabilitas antara unit utama. Contoh
akhir dari pola sampling adalah grid sampling, di mana sampel diambil secara sistematis secara
berkala pada penspasian tetap. Jenis pengambilan sampel ini berguna untuk memetakan area ketika
sedikit yang diketahui tentang variabilitas dalam tanah.

Pengambilan sampel dua dimensi tidak memberikan tion informatentang perubahan dalam
komunitas mikroba dengan kedalaman. Oleh karena itu, pengambilan sampel tiga dimensi digunakan
ketika informasi mengenai kedalaman diperlukan. Informasi kedalaman tersebut sangat penting
ketika mengevaluasi situs yang telah terkontaminasi oleh pembuangan yang tidak tepat, atau
tumpahankontakan. Pengambilan sampel tiga dimensi dapat sesederhana mengambil sampel
dengan kenaikan kedalaman 50 cm hingga kedalaman 200 cm, atau dapat melibatkan pengeboran
beberapa ratus meter ke zona vadose bawah permukaan. Untuk pengambilan sampel bawah
permukaan, peralatan khusus diperlukan, dan sangat penting untuk memastikan bahwa sampel
bawah permukaan tidak terkontaminasi oleh tanah permukaan.
Terakhir, perhatikan bahwa ada zona khusus tanah yang berada di bawah pengaruh akar tanaman.
Ini dikenal sebagai rhizosphere, yang sangat menarik bagi ahli mikrobiologi tanah dan ahli patologi
tanaman karena aktivitas mikroba yang ditingkatkan dan interaksimikroba tanaman tertentu (lihat
Bab 16). Tanah rhizosphere ada sebagai kontinum dari permukaan akar (rhizoplane) ke titik di mana
akar tidak memiliki pengaruh pada sifat mikroba (umumnya 210 mm). Dengan demikian, volume
tanah rhizosphere bervariasi dan sulit dicicipi. Biasanya, akar digali dengan hati-hati dan dikocok
dengan lembut untuk menghilangkan tanah massal atau nonrhizosfer. Tanah yang melekat pada
akar tanaman kemudian dianggap sebagai tanah rhizosphere. Meskipun ini adalah mekanisme
pengambilan sampel kasar, itu tetap utuh sampai hari ini. Akibatnya, pengambilan sampel
rhizosphere tetap merupakan keterbatasan eksperimental utama, terlepas dari kecanggihan analisis
mikroba yang dilakukan secarakuantit.

8.1.2 Strategi dan Metode Pengambilan Sampel untuk Bawah Permukaan

Pendekatan mekanis menggunakan rig bor diperlukan untuk mencicipi lingkungan bawah
permukaan. Ini secara signifikan meningkatkan biaya pengambilan sampel, terutama untuk bawah
permukaan yang dalam. Akibatnya, beberapa inti telah diambil di bawah permukaan yang dalam,
dan upaya coring ini telah melibatkan tim peneliti besar (lihat Studi Kasus 4.4). Pendekatan yang
digunakan untuk mencicipi lingkungan subpermukaan yang dalam atau dangkal tergantung pada
apakah bawah permukaan jenuh atau tidak jenuh. Untuk sistem tak jenuh, pengeboran putar udara
dapat digunakan untuk mendapatkan sampel dari kedalaman hingga beberapa ratus meter
(Chapelle, 1992). Dalam pengeboran putar udara, kompresor besar digunakan untuk memaksa udara
ke bawah pipa bor, keluar dari mata bor, dan di luar lubang bor (Gambar 8.3). Ketika laras inti
memotong ke bawah, udara berfungsi untuk meniup stek borehole keluar dari lubang dan juga
untuk mendinginkan laras inti. Ini penting, karena jika laras inti terlalu panas, mikroba dalam sampel
dapat disterilkan secara efektif, menimbulkan kesulitan untuk analisis mikroba berikutnya. Dalam
pengeboran udara normal, sejumlah kecil air yang mengandung surfaktan disuntikkan ke aliran
udara untuk mengontrol debu dan membantu mendinginkan bit bor. Namun, ini meningkatkan
kemungkinan kontaminasi, sehingga inti seperti yang dibor di Dataran Sungai Ular Idaho (lihat Bagian
4.6.2.1) telah dibor dengan udara saja (Colwell, 1989). Untuk membantu menjaga bar
intitetapdingin, coring hanya dilakukan sangat lambat untuk menghindari panas berlebih. Untuk
membantu menjaga kondisi steril dan mencegah kontaminasi dari udara permukaan, semua udara
yang digunakan dalam proses coring telah difilter melalui filter udara partikulasi efisiensi tinggi
(HEPA) efisiensi tinggi 0,3-μm (lihat Bagian 5.8.2). Segera setelah inti dikumpulkan lapisan
permukaan dikerok dengan spatula steril, dan kemudian subcore diambil menggunakan jarum
suntik plastik steril 60-ml dengan ujungnya dihilangkan. Sampelnya dibekukan dan dikirimke
laboratorium, di mana analisis mikroba dimulai dalam waktu 18 jam pengumpulan.

Lingkungan bawah permukaan jenuh dicicipi beberapaapa yang berbeda karena sedimenbanyak less
kohesif daripada yang ditemukan di daerah tak jenuh. Oleh karena itu, borehole harus diadakan
terbuka sehingga inti yang utuh dapat diambil dan dihapus pada setiap kedalaman yang diinginkan.
Untuk pengambilan sampel kedalaman hingga 30 m, pengeboran auger batang berongga dengan
pengambilan sampel tabung dorong banyak digunakan (Gambar 8,4). Auger terdiri dari tabung
berongga dengan sedikit berputar di ujung yang mengebor lubang. Bagian luar casing auger
berongga berulir terbalik sehingga stek didorong ke atas dan keluar dari lubang saat pengeboran
berlangsung. Ketika lubang bor dibor, casing auger dibiarkan di tempat untuk menjaga lubang bor
tetap terbuka. Dengan demikian, casing bertindak sebagai lengan di mana tabung kedua, laras inti,
dimasukkan untuk mengumpulkan sampel ketika kedalaman yang diinginkan telah tercapai. Laras
inti pada dasarnya adalah tabung steril yang ditempatkan di ujung auger batang berongga, didorong
ke bawah untuk mengumpulkan sampel sedimen, dan kemudian diambil. Pengeboran kemudian
dapat berlanjut ke kedalaman yang diinginkan berikutnya dan proses coring diulang. Setiap inti yang
dikumpulkan dibatasi, dibekukan dan dikirim ke laboratorium untuk dipelajari. Untuk menghindari
kontaminasi sampel, bagian luar inti dikikis atau intinya dapat disubkor.

Untuk inti yang lebih dalam dari 30 m, lumpur rotary coring digunakan (Chapelle, 1992). Dalam hal
ini, lubang kembali bosan menggunakan sedikit berputar. Namun, cairan pengeboran digunakan
untuk menghilangkan stek lubang borehole dan untuk menerapkan presyakin ke dinding lubang bor
untuk menjaganya dari runtuhnyaing. Pengeboran putar lumpur telah digunakan untuk
mendapatkan sampel sedimen hingga 1000 m di bawah permukaan tanah. Contoh inti seperti itu
adalah inti yang diambil dari sedi bawahpermukaanyang dalam dari Dataran Pesisir Tenggara di
South Carolina (lihat Studi Kasus 4.4). Selama coring ini, sampel diambil dari kedalaman mulai dari
400 hingga 500 m. Untuk memastikan integritas inti yang diperoleh, cairan pengeboran berduri
dengan dua pelacak, kalium bromida dan pewarna rhodamine. Penggunaan kedua pelacak ini
memungkinkan para peneliti untuk mengevaluasi seberapa jauh cairan pengeboran telah menembus
ke dalam inti. Setiap area inti yang terkontaminasi dengan pelacak harus dibuang. Inti diambil dalam
liner plastik, beku, dan dikirim untuk analisis immediate.

Penting untuk ditekankan bahwa coring baik lingkungan jenuhatau tidak jenuh adalah proses yang
sulit karena beberapa alasan. Pertama, mungkin perlu bertahun-tahun untuk merencanakan dan
mendapatkan pendanaan untuk melanjutkan dengan inti seperti yang dijelaskan di sini untuk
Dataran Sungai Ular dan Dataran Pesisir Tenggara. Pengeboran dan pemulihan sampel tersebut yang
sebenarnya adalah masalah rekayasa yang sophistication-nya baru disentuh di bagian ini. Juga perlu
diingat bahwa inti yang diperoleh tidak selalu benar-benar mewakili sedimen dari mana mereka
diambil. Misalnya, inti 1-m dapat dikompresi secaraakurat dalam proses coring sehingga sulit untuk
mengidentifikasi dengan tepat kedalaman dari mana ia diambil. Kesulitansec ond dalam
mendapatkan sampel perwakilan adalah karena heterogenitas horizontal dalam bahan bawah
permukaan. Heterogenitas seperti itu dapat berarti bahwa dua sampel yang diambil beberapa meter
terpisah mungkin memiliki karakteristik fisik, kimia danmikrobiologis yang sangat berbeda. Akhirnya,
untuk analisis mikroba tidak cukup hanya untuk mengambil sampel; logistik penyimpanan dan
analisis sampel juga harus dipertimbangkan.

8.1.3 Pemrosesan dan Penyimpanan Sampel

Analisis mikroba harus dilakukan segera setelah possible setelah pengumpulan tanah untuk
meminimalkan efek penyimpanan pada masyarakat mikroba. Setelah dihapus dari lapangan,
komunitas mikroba dalam sampel dapat dan akan berubah terlepas dari metode penyimpanan.
Pengurangan jumlah mikroba dan aktivitas mikroba telah dilaporkan bahkan ketika sampel tanah
disimpan dalam kondisi lembab lapangan pada 4C hanyaselama 3 bulan (Stotzky et al., 1962).
Menariknya dalam penelitian ini, meskipun komunitas bakteri berubah, munitas actinomycete com
tetap tidak berubah.

Langkah pertama dalam analisis mikroba sampel tanah permukaan biasanya melibatkan
pembungkaman melalui jaring 2 mm untuk menghilangkan batu besar dan puing-puing. Namun,
untuk melakukan ini, samples harus sering dikeringkan udara untuk memudahkan pengilasan. Ini
dapat diterima selama kadar air tanah tidak menjadi terlalu rendah, karena ini juga dapat mengubah
komunitas mikrobial (Berkilau dan Cheshire, 1979). Setelah menyedot, penyimpanan jangka pendek
harus di 4C sebelum analisis. Jika sampel disimpan, perawatan harus diambil untuk memastikan
bahwa sampel tidak mengering dan bahwa kondisi anaerobik tidak berkembang, karena ini juga
dapat mengubah komunitas mikroba. Penyimpanan hingga 21 hari tampaknya meninggalkan
sebagian besar sifat mikroba tanah tidak berubah (Wollum, 1994), tetapi sekali lagi waktu adalah
esensi sehubungan dengan analisis mikroba. Perhatikan bahwa pengambilan sampel rutin tanah
permukaan tidak memerlukan prosedur steril. Tanah-tanah ini terus-menerus terpapar atmosfer,
sehingga diasumsikan bahwa paparan seperti itu selama pengambilan sampel dan prosesbernyanyi
tidak akan mempengaruhi hasilnya secara signifikan.

Lebih banyak perawatan harus diambil dengan memproses sampel bawah permukaan karena tiga
alasan. Pertama, mereka memiliki jumlah budaya yang lebih rendah, yang berarti bahwa kontamina
mikrobaluar nant dapat secara signifikan mempengaruhi angka yang dihitung. Kedua, sedimen
bawah permukaan tidak secara rutin terpapar atmosfer, dan kontaminan mikroba di atmosfer
mungkin secara substansial berkontribusi pada jenis mikroba yang ditemukan. Ketiga, lebih mahal
untuk mendapatkan sampel wajah subsur,dan seringkali tidak ada kesempatan kedua di collection.
Sampel bawah permukaan yang diperoleh dengan coring segera dibekukan dan dikirim kembali ke
laboratorium sebagai inti utuh atau diproses di lokasi coring. Dalam kedua kasus, bagian luar inti
biasanya dikerok menggunakan spatula steril atau subcore diambil menggunakan jarum suntik
plastik diameter yang lebih kecil. Sampel kemudian ditempatkan dalam kantong plastik steril dan
dianalisis segera atau dibekukan untuk analisis di masa depan.

8.1.3.1 Pengolahan Sampel Tanah dan Sedimen untuk Bakteri

Analisis Berbasis Budaya

Metode analisis tradisional untuk ikatan komunimikrobabiasanya melibatkan alat tes budaya
menggunakan pengenceran dan metodologi pelapisan padamedia selektif dan berbedaatau tes
hitung langsung (lihat Bab 10). Hitungan langsung menawarkan informasi tentang jumlah total
bakteri yang ada, tetapi tidak memberikan informasi tentang number atau keragaman populasi yang
ada dalam perjalanannity. Jumlah piring memungkinkan enumerasi total populasi budaya atau
budaya yang dipilih, dan karenanya memberikan information pada berbagai populasi yang ada.
Namun, karena kurang dari 1% bakteri tanah mudah dikulte (Amann et al., 1995), informasi budaya
hanya menawarkan sepotong gambar. Fraksi sebenarnya dari bolak-balikyang dapat berbubu
budaya tergantung pada media yang dipilih untuk hitungan budaya. Setiap media tunggal akan
memilih untuk populasi yang paling cocok untuk media tertentu. Dengan demikian, pilihan medium
sangat penting dalam mencegah penambanganhasil yang diperoleh. Ini diilustrasikan oleh data
dalam Tabel 8.1, yang menunjukkan bahwa sedangkan jumlah langsung dari serangkaian sampel
sedimen yang mencakup kedalaman 5 m serupa, jumlah culturable bervariasi tergantung pada jenis
media yang digunakan. Media kaya gizi, PTYG, terbuat dari peptone, triptotase, ekstrak ragi dan
glukosa, secara konsisten memberikan hitungan yang satu hingga tiga pesanan besarnyalebih
rendahdari hitungan dari dua media nutrisi rendah yang berbeda yang diuji. Ini adalah pengenceran
PTYG 1:20 dan ekstrak tanah agar terbuat dari suspensi tanah permukaan 1:2. Data ini
mencerminkan fakta bahwa sebagian besar mikroba tanah ada di bawah kondisi nutrisi terbatas atau
oligotroksi.

Analisis DNA Komunitas

Dalam beberapa tahun terakhir, keuntungan mempelajari DNA komunitas yang diekstraksi dari
sampel tanah telah menjadi jelas (lihat Bab 13). Pendekatan berbasis nonkultur ini dianggap lebih
mewakili komunitas aktual yang hadir daripada pendekatan berbasis budaya. Selain informasi
providing tentang jenis populasi yang ada, pendekatan ini juga dapat memberikan informasi tentang
potensi genetik mereka. Seperti halnya teknik apa pun, ada gagasan limita pada data yang dapat
diperoleh dengan ekstraksi DNA. Oleh karena itu, banyak peneliti sekarang menggunakan ekstraksi
DNA bersama dengan jumlah langsung dan budaya untuk memaksimalkan data yang diperoleh dari
sampel lingkungan.

Awalnya, dua pendekatan dikembangkan untuk isolasi DNA bakteri dari sampel tanah. Yang pertama
didasarkan pada fraksinasi bakteri dari tanah diikuti dengan tesis sel dan ekstraksi DNA (Holben,
1994). Metode kedua yang terlibat dalam analisis situ bakteri dalam matriks tanah dengan ekstraksi
DNA berikutnya yang dilepaskan dari sel (Kotak Informasi 8.2). Selanjutnya untuk pengembangan
kedua pendekatan ini, dalam biisis situ telah menjadi primairprosedur ekstraksi yang
umumdigunakan karena lebih mudah dan lebih cepat, karena menghasilkan DNA yang lebih
representatif, dan karena kit komersial telah membuatnya lebih mudah untuk memurnikan DNA.

Metode in situ lysis melibatkan lising sel bakteri di dalam tanah dan melepaskan DNA mereka
sebelum ekstraksi DNA dari sampel. Metodologi Lysis biasanya melibatkan kombinasi perawatan fisik
dan chemical. Untuk bakteri, perawatan fisik telah melibatkan siklus pencairan bekudan / atau
sonikasi atau pemukulan manik-manik, dan perawatan kimia sering menggunakan deterjen seperti
natrium dodecyl sulfat (SDS) dan / atau enzim seperti lysozyme atau proteinase (More' et al., 1994).
Setelah lisis, puing-puing sel dan partikel tanah dihilangkan oleh curah hujan dan sentrifugasi, dan
DNA di supernatant diendapkan dengan etanol. DNA dapat dimurnikan lebih lanjut dengan sorpsi ke
kolom buatan sendiri atau komersial yang dikemas dengan resin atau gel pertukaran ion yang
kemudian dapat dibilas untuk menghilangkan bahan humic yang dapat menghambat analisis DNA.
Pemurnian lebih lanjut dapat dicapai dengan fenolkloroform / isoamyl alkohol ekstraktion, diikuti
sekali lagi denganpresipitasi etanol (Xia et al., 1995). Sampel DNA murni diperlukan untuk
memungkinkan analisis molekul berikutnya seperti dengan reaksi rantai polimerase (PCR) (lihat Bab
13). Namun, terlepas dari metodologi pemurnian apa yang digunakan, setiap langkah dalam proses
pemurnian menyebabkan hilangnya DNA. Dengan demikian, DNA yang dimurnikan hanya diperoleh
dengan mengorbankan hasil DNA.

Kit komersial, yang telah mengoptimalkan dures proceyang dijelaskan di atas, sekarang tersedia
untuk memproses tanah untuk DNA komunitas. Contoh kit tersebut adalah Ultracleant Soil DNA
Isolation Kit (MoBio) dan Fast DNA Spin for Soil (MP Biomedicals) (Gambar 8.5). Biasanya, kit ini
menggunakan manik-manik fisik mengalahkan ogy technol diikuti dengan lisis kimia mikroba dan
subsequent ekstraksi DNA dan pemurnian. Kit ini bahkan dapat digunakan untuk mengekstrak DNA
dari sampel lingkungan bahan organik tinggi termasuk kompos, sedimen, manures dan biosolid.
Tetapi dalam hal ini, kation purifitambahan dari DNA yang diekstraksi mungkin diperlukan di
persimpangandengankit. Salah satu pendekatan umum adalah berulang kali membilas DNA dengan
guanidine thiocyanate sementara itu disederasi ke kolom ekstraksi yang disediakan oleh kit. Secara
keseluruhan kit komersial ini telah secara dramatis meningkatkan kemudahan dan cepat ekstraksi
DNA masyarakat dari tanah. Perhatikan bahwa ada juga kit yang berhasilmengekstrak DNA
komunitas dari sampel air, misalnya, UltraCleant Water DNA Kit.

Meskipun lisis langsung menggunakan kit komersial memiliki banyak keuntungan, ia juga memiliki
beberapa masalah. Sorpsi DNA dari sel lysed oleh tanah liat atau koloid humik dapat mengurangi
hasil DNA yang diekstraksi (Ogram et al., 1987). Masalah lain yang terkait dengan lisis langsung
adalah distinguishing bebas dari DNA seluler. DNA gratis yang dilepaskan dari mikroba yang terisi
secara alami beberapa waktu sebelum ekstraksi DNA kadang-kadang dapat dilindungi dari
degradation dengan sorpsi ke partikel tanah (Lorentz dan Wackernagel, 1987). DNA ini dapat
diekstraksi bersama dengan DNA dari sel-sel yang layak. Selain itu, DNA isoyang terlambat oleh lisis
langsung cenderung dicukur secara acak karena prosedur pemukulan manik-manik yang terkait
dengan sebagian besar kittion ekstrac. Akhirnya, sebagian besar kit akan menglylas semua ism
mikroorgantanah termasuk jamur dan protozoa. Dengan demikian, DNA yang diekstrak tidak
terbatas pada DNA bakteri. Untungnya, jamur ( 105 per gram) dan protozoa ( 104 per gram) hadir
pada jumlah yang jauh lebih rendah di sebagian besar tanah, dan dengan demikian tidak akan
berkontribusi secara signifikan pada DNA yang diperoleh dari 108 109 bakteri per gram, bahkan
memungkinkan ukuran genom protozoa yang lebih besar.

Setelah sampel DNA yang dimurnikan diperoleh dari sampel tanah, itu dapat diukur dengantroskopi
spesifikasi ultraviolet (UV) atau fluorometri. Biasanya, pembacaan UV dilakukan pada panjang
gelombang 260 dan 280 nm, dari mana kemurnian dan kuantitas DNA dapat diperkirakan (Kotak
Informasi 8.3). Salah satu keterbatasan kuantifikasi oleh spektroskopi UV adalah bahwa pembacaan
akan dipengaruhi oleh senyawa apa pun yang menyerap pada 260 nm. Kuantifikasi oleh fluorometry
lebih sensitif dan lebih spesifik, tetapi tidak memungkinkan evaluasi kemurnian ekstrak yang
diperoleh denganmembandingkan pembacaan ing pada 260 dan 280 nm. Konsentrasi DNA
serendah 1 picogram per μl dapat diukur dengan rometer fluo menggunakan pewarna picogreen.

Setelah jumlah DNA per massa tanah diketahui, perkiraan dapat dibuat dari komunitas mikroba.
Untuk bakteri seperti Escherichia, kromosom khas mengandung 45 juta pasangan dasar, setara
dengan sekitar 9 fg (9 3 10215 g) DNA. Namun, jumlah DNA per sel bervariasi dan perkiraan lainnya
lebih rendah, sekitar 4 fg per sel. Jumlah DNA per sel juga dapat bervariasi karena replikasi
kromosom terjadi lebih cepat daripada pembagian sel, menghasilkan dua atau tiga kromosom per
sel (Krawiec dan Riley, 1990). Estimasi DNA teoritis ini dapat digunakan untuk menghubungkan total
DNA yang diekstrak dengan jumlah mikroba dalam sampel. Tabel 8.2 menunjukkan total DNA yang
diekstrak dari empat tanah yang diubah dengan glucose. Jumlah DNA yang diperoleh meningkat
dengan jumlah bahan organik tanah (silt loam dan loam), terutamakarena ikatan komuni bakteri
berkelanjutan yang lebihbesar. DNA yang diekstrak juga menurun di tanah tinggi tanah liat (tanah
liat loam), kemungkinan besar karena sorpsi DNA oleh koloid tanah (Ogram et al., 1987). Secara
keseluruhan, pengaruh amandemen dapat dilihat dari waktu ke waktu karena komunitas mikroba
menjadi lebih besar melalui pertumbuhan, menghasilkan DNA yang lebih dapat diekstraksi. Jumlah
teoritis sel bakteri yang diwakili DNA yang diekstraksi dapat dihitung seperti yang diilustrasikan di
bawah ini.

Misalnya, pada saat nol untuk tanah loam tanah liat:

DNA yang diekstrak 5 0:12 μg=g tanah

Oleh karena itu, jika setiap sel memiliki 4 fg DNA:

Jumlah sel 5 0:12 3 10 g21 DNA=g tanah 4 3 10 g215 DNA=sel 5 3:0 3 107 sel=g tanah

Nilai serupa pada saat nol untuk tanah lainnya adalah 1,6 3 108 sel/g tanah (sandy loam), 3,3 3 108
sel/g tanah (loam), dan 4,5 3 109 sel/g tanah (lumpur loam).

8.1.3.2 Pengolahan Sampel Tanah untuk Jamur Hyphae dan Spora

Seperti halnya bakteri, juga tidak mungkin untuk budaya semua species jamur layak dari tanah atau
sampel sedimen. Metode budaya untuk jamur dijelaskan dalam Bagian 10.5. Namun, beberapa
pendekatan telah dikembangkan untuk isolasi langsung hifa jamur atau spora dari tanah. Yang
pertama adalah metodologi pencucian tanah. Ini melibatkan saturating volume kecil tanah dengan
air steril. Agregat tanah digoda dengan lembut terbuka dengan jet air halus, memungkinkan partikel
tanah yang lebih berat untuk sedimen dan cles partiyang lebih halus untuk dimusyulikan. Prosedur
ini diulang beberapa kali sampai hanya partikel yang lebih berat yang tersisa. Ini kemudian tersebar
dalam film air steril dan diperiksa di bawah mikroskop yang membedah. Jarum steril atau sangat
halus untukceps kemudian dapat digunakan untuk mendapatkan hifa jamur yang diamati.

Untuk spora, pendekatan yang berbeda dapat digunakan. Sampel tanah ditempatkan dalam kotak
steril terpisah yang masing-masing berisi sejumlah saringan dengan ukuran yang dinilai. Ples
samtanah dicuci dengan kuat di setiap kotak, dan tanah dengan ukuran yang ditentukan
dipertahankan pada setiap saringan. Spora detered ditambangsecara empiris dengan melapisi
pencucian berturut-turut (dua menit per pencucian) dari setiap saringan. Karena hyphae
dipertahankan oleh saringan, setiap koloni jamur yang muncul harus karena adanya spora. Informasi
tentang jamur yang ada sebagai hyphae dapat diperoleh dengan melapisi partikel yang dicuci yang
dipertahankan oleh saringan. Namun, metode pencucian ini padat karya, dan mengandalkan coba-
coba dalam hal fraksi ukuran mana yang paling relevan sehubungan dengan ukuran spora individu.

8.1.3.3 Lumpur Pengolahan, Tanah dan Sedimen untuk Virus

Untuk menilai sepenuhnya dan memahami risiko dari patogen di lingkungan, perlu untuk
menentukan terjadinya mereka dalam lumpur limbah (biosolid), tanah di mana air limbah atau
lumpur diterapkan, atau sedimen laut yang mungkin dipengaruhi oleh limbah keluar atau
pembuangan lumpur. Bahkan, Badan Perlindungan Lingkungan AS saat ini membutuhkan
pemantauan lumpur untuk enterovirus untuk jenis aplikasi tanah tertentu. Untuk mendeteksi virus
pada pada padatan, pertama-tama perlu untuk mengekstraknya dengan proses yang akan
menyebabkan desorpsi mereka dari padat. Seperti halnyafiltermicropo rous (lihat Bagian 8.2.2.1),
virus diyakini terikat pada pada padatan ini dengan kombinasi gaya elektrostatik dan hidrofobik
(lihat Bab 15). Untuk memulihkan virus dari padatan, zat ditambahkan yang akan memecah
kekuatan-kekuatan menarik ini, memungkinkan virus untuk pulih dalam cairan yang menghindari
(Gerba dan Goyal, 1982; Berg, 1987).

Prosedur lumpur yang paling umum melibatkan pengumpulan lumpur 5001000 ml dan
menambahkan AlCl3 dan HCl untuk menyesuaikan pH menjadi 3,5. Dalam kondisi ini, virus mengikat
pada padatan lumpur, yang dihilangkan oleh sentrifugasi, dan kemudian diresuspended dalam
larutan ekstrak daging sapi di pH netral untuk menghindari virus. Eluate kemudian direkonsentrasi
oleh flocculation protein dalam ekstrak daging sapi pada pH 3,5, diresuspended dalam 20 50ml, dan
dinetralisir. Masalah utama dengan limbah lumpur concen trates disiapkan dengan cara ini adalah
bahwa mereka sering mengandung zat beracun untuk budaya sel. Diagram detail prosedur ini
diperlihatkan dalam Gambar 8.6. Teknik tion ekstrac serupa digunakan untuk pemulihan virus dari
tanah dan sedimen air (Hurst et al., 2007