ACARA III

TEKNIK ISOLASI DNA KROMOSOM DAN DNA PLASMID BAKTERI

A. Tujuan
mahasiswa memahami dan dapat melakukan isolasi DNA kromosom dan isolasi DNA plasmid.

B. Prinsip kerja
Isolasi DNA melalui penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat
seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.

C. Dasar Teori
DNA merupakan material genetik yang dimiliki makhluk hidup. DNA menyimpan informasi
genetic yang tertuang dalam urutan nukleotida. Setiap organisme memiliki DNA yang terletak
dalam inti sel atau nukleus yang disebut sebagai DNA kromosomal. Pada bakteri selain DNA
kromosomal, terdapat DNA ekstrakromosomal yaitu plasmid. Plasmid merupakan DNA
ekstrakromosomal yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal. Bentuk plasmid adalah
sirkuler double helix dengan ukuran 1 kb sampai lebih dari 200 kb. Pada bakteri jumlah plasmid
yang dimiliki bervariasi bahkan sampai ribuan ataupun tidak memiliki plasmid.
Karakteristik dari plasmid antara lain: dapat ditransfer ke bakteri lain dan memiliki ORI (Origin
of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Plasmid
merupakan potongan melingkar DNA yang ukuranya kecil (kurang lebih 2000 sampai 10000
pasangan basa) yang berisi informasi genetik yang penting untuk pertumbuhan bakteri.
Plasmid dapat dipindahkan antar sel bakteri dengan cara transformasi atau konjugasi. Penamaan
plasmid biasanya diawali dengan huruf “p” diikuti oleh serangkaian kode yang menunjukkan
identitas plasmid tersebut. Contoh plasmid yang umum digunakan sebagai vector adalah pUC18,
pUC19, pBR322. Vektor plasmid ini masing-masing membawa gen penanda resistensi terhadap
antibiotic untuk menseleksi koloni yang membawa plasmid dan yang tidak. Plasmid ini juga
Multiple Cloning Site (MCS) yang terletak pada gen lac Z sehingga memungkinkan utk melakukan
seleksi biru puth. Jika vector tersebut telah membawa gen tertentu, di belakang nama plasmid juga
disertakan keterangan mengenai gen yang dibawanya. Contoh pAP01(amyH) berarti plasmd hasil
konstruksi ini mengandung gen amyH.
Untuk isolasi plasmid metode yang digunakan sedikit berbeda dari isolasi genom total. Disini
dilakukan pemisahan antara DNA plasmid dari genom total. Metode yang umum digunakan adalah
lisis alkali atau sentrifugasi gradien CsCl. Dasar dari kedua metode ini adalah perbedaan ukuran
molekul DNA plasmid dengan DNA kromosom. Pada metode lisis alkali, sel bakteri dilisiskan
dalam suasana alkali sehingga dsDNA akan terdenaturasi menjadi ssDNA. Setelah dinetralkan
DNA plasmid yang berukuran jauh lebih kecil daripada DNA kromosom akan lebih cepat
berenaturasi. Selanjutnya kedua molekul DNA tersebut dapat dipisahkan dengan sentrifugasi.
Untuk mengisolasi DNA plasmid dapat digunakan kit yang terdapat dipasaran. Sebagian besar
kit ini menggunakan spin column untuk memisahkan DNA dari debris sel.

D. Alat dan Bahan

1. Kultur bakteri E coli dan E. coli JM109 (pUC18)
2. Kit ekstraksi DNA dalam praktikum ini digunakan Kit GeneJet Genomic DNA
purification dari Thermo Scientific
3. Kit isolasi plasmid
4. Etanol 70%
5. Mikrosentrifus
6. Tabung mikrosentifus 1,5 ml
7. Pipet mikro dan tips
8. Disposable gloves

E. Cara Kerja
Isolasi DNA dari bakteri gram negatif
1. Tumbuhkan bakteri selama 12 jam pada kondisi yang sesuai di shaking inkubator
2. Panen 1,5 mL kultur dalam tabung mikro dan sentrifus selama 10 menit pada kecepatan
5000xg
3. Resuspensi pellet dalam 180 uL digesti solution, tambahkan 20 uL proteinase K.
Homogenkan dengan vortex atau dengan cara membolak balikkan tabung
4. Inkubasi pada 56oC selama 30 mnt sampai sesekali dibolak balik.
 5. Tambahkan 20 uL RNAse A kemudian inkubasi selama 10 menit di suhu ruang
6. Tambahkan 200 uL lysis solution dan campurkan dengan vortex selama 15 detik.
Tambahkan 400 uL etanol 50% kemudian campurkan
7. Pindahkan lisat ke dalam spin colomn yang telah dimasukkan ke dalam collection tube,
sentrifus selama 1 menit pada 6000 g. Buang cairan yang tertampung pada collection
tube, letakkan kembali spin column pada collection tube.
8. Tambahkan 500 uL wash buffer I ( yang sudah ditambahi dengan etanol). Sentrifus
selama 1 menit pada 8000 g. Buang cairan yang tertampung dalam collection tube dan
kembalikan spin column
9. Tambahkan 500 uL wash buffer II (yang sudah ditambahi dengan etanol). Sentrifus
selama 3 menit pada kecepatan maksimum (12000 g). Optional : jika masih ada cairan
tertinggal dalam spin column (tidak turun ke collection tube), kosongkan collection
tube dan ulangi spin selama 1 menit.
10. Buang cairan dalam collection tube lalu pindahkan spin column ke dalam tabung mikro
1,5 mL yang baru dan steril
11. Tambahkan 200 uL elution buffer tepat di tengah membrane di spin column. Inkubasi
di suhu ruang selama 2 menit dalam kondisi tabung tegak. Selanjutnya sentrifus selama
1 menit pada 8000xg. Catatan : jika menginginkan DNA lebih terkonsentrasi maka
jumlah elution buffer dapat dinkurangi hingga 50 uL
12. Buang spin column dan beri label pada tabung mikro kemudian simpan di suhu -20oC.

Isolasi DNA Plasmid

1. Gores isolate bakteri yang mengandung plasmid pada medium LA kmdn inkubasi pada
suhu 37oC semalam
2. Pilih 1 koloni yang terpisah kemudian inokulasikan lagi ke media LB.
3. Inkubasikan kultur pada incubator shaker dengan suhu 37oC selama 12 – 16 jam.
4. Inokulasikan 1 ml kultur tersebut pada medium LB yang baru dan inkubasikan di
shaker dengan suhu 37oC selama 3 jam
5. Lakukan isolasi plasmid dari kultur tersebut menggunakan kit isolasi plasmid yang
tersedia dengan prosedur yang disediakan. Pada praktikum ini digunakan GeneJet
plasmid purification kit dari Thermoscientific.
================