31S2204_PRAKTIKUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER

PEMOTONGAN DNA DENGAN ENZIM RESTRIKSI

Dalam teknologi DNA rekombinan atau kloning DNA, pemotongan DNA merupakan tahap yang
penting. Kloning adalah proses dimana suatu fragmen DNA disisipkan ke dalam suatu vektor
dan kemudian direplikasi untuk menghasilkan salinan DNA dalam jumlah yang banyak.
Pemotongan DNA dillakukan dengan enzim yang dikenal dengan enzim restriksi. Enzim restriksi
adalah enzim bakteri yang mengenali urutan nukleotida spesifik dalam DNA untai ganda dan
memotong DNA pada lokasi tersebut. Enzim restriksi memotong DNA menjadi fragmen-fragmen
dengan berbagai ukuran, bergantung pada jumlah situs pengenalan enzim dalam molekul DNA
tersebut. Enzim restriksi tipe II, yang digunakan dalam kloning, mengenali urutan pasangan basa
4 sampai 8 nukleotida dan memotong dalam urutan nukleotida tersebut. Urutan pasangan basa
yang dipotong oleh enzim restriksi tertentu dinamakan dengan urutan pengenalan enzim
retsriksi. Pada umumnya enzim restriksi memiliki urutan pengenalan yang disebut dengan
palindrom. Palindrom adalah urutan 4 sampai 6 pasangan basa yang sama pada kedua untai
jika dibaca pada arah yang sama (5’  3’). Hasil pemotongan enzim restriksi dapat memberikan
ujung runcing (sticky end) baik ujung 5’ atau ujung 3’, dan ujung tumpul (blunt end) bergantung
pada lokasi pemotongan pada urutan pengenalan.

Ujung runcing (Sticky end) Ujung tumpul (Blunt end)

Gambar 1. Contoh hasil pemotongan DNA dengan enzim restriksi

Enzim restriksi dinamakan sesuai dengan spesies bakteri dari mana enzim tersebut diisolasi.
Sebagai contoh, EcoRI adalah enzim restriksi yang diperoleh dari bakteri Escherichia coli galur
R, dan enzim HindIII dari bakteri Haemophilus influenzae galur D. Angka romawi menunjukkan
urutan penemuan enzim dari mikroorganisme tersebut. EcoRI adalah enzim restriksi pertama
diisolasi dari E. coli, sedangkan HindIII adalah enzim ketiga yang diisolasi dari H. influenzae.
Hasil pemotongan DNA dengan enzim restriksi akan memberikan fragmen-fragmen DNA yang
berbeda ukuran yang dapat dikarakterisasi pada elektroforesis gel agarosa.

Enzim restriksi pada umumnya bekerja pada suhu 37C dan pH 7,4 dan membutuhkan
bermacam-macam kekuatan ionik yang bergantung pada jenis enzimnya. Kondisi pH dan
kekuatan ionik pada umumnya disediakan di dalam buffer tertentu yang sesuai untuk enzim
restriksi tertentu.

RFK_INSTITUT TEKNOLOGI DEL 1

 31S2204_PRAKTIKUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER

1. Tujuan Percobaan

Melakukan pemotongan DNA kromosom dan DNA plasmid.

.

III. Alat dan Bahan :

1. Inkubator
2. Heating block
3. Tabung mikrosentrifuga
4. Mikropipet dan tip.
5. Enzim restriksi dan bufer

IV. Prosedur Percobaan

1. Campurkan bahan-bahan dengan komposisi seperti yang di bawah ini dalam tabung
mikrosentrifuga 1,5 ml

Akuades steril 5 L
RE 10X buffer 2 L
BSA 2 L
DNA (kromosom atau plasmid) 10 L
Enzim restriksi 1 L
Volume total 20 L

2. Homogenkan dengan mengetuk-ngetuk tabung dengan jari.

3. Inkubasi campuran pada suhu 37C selama 2 jam.

4. Hentikan reaksi dengan menginkubasi campuran pada suhu 65C selama 15 menit
pada heating block.

5. Hasil pemotongan dikarakterisasi dengan elektroforesis DNA gel agarosa.

REFERENSI
1. Brown T.A., 2010, Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 6th ed., Wiley-
Blackwell, UK.
2. Sambrook, 2001, Molecular Cloning A Laboratory Manual 3 rd ed Vol.1-3, Cold Spring
Harbor Laboratory Press.

RFK_INSTITUT TEKNOLOGI DEL 2