ACARA IV

TEKNIK ANALISIS DNA DENGAN SPEKTROFOTOMETRI

A. Tujuan
mahasiswa memahami dan dapat melakukan analisis kualitatif dan kuantitatif DNA hasil
isolasi dengan metode spektrofotometri

B. Prinsip kerja
Menentukan konsentrasi DNA berdasarkan absorbansi pada panjang gelombang 260 nm yang
merupakan serapan panjang gelombang maksimal DNA.

C. Dasar Teori
Setelah melakukan prosedur isolasi, untuk dapat melanjutkan ke prosedur lainnya kita harus
memastikan kualitas dan kuantitas DNA yang kita peroleh. Proses lanjutan terhadap DNA ini
dapat berupa PCR ataupun digesti dengan enzim restriksi yang harganya relative mahal dan sangat
sensitive terhadap beberapa zat yang mungkin terbawa oleh DNA seperti pengotor.
Metode untuk menganalisis kualitas dan kuantitas DNA adalah spektrofotometri dengan alat
spektrofotometer UV yang mampu menera ikatan rangkap terkonjugasi pada DNA. Metode ini
dapat menentukan konsentrasi DNA berdasarkan absorbansi pada panjang gelombang 260 nm
yang merupakan serapan Panjang gelombang maksimum DNA. Konsentrasi DNA dapat dihitung
dengan cara 1 unit OD260 = 50ug DNA/ml (A260nm = 1 setara dengan 50 ug/mL DNA untai ganda).
Kualitas DNA dapat ditentukan dengan mengukur absorbansi pada Panjang gelombang 280 nm
yang merupakan serapan panjang gelombang maksimal dari Protein. Dengan demikian kita dapat
mengukur tingkat kemurnian DNA dengan rasio OD260/OD280. Preparasi DNA yang baik akan
menghasilkan rasio antara 1,8 – 2,0. Jika nilai rasio lebih kecil dari 1,8 berarti DNA kita
terkontaminasi protein atau fenol. Untuk kondisi demikian dapat dilakukan pemurnian lagi dengan
melakukan ekstraksi kloroform-isoamilalkohol (24 : 1) dan dilanjutkan denga presipitasi
menggunakan Na asetat 3M pH 4,8 (0,1 kali volume) dan etanol absolut (2 kali volume).
 -OD 260 x 100 (Faktor pengenceran) x 50 ug/mL
Konsentrasi DNA (ug/mL) =
1000

Konversi spektrofotometri dari asam nukleat :

1 A260 DNA untai ganda = 50 ug/mL
1 A260 DNA untai tunggal = 33 ug/mL
1 A260 RNA = 40 ug/mL

D. Alat dan Bahan

1. Spektrofotometer UV
2. DNA hasil isolasi

E. Cara Kerja
Selama mengerjakan proses ini wajib menggunakan gloves
1. Pipet 5 uL sampel DNA hasil isolasi tambahkan aquadest secukupnya sehingga volume
akhir menjadi 1 mL. Campur kemudian pindahkan ke dalam kuvet spektrofotometer
2. Blanko spektrofotometer dengan kuvet berisi 1 mL aquadest
3. Baca absorbansi sampel dengan spektrofotometer pada Panjang gelombang 260 nm
4. Lakukan pembacaan absorbansi yang kedua pada Panjang gelombang 280 nm
5. Tentukan rasio absorbansi pada Panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
6. Hitung konsentrasi DNA sampel dan tentukan konsentrasi DNA yang diperoleh

Catatan :
a. Konsentrasio DNA untai ganda pada Panjang gelombang 260 nm dengan absorbansi 1 =
50 ug/mL
b. DNA dinyatakan murni jika rasio A260/A280 = 1,8
c. Dalam menghitung jumlah DNA yang diperoleh perlu diperhitungkan factor pengenceran.

================