PENERAPAN SPEKTROSKOPI UV-VIS PADA PENENTUAN STRUKTUR

FLAVONOID
Spektroskopi UV-Vis merupakan metode utama yang digunakan untuk menganalisis struktur
flavonoid.
A. MENGAPA MENGGUNAKAN SPEKTRO UV?
1. Sampel yang dibutuhkan sedikit, biasanya 0.1 mg. Caranya: membuat sejumlah
larutan yang mengandung 0.1 mg sampel dengan pelarut methanol p.a (pro
analisis).
2. Informasi struktur yang diperoleh beragam (menggunakan pereaksi geser).
Pereaksi geser ini yang akan bereaksi dengan satu atau lebih gugus fungsi pada
struktur inti flavonoid. Sampel akan mengalami pergeseran
hipsokromik/batokromik. Umumnya yang terjadi batokromik.
Pereaksi geser:
a. Natrium metoksida (NaOMe)
Timbang sebanyak 2,5 gram logam Na dipotong kecil-kecil dan ditambahkan
ke dalam 100 mL metanol dengan hati-hati sehingga kadarnya 2,5% (b/v).
Larutan kemudian disimpan dalam botol kaca yang tertutup plastik.
b. Natrium asetat (NaOAc)
Untuk membuat pereaksi geser NaOAc, digunakan serbuk natrium asetan
anhidrat p.a (pro analisis).
c. Natrium asetat / asam borat (NaOAc / H3BO3)
Untuk membuat pereaksi geser NaOAc/H3BO3, digunakan serbuk
asam borat anhidrat dengan tingkat mutu p.a (pro analisis) atau tingkat mutu
AR.
Pengukuran spektrum NaOAc + H 3BO3 dilakukan dengan dua
cara tergantung dari hasil pengukuran spektrum NaOAc setelah 5 menit
apakah terjadi penguraian atau tidak.
● Bila tidak terjadi penguraian maka pengukuran spektrumnya dilakukan
dengan cara, sejumlah serbuk asam borat anhidrat ditambahkan ke dalam
kuvet yang berisi larutan sediaan pada pengukuran NaOAc, kemudian
dikocok dan diukur spektrumnya.
● Bila terjadi penguraian maka pengukuran spektrum dilakukan dengan cara
larutan sediaan ditambahkan 5 tetes pereaksi asam borat kemudian
dijenuhkan dengan NaOAc + H3BO3 setelah itu diukur panjang
gelombangnya.
d. Aluminium klorida (AlCl3)
Timbang sebanyak 5 gram AlCl3 segar dan kering ditambahkan dengan hati-
hati ke dalam 100 mL metanol sehingga kadarnya 5% (b/v). Tambahkan
 methanol sampai tanda batas dan dihomogenkan. Larutan kemudian
disimpan dalam botol plastik tertutup.
e. Aluminium klorida / asam klorida (AlCl3 /HCl)
Sejumlah 50 mL HCl pekat p.a (pro analisis) ditambahkan ke
dalam gelas piala. Kemudlian dilarukan dengan sedikit aquades. Pindahkan ke
dalam labu ukur 100 mL, tambahkan aquadest sampai tanda batas, lalu
homogenkan. Kadar antara HCl dan aquadest yaitu 50% (v/v).
Pengukuran spektrum dengan pereaksi geser AlCl3+HCl dilakukan
dengan cara, sebanyak 3 tetes pereaksi HCl ditambahkan ke dalam kuvet
yang berisi larutan sediaan dan AlCl3 , selanjutnya diukur panjang
gelombangnya.
B. SPEKTRUM UMUM FLAVONOID

Spektrum umum flavonoid, terdiri dari dua serapan maksimum atau dua pita.
Serapan maksimum pita II biasanya berada pada rentang Panjang gelombang 240-285
nm (berasal dari system Benzoil-Cincin A). Serapan maksimum pita I biasanya berada
pada rentang Panjang gelombang 300-400 nm (berasal dari system Sinamoil-Cincin
B).
 Untuk mengetahui keragaman struktur flavonoid, bisa menggunakan pereaksi
geser. Diatas merupakan contoh spektrum yang menggunakan penambahan pereaksi
geser. Garis melengkung yang nyambung, merupakan serapan awal. Garis
melengkung yang putus-putus, merupakan serapan sampel setelah ditambahakn
pereaksi geser. Bahwa terjadi pergeseran Panjang gelombang batokromik (gambar
diatas).

C. SPEKTRUM FLAVONOID DALAM METANOL

Methanol merupakan pelarut yang umum digunakan untuk melarutkan sampel
yang mengandung flavonoid. Metanol juga pelarut awal yang digunakan untuk
mengetahui spektrum awal untuk nanti dibandingkan spektrum yang akan ditambah
pereaksi geser.
1. FLAVON DAN FLAVONOL DALAM METANOL

● Serapan gelombang struktur flavon : 304-350 nm.

● Serapan gelombang struktur flavonol : 352-385 nm.
● Yang menjadi acuan dalam analisis flavon dan flavonoid, biasanya adalah
pada pita I.
● Semakin banyak oksigenasi, serapan Panjang gelombang serapan makin
besar dibandingkan dengan sampel yang memiliki substiuen oksigen yang
lebih sedikit.
● Pita I dipengaruhi oleh oksigenasi pada cincin B
 ● Pita II dipengaruhi oleh oksigenasi pada cincin A
● Metilasi (gugus metil) atau glikolasi (gugus gula) menyebabkan
hipsokromik (pergeseran biru / pergeseran gelombang yg lebih kecil),
khususnya pada pita I.:
⮚ 4’-OH: 3-10 nm (pita I)
⮚ 5-OH: 5-15 nm (pita I dan II)
⮚ 3-OH: 12-17 nm

Pengaruh oksigenasi pada pita I Pengaruh oksigenasi pada pita II

Galangin (3,5,7-triOH) = 359 nm Flavon = 250 nm
Kaempferol (3,5,7,4’-tetraOH) = 367 7-hidroksiflavon = 252 nm
nm
Kuersetin (3,5,7,3’,4’-pentaOH) = 370 5,7-dihidroksiflavon = 268 nm
nm
Mirisetin (3,5,7,3’,4’,5’-heksaOH) = 5,6,7- trihidroksiflavon = 274 nm
374 nm
2. ISOFLAVON, FLAVANON DAN DIHIDROFLAVONOL

● Pita II Isoflavon : 245-270 nm, sedangkan pita I: 300-340 nm.

● Pita II Flavon dan dihidroflavonol : 270-295 nm
● Oksigenasi pada cincin A menyebabkan batokromik (pergeseran merah) pada
pita II.
● Contoh senyawa 7,4’-dihidroksiisoflavon: 249 nm; senyawa 5,7,4’-trihidroksi
isoflavone: 261 nm. Bahwa senyawa yang memiliki substituen hidroksi atau
pola oksigenasii lebih banyak, biasanya memberikan serapan Panjang
gelombang maksimum yang lebih besar.
● Metilasi atau glikolasi akan menyebabkan hipsokromik
⮚ Glikolasi 5-OH (flavon) = 7-17 nm
⮚ Glikolasi 5-OH (flavanon dan dihidroflavonol) = 10-15 nm
● Contoh spektrum Isoflavon
 Pita I

Intensitas absorpsi dari pita I lebih kecil, sehingga keseluruhan spektrum

diatas terlihat bahwa pita I merupakan Pundak dari pita II.
3. KALKON DAN AURON DALAM METANOL

Ciri khas: serapan pita I yang lebih besar, sedangkan serapan pita II lebih kecil.

Kalkon Auron
Pita II : 220-270 nm Pita I: 370-430 nm

Pita I: 340-390 nm (puncak kecil/inflection

= 300-320 nm)
Peningkatan oksigenasi menyebabkan batokromik (terutama pada pita I)
Metilasi atau glikolasi pada 2’ = Metilasi atau glikolasi pada 7 =
hipsokromik 15-20 nm hipsokromik 18 nm
Contoh Spektrum Kalkon
Spektrum kalkon memiliki ci khas: intensitas serapan pita I lebih besar dibandingkan serapan
pita II

4. ANTOSIANIDIN DAN ANTOSIANIN DALAM METANOL

● Pita I: 465-550 nm, Pita II: 270-280 nm

● Peningkatan pola oksigenasi pada cincin B menyebabkan pergeseran
batokromik pita I
● Metilasi atau glikolasi menyebabkan hipsokromik

Antosianidin Antosianin
Pita I Pelargonidin (4’-OH) = 520 Pita I 3-glikosida pelargonidin =
nm 506 nm
Pita I Sianidin (3’, 4’-diOH) = 553 Pita I 3-glikosida sianidin = 525 nm
nm
Berarti, terjaadi hipsokromik ketika terjadi glikosilasi atau metilasi
D. PENGARUH PEREAKSI GESER NATRIUM METOKSIDA (NaOMe)
Semua hidroksi pada struktur inti flavonoid akan lebih terionisasi dengan penambahan
basa Natrium Metoksida. Sebagian besar akan mengalami pergeseran Panjang
gelombang pada kedua pita.
1. FLAVON DAN FLAVONOL

● 4’-OH = batokromik pita I 40-65 nm. (Cara baca :kemungkinan ada

hidroksi atau OH pada posisi 4’)
● 3-OH tanpa OH pada posisi 4’ : batokromik pita I 50-60 nm dengan
penurunan intensitas absorpsi. (Intensitas lebih kecil dibandingkan yang
awal dengan methanol)
● Glikolasi 7-OH (penambahan gugus gula): menghilangnya peak atau
puncak pada 320-330 nm
● OH pada 3,4’ dan atau 3,3’,4’ teroksidasi di dalam larutan NaOMe.
Sehingga pita spektrumnya akan menurun dengan seiringnya waktu.
2. ISOFLAVON, FLAVANON DAN DIHIDROFLAVONOL

● 5, 6, 7-OH dan 5,7,8-OH : penurunan intensitas spektrum (juga penanda 3’

dan 4’ OH pada isoflavone dan flavanon)
● 5,7-diOH pada flavanon dan dihidroflavonol : batokromik pita II 35-40
nm disertai peningkatan intensitas peak atau puncak setelah ditambahkan
pereaksi geser natrium metoksida. Ketika OH pada posisi 5 tidak ada,
kemungkinan pergeserannya mencapai 60 nm
3. KALKON DAN AURON
 Kalkon Auron
4’-OH: batokromik pada pita I 60- 4’-OH : batokromik pada pita I 80-95
100 nm (ciri khas: peningkatan nm (ciri khas: peningkatan intensitas
intensitas serapan) serapan)
2-OH atau 4’-OH (tanpa 4-OH): 6-OH-auron: batokromik pada pita I
batokromik pada pita I 60-100 nm 60-70 nm
(Ciri khas: tanpa peningkatan
intensitas serapan)
4. ANTOSIANIDIN DAN ANTOSIANIN

3-deoksiantosianidin : batokromik pada pita I 50-60 nm

E. PENGARUH PEREAKSI GESER NATRIUM ASETAT (NaOAc)
Natrium asetat adalah basa yang lebih lemah dibandingkan dengan Natrium
Metoksida. Cenderung mengionisasi secara signifikan hanya pada senyawa-senyawa
fenol.
1. FLAVON DAN FLAVONOL
 ● 7-OH: Batokromik pada pita II 5-20 nm setelah penambahan pereaksi
geser Natrium Asetat. Oksigenasi pada posisi 6 atau 8 pada flavon
mengurangi besaran nilai pergeserannya.
● Perbedaan spektrum antara NaOMe dan NaOAc untuk 4’-hidroksiflavon
dan flavonol bisa diketahui dengan mengecek ada/tidaknya 7-OH. Ketika
ada atau tersubstitusi, biasanya spektrum pita I Natrium Asetat akan
bergeser lebih besar dibandingkan Natrium Metoksida
● 5,6,7-, 5-7,8-, dan 3,3’,4’-trihidroksi menyebabkan spektrum NaOAc
menurun seiring waktu
2. ISOFLAVON, FLAVANON DAN DIHIDROFLAVONOL

● 7-OH pada isoflavone: batokromik pada pita II 6-20 nm setelah

penambahan pereaksi geser Natrium Asetat.
● 5,7-dihidroksiflavanon dan dihidroflavonol : batokromik 60 nm setelah
penambahan pereaksi geser Natrium Asetat.
● Kelompok sensitive basa pada cincin A menyebabkan spektrum NaOAc
menurun seiring waktu
3. KALKON DAN AURON

KALKON AURON
4-OH atau 4’-OH : batokromik pada 4-OH atau 6-OH : batokromik pada
pita I pita I
F. PENGARUH PEREAKSI GESER NATRIUM ASETAT-ASAM BORAT
Campuran ini biasanya digunakan untuk mendeteksi kelompok dihidroksi pada semua
flavonoid kecuali pada antosianidin dan antosianin.
1. FLAVON DAN FLAVONOL
 ● o-dihidroksi flavon dan flavonol pada cincin B : batokromik pada pita I
12-30 nm
● o-dihidroksi pada cincin A (6, 7 atau 7,8): batokromik yang lebih kecil
pada pita I
2. ISOFLAVON, FLAVANON DAN DIHIDROFLAVONOL

o-dihidroksi pada isoflavone, flavanon dan dihidroflavonol (pada cincin A) :

batokromik pita II 10-15 nm
3. KALKON DAN AURON

● o-dihidroksi pada kalkon dan auron (pada cincin B): batokromik sebesar
28-36 nm
● o-dihidrosi pada cincin A: batokromik yang lebih kecil pada pita I
G. PENGARUH PEREAKSI GESER ALUMINIUM KLORIDA (AlCl3 /HCl)
Aluminium klorida akan membentuk elat dengan flavonoid dan hasil dari reaksi ini
akan menyebabkan pergeseran batokromik pada spektrum pita I dan pita II
1. FLAVON DAN FLAVONOL
 ● 5-OH (tanpa OH pada posisi 3) : batokromik pada pita I sebesar 35-55 nm
(penambahan AlCl3/HCl). Jika pergeseran batokromiknya hanya 17-20 nm
menunjukkan adanya 6-oksigenasi (6-OH)
● Flavon dengan 3 atau 3 dan 5 OH (di-OH) : batokromik pada pita I 50-60
(penambahan AlCl3/HCl)
● o-dihidroksi (pada cincin B) : batokromik pada pita I sebesar 30-40 nm
(penambahan AlCl3)
2. ISOFLAVON, FLAVANON DAN DIHIDROFLAVANOL

● 5-OH : batokromik pita II 10-14 nm (isoflavone) dan 20-26 nm (flavanon

dan dihidroflavonol) (dengan pereaksi geser AlCl3/HCl)
● o-dihidroksi yang dapat dideteksi hanya pada cincin A ( 6,7 atau 7,8) :
batokromik pita II 11-30 nm (dengan pereaksi geser AlCl3). pergeseran ini
bisa lebih besar jika pereaksi geser yang digunakan yaitu AlCl3/HCl
● 3-OH pada dihidroflavonol (tanpa 5-OH) : batokromik pita II 30-38 nm
(dengan pereaksi geser AlCl3)
3. KALKON DAN AURON

● 2’-OH (kalkon) : batokromik pada pita I sebesar 48-64 nm (dengan

pereaksi geser AlCl3/HCl)
 ● 4-OH (auron) : batokromik pada pita I sebesar 60-70 nm (dengan pereaksi
geser AlCl3/HCl)
● Pergeseran ini biasanya akan berkurang sekitar 40 nm, jika pada struktur
kalkon terdapat oksigenasi pada posisi 3’ (3’-OH)
● o-dihidroksi (cincin B) : batokromik pada pita I sebesar 40-70 nm (dengan
pereaksi geser AlCl3). Pergeseran akan lebih besar jika menggunakan
pereaksi geser AlCl3/HCl.
● o-dihidroksi (cincin A) : batokromik dengan nilai pergeseran lebih kecil.
4. ANTOSIANIDIN DAN ANTOSIANIN

o-dihidroksi : batokromik pada pita I sebesar 25-35 nm pada pH 2-4