PROPOSAL SKRIPSI

UJI TOKSISITAS AKUT MINYAK ATSIRI RIMPANG

BANGLE (ZINGIBER MONTANUM) DENGAN
METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT)

ATUR PUJA GUSTI

1710015002

PROGRAM STUDI KEDOKTERAN

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS MULAWARMAN
SAMARINDA
2021
 PROPOSAL SKRIPSI

UJI TOKSISITAS AKUT MINYAK ATSIRI RIMPANG

BANGLE (ZINGIBER MONTANUM) DENGAN
METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT)

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran
(S.Ked.)

ATUR PUJA GUSTI

1710015002

PROGRAM STUDI KEDOKTERAN

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS MULAWARMAN
SAMARINDA
2021

2
3
 AHAN PROPOSAL

DAFTAR ISI

Hal.
HALAMAN SAMPUL............................................................................................i
HALAMAN JUDUL..............................................................................................ii
LEMBAR PENGESAHAN PROPOSAL...........................................................iii
DAFTAR ISI..........................................................................................................iv
DAFTAR TABEL.................................................................................................vi
DAFTAR GAMBAR............................................................................................vii
DAFTAR SINGKATAN....................................................................................viii
BAB I PENDAHULUAN.......................................................................................1
1.1. Latar Belakang Masalah....................................................................................1
1.2. Rumusan Masalah.............................................................................................3
1.3. Tujuan Penelitian..............................................................................................3
1.4. Manfaat Penelitian............................................................................................3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA............................................................................5
2.1. Bangle (Zingiber montanum)............................................................................5
2.1.1. Klasifikasi.......................................................................................................5
2.1.2. Morfologi Tanaman........................................................................................5
2.1.3. Kandungan Kimia...........................................................................................6
2.1.4. Khasiat Tanaman............................................................................................7
2.2. Minyak Atsiri....................................................................................................9
2.3. Ekstraksi Minyak Atsiri....................................................................................9
2.3.1. Hidrodistilasi................................................................................................10
2.3.2. Steam Distilation..........................................................................................10
2.3.3. Ekstraksi Pelarut...........................................................................................11
2.4. Uji Toksisitas Akut Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).................12
2.5. Kerangka Teori................................................................................................15
BAB III KERANGKA KONSEP........................................................................16
3.1. Kerangka Konsep............................................................................................16
BAB IV METODE PENELITIAN.....................................................................17
4.1. Desain Penelitian.............................................................................................17
4.2. Lokasi dan Waktu Penelitian..........................................................................17
4.3. Populasi dan Sampel Penelitian......................................................................17
4.3.1. Populasi........................................................................................................17
4.3.2. Sampel..........................................................................................................17
4.3.3. Besar Sampel................................................................................................17
4.4. Alat dan Bahan................................................................................................18
4.5. Prosedur Penelitian..........................................................................................18
4.5.1. Persiapan Minyak Atsiri Rimpang Bangle...................................................18
4.5.2. Uji Toksisitas Akut.......................................................................................19
4.5.2.1. Penyiapan larva Udang.............................................................................19
4.5.2.2. Pelaksanaan Uji.........................................................................................19
4.6. Identifikasi Variabel........................................................................................20

4
4.7. Definisi Operasional........................................................................................21
4.8. Analisis Data...................................................................................................21
4.9. Alur Penelitian................................................................................................22
4.10. Jadwal Penelitian..........................................................................................23
DAFTAR PUSTAKA...........................................................................................24

5
 DAFTAR TABEL

Hal.
Tabel 2.1. Aktivitas Sitotoksisitas.........................................................................14
Tabel 4.1. Definisi Operasional.............................................................................21
Tabel 4.2. Rencana Jadwal Penelitian...................................................................23

6
 DAFTAR GAMBAR

Hal.
Gambar 2.1. Tanaman Bangle dan Rimpang Bangle.............................................6
Gambar 2.2. Skema Alat Hidrodistilasi................................................................10
Gambar 2.3. Skema Alat Distilasi Uap................................................................11
Gambar 2.4. Skema Alat Ekstraksi Pelarut..........................................................11
Gambar 2.5. Skema Kerangka Teori....................................................................15
Gambar 3.1. Skema Kerangka Konsep.................................................................16
Gambar 4.1. Skema Alur Penelitian.....................................................................22

7
 DAFTAR SINGKATAN

ATP : Adenosine Triphosphate

BPOM : Badan Pengawas Obat dan Makanan
BSLT : Brine Shrimp Lethality Test
LC50 : Lethal Concentration-50
DF : Degrees of Freedom
DMF : Dimetilformamida
DMPBD : (E)-1-(3,4-dimethoxyphenyl) butadiene
DMSO : Dimetilsulfoksid

8
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Masalah

Indonesia merupakan negara tropis yang memiliki kekayaan dan potensi alam
yang sangat besar. Berbagai tanaman yang tumbuh di Indonesia memiliki potensi
besar untuk digunakan sebagai tanaman obat. Diperkirakan terdapat > 940 spesies
tanaman obat yang hidup di tanah Indonesia. Tanaman obat tersebut telah lama
digunakan oleh masyarakat sebagai obat tradisional, sebelum masuknya ilmu
pengetahuan kedokteran (Kusmana, 2015). Hingga saat ini, beberapa tanaman
masih dipercaya masyarakat memiliki khasiat untuk mengobati penyakit tertentu.
Salah satu tanaman obat yang banyak digunakan untuk mengobati berbagai
penyakit pada masyarakat adalah bangle (Zingiber montanum).

Bangle (Zingiber montanum) merupakan salah satu tanaman obat yang dapat
ditemukan hampir di seluruh daerah di Indonesia. Tanaman ini termasuk dalam
famili Zingiberaceae dan rimpangnya mengandung berbagai senyawa yang
memiliki potensi sebagai bahan aktif obat, seperti terpenoid, fenolik, curcuminoid,
flavonoid, dan minyak atsiri (Wang et al., 2015). Beberapa penelitian sebelumnya
menunjukkan bahwa tanaman bangle dengan spesies yang berbeda bermanfaat
sebagai anti bakteri, anti jamur, dan anti oksidan (Batubara et al., 2016). Di
masyarakat, rimpang tanaman ini umumnya digunakan untuk mengobati nyeri
otot, luka, batuk, dan asma. Ekstrak rimpang bangle diketahui mengandung
minyak atsiri dengan senyawa utama berupa sabinene, terpinen-4-ol, γ-terpinene,
dan (E)-1-(3,4-dimethoxyphenyl) butadiene (DMPBD). Minyak atsiri rimpang
bangle inilah yang diduga memiliki efek toksik pada dosis tertentu. Untuk
memastikannya, perlu dilakukan uji toksisitas akut menggunakan metode Brine
Shrimp Lethality Test (BLST) (Mahfud et al., 2017).

Sebuah penelitian yang dilakukan oleh Noviyanto (2020) di Universitas

Negeri Gorontalo. Penelitian tersebut mendapati bahwa rimpang bangle (Zingiber

1
purpureum) efektif digunakan sebagai anti mikroba bagi bakteri Pseudomonas
aeruginosa pada konsentrasi 40%. Zat yang diduga memiliki efek anti mikroba
adalah flavonoid, saponin, tanin, dan alkaloid (Noviyanto et al., 2020). Hasil
penelitian ini juga didukung oleh sebuah penelitian yang dilakukan oleh Pratiwi
(2017) di Universitas Medan Area yang menyampaikan kesimpulan serupa
(Pratiwi, 2017). Penelitian lain yang juga mendukung hasil penelitian ini adalah
sebuah penelitian yang dilakukan oleh Buldani (2017) di Politeknik Harapan
Bangsa Tegal. Penelitian tersebut mendapati bahwa ekstrak rimpang bangle
(Zingiber cassumunar) efektif digunakan sebagai anti mikroba bagi bakteri Vibrio
cholerae dan Staphylococcus aureus (Buldani, 2017).

Penelitian uji toksisitas rimpang bangle (Zingiber cassumunar) oleh

Koontongkaew (2014) di Universitas Thammasat Phatumtani. Penelitian tersebut
tidak menunjukkan efek toksik pada tikus dengan pemberian secara oral.
Penelitian lain yang dilakukan oleh Kato (2018) di BoZo Research Center Tokyo.
Penelitian tersebut juga tidak mendapati rimpang bangle (Zingiber purpureum)
memberikan efek toksik pada hewan uji. Sementara itu, penelitian toksisitas dari
bangle spesies Zingiber montanum belum pernah dilakukan.

Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan salah satu metode yang
digunakan untuk menilai toksisitas akut dari suatu ekstrak tanaman. Metode ini
relatif murah dan sederhana karena hanya memerlukan bahan uji utama berupa
larva udang Artemia salina. Karena kelebihannya ini, metode BSLT sering
digunakan sebagai uji pendahuluan atau skrining oleh beberapa penelitian yang
menginvestigasi toksisitas akut dari suatu ekstrak tanaman. Apabila pengujian
suatu ekstrak tanaman menggunakan metode ini menunjukkan hasil yang baik,
maka ekstrak tanaman tersebut dapat menjalani pengujian lebih lanjut (Sarah et
al., 2017). Hasil akhir dari pengujian ini adalah nilai Lethal Concentration-50
(LC50) yang mana dikatakan tidak toksik apabila nilai LC50>1000 µg/mL.

Penggunaan Artemia salina dalam uji toksisitas berkaitan dengan masalah

etikal, mengganti hewan uji seperti tikus dan mencit dengan model alternatif

2
lainnya sangat penting. Efektivitas Artemia salina bioassay untuk memprediksi
toksisitas ekstrak tumbuhan dievaluasi dengan membandingkan hasil LC50 untuk
Artemia salina dengan hasil LD50 untuk toksisitas akut pada tikus dan mencit.
Telah ditunjukkan bahwa ada korelasi yang baik antara hasil LC 50 yang diperoleh
dari penelitian pemberian secara oral pada tikus dari ekstrak berbagai spesies
tanaman dan hasil LC50 diperoleh dengan paparan 24 jam air garam pada
Artemia salina (Hamidi et al., 2014)

Berdasarkan uraian di atas, terlihat bahwa Indonesia merupakan salah satu

negara yang memiliki kekayaan alam yang luar biasa, termasuk dalam hal potensi
tanaman obat. Salah satu tanaman obat yang diduga memiliki potensi sebagai
bahan baku obat adalah bangle (Zingiber montanum) dengan kandungan minyak
atsiri di dalamnya. Namun, penggunaan tanaman sebagai suatu bahan baku obat
yang akan digunakan dalam pengobatan manusia wajib dilakukan uji toksisitas
untuk mengatahui keamanannya. Metode BSLT merupakan salah satu metode uji
toksisitas yang murah dan sederhana. Oleh sebab itu, peneliti tertarik melakukan
penelitian ini sekaligus membuat penelitian ini penting untuk dilakukan.

1.2. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang tersebut, penulis menetapkan rumusan masalah
penelitian sebagai berikut: “Apakah hasil uji toksisitas akut minyak atsiri rimpang
bangle (Zingiber montanum) aman terhadap larva artemia salina?”

1.3. Tujuan Penelitian

Untuk mengetahui toksisitas akut minyak atsiri rimpang bangle (Zingiber
montanum) dengan Metode BSLT.

1.4. Manfaat Penelitian

1. Bagi masyarakat, hasil penelitian ini dapat menjadi informasi bagi masyarakat
mengenai manfaat dari salah satu tanaman obat yang cukup sering ditemukan
di Indonesia, yaitu bangle

3
2. Bagi ilmu pengetahuan, hasil penelitian ini dapat menjadi kontribusi ilmiah,
terutama dalam bidang fitofarmaka serta dapat menjadi landasan teori
dilakukannya penelitian selanjutnya
3. Bagi peneliti, penelitian ini dapat menjadi sarana untuk memperdalam
keilmuan dalam bidang fitofarmaka, farmakologi, dan penulisan karya tulis
ilmiah

4
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Bangle (Zingiber montanum)

2.1.1. Klasifikasi
Kedudukan Bangle (Zingiber montanum) dalam sistematika tanaman
(taksonomi) adalah sebagai berikut (Kubo et al., 2015):

Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Liliopsida
Ordo : Zingiberales
Family : Zingiberaceae
Genus : Zingiber
Spesies : Zingiber montanum

2.1.2. Morfologi Tanaman

Tanaman bangle merupakan herba berumur tahunan. Tanaman bangle
bersifat adaptif, dapat hidup di dataran rendah hingga daerah dengan
ketinggian 1.300 m di atas permukaan laut. Bangle dapat dibudidayakan di
pekarangan yang cukup terkena sinar matahari. Bangle untuk
pertumbuhannya memerlukan tanah yang subur, gembur, cukup sinar
matahari, dan memerlukan jarak tanam yang cukup luas yaitu 50 x 50 cm.
Batang bangle tumbuh tegak dan memiliki rumpun yang rapat. Tinggi
tanaman bangle dapat mencapai 1,2-1,8 m. Batang semu bangle tersusun atas
kumpulan dari pelepah daun. Meskipun daun bangle berpelepah, daun bangle
tidak memiliki tangkai, atau disebut daun duduk. Letak daun bangle tersusun
secara menyirip berseling. Bentuk daun bangle lanset ramping, meruncing ke
ujung, dan mengecil ke pangkal. Panjang daun bangle mencapai 23-53 cm
dan lebar daun 2-3,2 cm. Permukaan daun bangle lemas, tipis, dan licin tidak
berbulu, tetapi punggung daun bangle berbulu halus. Bagian tumbuhan yang
dimanfaatkan adalah rimpang. Pada rimpang bangle yang sudah tua akan
berwarna kuning, terasa pedas dan pahit, serta berbau tidak enak. Kandungan
senyawa kimia di dalam rimpang Bangle antara lain: alkaloid, flavonoid,
minyak atsiri, saponin, pati, tanin, steroid/triflavonoid, lemak, dan gula serta
sineol dan pinen (Aeni et al., 2017).

Gambar 2.1. Tanaman Bangle dan Rimpang Bangle

2.1.3. Kandungan Kimia

Minyak atsiri memiliki aktivitas antivirus, antifungi, antiinflamasi, dan
sitotoksik. Minyak atsiri mengandung sabinene, terpinen-4-ol, γ-terpinene,
dan (E)-1-(3,4-dimethoxyphenyl) butadiene (DMPBD). Minyak atsiri
merupakan kandungan khas tumbuhan hijau dengan mengecualikan alga.
Minyak atsiri sebenarnya terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk
daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, nectar, bunga, buah dan biji. Penyebaran
jenis minyak atsiri pada golongan tumbuhan yang terbesar, yaitu
angiospermae (Wulandari, 2018).

Minyak atsiri adalah senyawa polar yang larut dalam pelarut polar
seperti etanol, metanol, butanol, air, dimetilsulfoksida (DMSO) dan
dimetilformamida (DMF). Gula yang terikat pada minyak atsiri (bentuk
umum yang ditemukan) menyebabkan minyak atsiri lebih mudah larut dalam
air, sehingga campuran pelarut di atas dengan air merupakan pelarut yang
lebih baik untuk glikosida. Aglikon yang kurang polar seperti isoflavon,

6
flavanon, flavonol dan flavon larut dalam pelarut semipolar seperti etil asetat
dan aseton. Senyawa minyak atsiri juga dapat menghambat penggumpalan
keping-keping sel darah, merangsang produksi nitrit oksida yang dapat
melebarkan (relaksasi) pembuluh darah, dan juga dapat menghambat
pertumbuhan sel kanker (Wulandari, 2018).

2.1.4. Khasiat Tanaman

Bangle memiliki rasa yang agak pahit, agak pedas, dan ciri yang sangat
khas dari tanaman obat ini adalah bau/aromanya yang cukup menyengat.
Cukup banyak yang menyukai aroma tanaman bangle, terutaman ibu-ibu.
Bangle memiliki khasiat sebagai penurun panas (antipiretik), peluruh kentut
(karminatif), peluruh dahak (ekspektoran), pembersih darah, pencahar
(laksatif), antioksidan, dan obat cacing (vermifuge). Bangle mengandung
senyawa kimia yang berkhasiat antiinflamasi dan antiedema seperti (E)-1-
(3,4-dimethoxyphenyl)-butena dan (E)-1-(3,4- dimethoxyphenyl)-butadiena
(DMPBD). Ekstrak rimpang bangle terbukti memiliki efek mukolitik
(berfungsi sebagai obat yang dapat mengencerkan sekret saluran napas),
sehingga mengurangi kekentalan dahak dan dapat digunakan sebagai obat
batuk tradisional (Nasution et al., 2020)

Skrining fitokimia kandungan rimpang bangle (Zingiber purpeurum)

yang dilakukan oleh Astarina dkk (2013) menemukan kandungan golongan
senyawa flavonoid, saponin, tanin, triterpenoid, dan minyak atsiri.

Flavonoid diketahui memiliki aktivitas sebagai antivirus, antifungi,

antiinflamasi dan sitotoksik. Mekanisme kerja flavonoid menghambat fungsi
membran sel adalah membentuk senyawa kompleks dengan protein
ekstraseluler dan terlarut sehingga menyebabkan keluarnya senyawa
intraseluler akibat dari rusaknya memran sel bakteri. Flavonoid juga memiliki
mekanisme kerja menghambang fungsi membran sel dengan cara
mengganggu permebealitas membran sel dan menghambat ikatan enzim.
Flavonoid diketahui dapat berikatan dengan subunit γ dan menghalangi

7
rotasinya sehingga menghambat sintesis Adenosine Triphosphate (ATP)
(Sari, 2016).

Saponin memiliki mekanisme kerja merusak membran sel dan

komponen selular bakteri yang mengakibatkan kematian sel sehingga
menghambat pertumbuhan dari bakteri. Aktivitas Saponin pada membran sel
bakteri adalah menurunkan tegangan permukaan dinding sel bakteri dan
merusak permeabilitas memban. Saponin dapat berdifusi melalui membran
luar dan dinding sel menyebabkan kebocoran sitoplasma akibat dari
pengingatan membran sitoplasma sehingga mengganggu dan mengurangi
kestabilan memban sel (Rijayanti, 2014).

Tanin bersifat toksik terhadap jamur, bakteri, dan khamir. Mekanisme

antimikroba tanin berupa aktivitas langsung pada membran sel bakteri,
penghambatan enzim, pengambilan substrat dan ion logam yang dibutuhkan
untuk pertumbuhan mikroba. Efek antibakteri tanin diketahui bekerja melalui
reaksi dengan membran sel, inaktivasi enzim dan inaktivasi fugsi materi
genetik. Paparan tanin pada sel bakteri menunjukkan terbentuknya gugus
yang menandakan kematian bakteri, hal ini terjadi dikarenakan aktivitas
tanin pada permukaan bakteri dan menginduksi sel bakteri untuk bergabung
(Sari, 2016).

Triterpenoid/steroid mempunyai mekanisme sebagai antibakteri

berhubungan dengan membran lipid dan sensitivitas terhadap komponen
steroid yang menyebabkan kebocoran pada liposom. Interaksi steroid dengan
membran fosfolipid sel yang bersifat permeabel terhadap senyawa-senyawa
lipofilik menyebabkan menurunnya integritas serta perubahan morfologi
membran sel yang menyebabkan sel rapuh dan lisis (Rijayanti, 2014).

Meski memiliki banyak khasiat, tanaman bangle di Indonesia semakin

kurang familiar (diketahui banyak orang) dan dikesampingkan oleh
masyarakat. Selain memiliki khasiat sebagai obat tradisional, tanaman bangle
juga dapat digunakan sebagai aroma-terapi, bumbu dapur, insektisida alami

8
 dan juga bahan campuran untuk parfum mawar. Teknologi-tekologi tersebut
telah banyak di kembangkan di Negara-negara yang teknologi pertaniannya
sudah maju seperti Bangladesh, India, dan Thailand. Aroma yang khas dari
tanaman bangle berasal dari minyak atsiri yang terkandung di dalamnya.
Kandungan minyak atsiri pada bangle dalam kondisi bobot kering adalah
1.12 – 3.35% (Nasution et al., 2020).

2.2. Minyak Atsiri

Minyak atsiri adalah cairan hidrofobik pekat yang mengandung senyawa

aroma yang mudah menguap dari tanaman. Keunggulan minyak atsiri adalah
konsentrasi rasa dan kesamaannya dengan sumber yang sesuai. Mayoritas
diantaranya cukup stabil dan mengandung antioksidan alami serta antimikroba
alami (Somesh et al., 2015). 

Minyak atsiri biasanya tidak berwarna, terutama saat masih segar. Namun
seiring bertambahnya waktu penyimpanan minyak atsiri dapat teroksidasi yang
mengakibatkan warnanya menjadi lebih gelap. Oleh karena itu, minyak atsiri
perlu disimpan di tempat sejuk dan kering yang tertutup rapat dan sebaiknya
disimpan penuh dalam wadah kaca kuning. Minyak atsiri digunakan dalam
wewangian, aromaterapi, kosmetik, dupa, obat-obatan, produk pembersih rumah
tangga dan untuk membumbui makanan dan minuman. Minyak atsiri berasal dari
berbagai bagian tumbuhan. Minyak atsiri biasanya dipisahkan dari fasa air dengan
metode fisik yang tidak menyebabkan perubahan signifikan dalam komposisi
kimianya. Minyak atsiri adalah cairan aromatik berminyak yang diekstrak dari
bahan tanaman aromatik. Mereka dapat dibiosintesis di organ tumbuhan yang
berbeda sebagai metabolit sekunder (El Asbahani et al., 2015).

2.3. Ekstraksi Minyak Atsiri

Ada beberapa metode ekstraksi minyak atsiri. Teknologi pemrosesan minyak

atsiri memiliki signifikansi yang melimpah, banyak digunakan, dan umum
digunakan diantaranya adalah hidrodistilasi, steam destilalation/ distilasi kukus,
dan ekstraksi pelarut (Rassem et al., 2016).

9
2.3.1. Hidrodistilasi

Hidrodistilasi adalah metode tradisional untuk menghilangkan minyak

esensial. Metode ini adalah salah satu metode tertua dan termudah.
Hidrodistilasi biasanya digunakan untuk mengisolasi minyak atsiri dari
tanaman aromatik dan obat. Proses hidrodistilasi adalah dimana minyak atsiri
diuapkan dengan memanaskan campuran air atau pelarut lain dan bahan
tanaman diikuti dengan pencairan uap dalam kondensor. Kondensor beserta
tabung kondensor berfungsi untuk mengumpulkan kondensat dan untuk
memisahkan minyak esensial dari air, masing-masing. Prinsip ekstraksi
didasarkan pada distilasi isotropik. Faktanya, pada tekanan atmosfer dan
selama proses ekstraksi (pemanasan), air atau molekul pelarut dan minyak
lainnya (Rassem et al., 2016).

Gambar 2.2. Skema alat hidrodistilasi

2.3.2. Steam Distilation

Distilasi uap adalah jenis distilasi untuk tanaman yang peka terhadap
suhu seperti senyawa aromatik alami. Distilasi uap adalah salah satu metode
lama dan resmi yang disetujui untuk isolasi minyak atsiri dari bahan tanaman.
Bahan tanaman yang bermuatan di alembic dikukus tanpa maserasi dalam air.
Uap yang diinjeksikan melewati tanaman dari dasar alembic ke atas. Distilasi
uap adalah metode dimana uap mengalir melalui bahan. Steam ini berfungsi
sebagai agen yang memecah pori-pori bahan mentah dan mengeluarkan

10
minyak atsiri bahan tersebut. Sistem ini menghasilkan campuran uap dan
minyak atsiri yang diinginkan. Uap kemudian dikondensasikan lebih lanjut
dan minyak atsiri dikumpulkan. Prinsip dari teknik ini adalah tekanan uap
gabungan sama dengan tekanan ambien sekitar 100°C sehingga komponen
volatil dengan titik didih berkisar antara 150 hingga 300°C dapat diuapkan

pada suhu yang mendekati suhu air (Rassem, 2016).

Gambar 2.3. Skema alat distilasi uap

2.3.3. Ekstraksi Pelarut

Ekstraksi pelarut adalah metode untuk memisahkan senyawa

berdasarkan kelarutan bagian-bagiannya. Ini dilakukan dengan menggunakan
dua cairan yang tidak bercampur, misalnya air dan pelarut organic. Dalam
metode Ekstraksi Pelarut dari pemulihan Minyak Atsiri, unit ekstraksi diisi
dengan baki berlubang dari bahan tanaman minyak atsiri dan berulang kali
dicuci dengan pelarut. Ekstraksi pelarut digunakan dalam pemrosesan
parfum, minyak nabati, atau biodiesel (Rassem et al., 2016).

11
 Gambar 2.4. Skema alat ekstraksi pelarut

2.4. Uji Toksisitas Akut Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Toksisitas adalah kerusakan yang ditimbulkan oleh suatu bentuk aksi kimia
yang mempunyai bentuk dan variasi yang luas. Asam-asam kuat atau alkalis, yang
mengalami kontak langsung dengan organ mata, kulit, dan atau saluran
pencernaan, dapat mengakibatkna kerusakan pada jaringan dan bahkan kematian
pada sel-sel. Toksisitas merupakan ukuran relatif derajat racun antara satu bahan
kimia terhadap bahan kimia lain pada organisme yang sama kemampuan racun
(molekul) untuk menimbulkan kerusakan apabila masuk ke dalam tubuh dan
lokasi organ yang rentan terhadapnya (Lestari et al., 2019). Kadar racun suatu zat
kimia salah satunya dinyatakan dengan istilah Lethal Concentration-50 (LC50).
LC50 adalah kadar atau konsentrasi suatu zat, yang dinyatakan dalam miligram
bahan kimia per-meter kubik media uji yang dapat menyebabkan 50% kematian
pada binatang percobaan dari suatu kelompok spesies setelah binatang percobaan
tersebut terpapar dalam waktu tertentu (Gad, 2014).

Menurut Badan Pengawas Obat dan Makanan (2014), uji toksisitas adalah uji
untuk menilai efek toksik suatu zat pada sistem biologi yang digunakan untuk
mendapatkan data berupa dosis serta respon biologis. Data tersebut dapat
digunakan sebagai informasi tentang derajat bahaya suatu zat uji apabila manusia
terpapar oleh zat tersebut, sehingga dapat ditentukan dosis yang aman
penggunaannya bagi manusia. (BPOM RI, 2014)

12
 Penggunaan hewan uji untuk uji toksisitas berguna untuk menentukan adanya
reaksi patologik, fisiologik dan biokimia pada manusia terhadap suatu sediaan uji.
Hasil uji toksisitas tidak dapat digunakan sepenuhnya untuk memastikan
keamanan suatu zat pada manusia, tetapi dapat digunakan sebagai petunjuk
adanya toksisitas relatif dan mengidentifikasi apakah ada efek toksik bila terjadi
pemaparan pada manusia. (BPOM RI, 2014)

Uji toksisitas akut adalah pengujian untuk menilai adanya gejala toksisitas
yang berpotensi muncul pada manusia setelah pemberian sediaan tersebut dalam
waktu singkat yang diberikan dalam waktu 24 jam. uji tersebut dilakukan dengan
cara memberikan sediaan uji pada beberapa tingkatan dosis tertentu diberikan
kepada beberapa kelompok hewan uji dengan satu dosis per kelompok dan
selanjutnya dilakukan pengamatan gejala toksisitas atau adanya kematian hewan
uji. (BPOM RI, 2014).

Brine Shrimp Letality Test (BSLT) merupakan salah satu metode uji
toksisitas akut. Metode pengujian ini menggunakan hewan uji yaitu larva Artemia
salina, yang dapat digunakan sebagai bioassay yang sederhana untuk meneliti
sitotoksisitas akut suatu senyawa, dengan cara menetukan nilai LC 50 yang
dinyatakan dari komponen aktif suatu simplisia maupun bentuk sediaan ekstrak
dari suatu tanaman. Metode BSLT memiliki beberapa kelebihan, antara lain biaya
relatif murah, sederhana, waktu pelaksanaan cepat, praktis, dan tidak memerlukan
teknik perawatan khusus. Selain itu, larva Artemia salina memiliki beberapa
keunggulan diantaranya mudah didapat, mudah dibiakkan dan dapat hidup pada
rentangan salinitas yang tinggi. Jumlah sampel yang digunakan relatif sedikit dan
tidak memerlukan peralatan khusus untuk melakukan uji ini. Metode ini telah
banyak digunakan untuk uji sitotoksisitas dalam analisis pestisida, anestetik, dan
zat pencemar air (Sarah et al., 2017).

Uji tosisitas dengan Artemia salina dilakukan dengan memasukan telur

Artemia salina sebanyak 100 mg ke dalam bejana yang berisi air laut. Setelah 24-
48 jam, telur akan menetas dan cangkang telur dibersihkan. Kemudian disiapkan

13
beberapa wadah, masing-masing di masukkan 30 ekor dan 15 mL air laut. Wadah
pertama sebagai kontrol sedangkan wadah-wadah yang lainnya ditambahkan
larutan uji (dibuat dari zat yang akan diuji toksisitasnya). Larutan uji yang
digunakan mempunyai kadar yang bervariasi (variasi kadar larutan uji dapat
ditentukan menurut kebutuhan). Sedangkan untuk prosedur dilakukan dengan
menggunakan replikasi (3-5 kali). Apabila senyawa tidak larut dalam air, maka
senyawa dilarutkan dalam pelarut organik polar yang larut dalam air. Untuk
pengamatan dilakukan setelah Artemia salina kontak dengan larutan uji selama 6
sampai 24 jam (Sarah et al., 2017). Selanjutnya, data yang digunakan adalah
jumlah kematian yang dihitung menurut rumus (Gad, 2014):

A−B
% kematian= x 100 %
C

Keterangan:
A : jumlah Artemia salina yang mati pada larutan uji
B : jumlah Artemia salina yang mati pada larutan kontrol
C : jumlah Artemia salina mula-mula

Apabila pada kontrol terjadi kematian lebih dari 5%, tetapi kurang dari 10%,
dilakukan koreksi menggunakan rumus Abbort Formula sebagai berikut (Gad,
2014):

% kematian hewan uji−% kematian hewan kontrol

AK =
100−% kematianhewan uji

Jika kematian pada kontrol lebih dari 10 %, maka uji dibatalkan dan
dilakukan pengujian ulang. Apabila suatu ekstrak tanaman bersifat toksik menurut
LC50 dengan metode BSLT, maka tanaman tersebut dapat berpotensi sebagai
senyawa sitotoksik yang berpotensi sebagai obat antikanker. Namun, bila tidak
bersifat toksik maka tanaman tersebut dapat digunakan sebagai bahan baku obat
untuk pengobatan manusia dan diteliti kembali untuk mengetahui khasiat lainnya
(Gad, 2014).

14
Tabel 2.1. Aktivitas Sitotoksisitas (Hamidi et al, 2014)

Klasifikasi LC50 (µg/mL)

Toksik tinggi (High toxic) 0-100
Toksik sedang (Medium toxic) 100-500
Toksik rendah (Low toxic) 500-1000
Tidak toksik (Non toxic) > 1000

2.5. Kerangka Teori

Gambar 2.5. Skema Kerangka Teori

15
 BAB III
KERANGKA KONSEP

3.1. Kerangka Konsep

Gambar 3.1 Skema Kerangka Konsep

Keterangan:
: Mempengaruhi
: Faktor yang tidak diteliti

Ho: Bila nilai LC50 > 1000 μg/ml maka Ho diterima minyak atsiri rimpang
bangle (Zingiber montanum) aman terhadap larva Artemia salina

H1: Bila nilai LC50 < 1000 μg/ml maka H1 diterima minyak atsiri rimpang
bangle (Zingiber montanum) tidak aman terhadap larva Artemia salina

16
 BAB IV
METODE PENELITIAN

4.1. Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni laboratoris dengan
pendekatan post test only control group.

4.2. Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan di Laboratorium Farmakologi Universitas
Mulawarman pada bulan Februari 2021.

4.3. Populasi dan Sampel Penelitian

4.3.1. Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah larva udang yang diperoleh dari
Laboratorium Farmakologi Universitas Mulawarman.
4.3.2. Sampel
Sampel dalam penelitian ini adalah larva udang yang diperoleh dari
Laboratorium Farmakologi Universitas Mulawarman yang diambil dengan
menggunakan simple random sampling.
4.3.3. Besar Sampel
Penelitian menggunakan 4 kelompok minyak atsiri rimpang bangle
(Zingiber montanum). Penentuan jumlah pengulangan dihitung dengan
menggunakan rumus Degrees of Freedom (DF) berikut:

Degrees of Freedom (DF) = 10 (minimum) – 20 (maksimum)

Rumus yang digunakan untuk menghitung jumlah replikasi (n)

berdasarkan jumlah kelompok perlakuan (k) adalah sebagai berikut:

(n x k) – k

Maka dapat diperoleh:

Jumlah replikasi minimum = 10 = (n x 4) – 4

17
 14 = 4n
n = 3,5 ~ 3 kali pengulangan

Jumlah replikasi maksimum = 20 = (n x 4) – 4

24 = 4n

n = 6 kali pengulangan

Dari perhitungan di atas, maka diperlukan 3-6 kali pengulangan untuk

sampel.

4.4. Alat dan Bahan

Alat: aerator, batang pengaduk, cawan porselin, chamber, corong kaca,
erlenmeyer, gelas piala 250 ml, gelas ukur, lampu pijar, mikropipet, pipa
kapiler, rak tabung, seperangkat alat uji BSLT, tabung reaksi, seperangkat alat
sentrifuge, tabung sentrifuge, timbangan analitik, timbangan kasar (O’ Hauss®).

Bahan: air laut, air suling, minyak atsiri rimpang bangle (Zingiber
montanum), telur Artemia salina, etanol 70%, alumunium foil.

4.5. Prosedur Penelitian

4.5.1. Persiapan Minyak Atsiri Rimpang Bangle
Minyak atsiri dari rimpang bagle ditimbang sebanyak 50 mg. Kemudian
dilarutkan dalam pelarut etanol 70% sebanyak 5 ml, sehingga diperoleh
konsentrasi 10000 μg/ml sebagai larutan stok. Rumus molaritas digunakan
dalam pengenceran, sebagai berikut:

V 1× M 1
M 2=
V2

Keterangan:
M2 = Molaritas larutan setelah pengenceran
M1 = Molaritas larutan mula-mula1
V1 = Volume larutan mula-mula
V2 = Volume larutan setelah pengenceran

18
 Untuk mendapatkan konsentrasi 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml dan 1000
μg/ml, maka dari larutan stok tersebut dipipet ke dalam vial masing-masing
0,5 μl, 5 μl, 50 μl, dan 500 μl menggunakan mikropipet sebagai volume awal,
volume akhir didapatkan didapatkan 5000 μl. Dalam proses ini diambil
larutan air laut setelah pelarut minyak atsiri.

4.5.2. Uji Toksisitas Akut

4.5.2.1. Penyiapan larva Udang
Langkah awal dalam penyiapan larva udang yaitu dengan
merendam telur Artemia salina dalam wadah berbentuk kerucut yang
berisi air laut. Alat penetas dilengkapi dengan lampu sebagai sumber
cahaya dan diberi aerator yang berfungsi sebagai penyuplai oksigen
dan menjaga agar telur tidak mengendap. Ditimbang telur udang
sebanyak 5 gram per liter air. Telur dimasukkan pada wadah dan
akan menetas kira-kira 24 jam setelah ditaburkan. Selanjutnya larva
dipindahkan dalam kotak kecil berisi 300 ml air laut yang telah
terbagi menjadi dua ruang yang dihubungkan oleh lubang-lubang
kecil. Ruang penetasan diberi kondisi gelap sedangkan yang lain
diberi penerangan dan aerator, larva yang baik akan berenang
menuju ruang yang terang karena mereka bersifat fototropik. Larva
udang akan siap untuk digunakan dalam pengujian setelah berumur
48 jam.

4.5.2.2. Pelaksanaan Uji

Pengujian sampel dilakukan dengan cara memasukkan
masing-masing sampel ke dalam vial. Selanjutnya vial diisi air laut 1
ml, lalu sepuluh ekor Artemia salina umur 48 jam yang sehat
(bergerak aktif) dipilih secara acak, dimasukkan ke dalam vial yang
berisi sampel yang bebas pelarut menggunakan pipet tetes kemudian
ditambahkan air laut sampai 5 ml (larutan stok 0,5 μl penambahan
air laut berikutnya 3999,5 μl; larutan stok 5 μl penambahan air laut
berikutnya 3995 μl; larutan stok 50 μl penambahan air laut

19
 berikutnya 3950 μl; larutan stok 500 μl penambahan air laut
berikutnya 3500 μl).

Pengujian ini menggunakan dua kontrol negatif berupa air

laut dan etanol. Volume air laut sebagai kontrol negatif adalah 5 ml
tanpa campuran apapun, volume etanol sebagai kontrol negatif
adalah 0,5 μl, 5 μl, 50 μl, dan 500 μl mengikuti besarnya volume
larutan uji yang digunakan.

Satu tetes suspensi ragi Saccharomyces cereviceae (3 mg/10

ml air laut) ditambahkan ke dalamnya sebagai makanan Artemia
salina. Vial diletakkan di bawah lampu penerangan selama 24 jam.
Setelah 24 jam jumlah larva yang hidup dihitung dengan bantuan
kaca pembesar. Persen kematian larva dihitung dengan
menggunakan rumus:

% kematian hewan uji−% kematian hewan kontrol

AK =
100−% kematianhewan uji

4.6. Identifikasi Variabel

Variabel independen (bebas): minyak atsiri rimpang bangle (Zingiber
montanum) dengan konsentrasi 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml dan 1000 μg/ml

Variabel dependen (terikat): jumlah kematian larva Artemia salina

20
4.7. Definisi Operasional
Tabel 4.1. Definisi Operasional

Definisi Skala
Variabel Hasil Ukur
Operasional Ukur
Minyak atsiri Konsentrasi mintak  1 μg/ml Ordinal
rimpang bangle atsiri rimpang  10 μg/ml
(Zingiber bangle (Zingiber  100 μg/ml
montanum) montanum)  1000 μg/ml
Jumlah Larva yang tidak  Toksisitas tinggi Ordinal
kematian larva bergerak setelah  Toksisitas sedang
Artemia salina pemberian zat  Toksisitas rendah
dalam waktu 24  Tidak toksik
jam
4.8. Analisis Data
Data yang diperoleh dari hasil pengamatan berupa data kematian larva
Artemia salina dihitung dengan menggunakan analisis probit pada aplikasi SPSS
versi 22 untuk mendapatkan nilai LC50.

21
4.9. Alur Penelitian

Berikut merupakan alur dalam pelaksanaan penelitian ini:

Identifikasi variabel
penelitan

Penetapan populasi dan

besar sampel penelitian

Mengurus perizinan
penelitian

Melakukan pengumpulan
data

Melakukan pengolahan
data

Melakukan analisis data

Hasil penelitian

Pembahasan dan hasil

kesimpulan

Gambar 4.1. Skema Alur Penelitian

22
4.10. Jadwal Penelitian

Tabel 4.2. Rencana Jadwal Penelitian

Bulan
Kegiatan Januari Februari Maret April Mei
2021 2021 2021 2021 2021
3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3
Penyusunan
Proposal
Penelitian
Seminar
Proposal
Penelitian
Revisi
Proposal
Penelitian,
Pengajuan
Permohona
n Izin
Penelitian
di FK
Unmul
Pengambila
n dan
Pengolahan
Data
Penyusunan
Hasil
Penelitian
Seminar
Hasil dan
Ujian
Skripsi
Revisi
Skripsi dan
Publikasi
Ilmiah
DAFTAR PUSTAKA

23
Aeni, N., Purnama, A. A., & Afifah, N. (2017). Identifikasi Tumbuhan Obat di
Kecamatan Kunto Darussalam Kabupaten Rokan Hulu. jurnal Ilmiah
Mahasiswa FKIP Prodi Biologi.

Astarina, N. W. G., Astuti, K. W., & Warditiani, N. K. (2013). Skrining fitokimia

ekstrak metanol rimpang bangle (Zingiber purpureum Roxb.). Jurnal
Farmasi Udayana.

Batubara, I., Wahyuni, W. T., & Susanta, M. (2016). Antibacterial activity of

zingiberaceae leaves Essential oils against streptococcus mutans And teeth-
biofilm degradation. International Journal of Pharma and Bio Sciences.
https://doi.org/10.22376/ijpbs.2016.7.4.p111-116

Buldani, A. (2017). Uji Efektivitas Ekstrak Rimpang Bangle (Zingiber

Cassumunar Roxb.) Sebagai Antibakteri Terhadap Vibrio Cholerae Dan
Staphylococcus Aureus Secara In Vitro Dengan Metode Difusi Cakram.
SENIT, 2(1). Diambil dari https://core.ac.uk/reader/268057452

El Asbahani, A., Miladi, K., Badri, W., Sala, M., Addi, E. A., Casabianca, H., ...
& Elaissari, A. (2015). Essential oils: from extraction to encapsulation.
International journal of pharmaceutics, 483(1-2), 220-243.

Gad, S. C. (2014). LD50/LC50 (Lethal Dosage 50/Lethal Concentration 50). In

Encyclopedia of Toxicology: Third Edition. https://doi.org/10.1016/B978-0-
12-386454-3.00867-8

Hamidi, M. R., Jovanova, B., & Panovska, T. K. (2014). Toxicоlogical evaluation

of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Maced
pharm bull, 60(1), 9-18.

Koontongkaew, S., Poachanukoon, O., Sireeratawong, S., Dechatiwongse Na

Ayudhya, T., Khonsung, P., Jaijoy, K., ... & Chanchai, M. (2014). Safety
evaluation of Zingiber cassumunar Roxb. rhizome extract: acute and chronic
toxicity studies in rats. International scholarly research notices, 2014.

Kubo, M., Gima, M., Baba, K., Nakai, M., Harada, K., Suenaga, M., …

24
 Fukuyama, Y. (2015). Novel neurotrophic phenylbutenoids from Indonesian
ginger Bangle, Zingiber purpureum. Bioorganic and Medicinal Chemistry
Letters. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2015.02.005

Kusmana, C. (2015). The Biodiversity of Flora in Indonesia. Journal of Natural

Resources and Environmental Management.
https://doi.org/10.19081/jpsl.5.2.187

Lestari, D., Kartika, R., & Marliana, E. (2019). UJI Brine Shrimp Lethality Test
(BSLT) UMBI BAWANG TIWAI (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb) DAN
UJI TOKSISITAS AKUT FRAKSI AKTIF. Jurnal Riset Kefarmasian
Indonesia. https://doi.org/10.33759/jrki.v1i1.43

Mahfud, M., Darmawan, M. D., Diamanta, D. H., & Kusuma, H. S. (2017).

Extraction of essential oil from Bangle (Zingiber purpureum Roxb.) by
hydrodistillation and steam distillation methods. Journal of Chemical
Technology and Metallurgy.

Nasution, J., Riyanto, R., & Chandra, R. H. (2020). KAJIAN ETNOBOTANI

ZINGIBERACEAE SEBAGAI BAHAN PENGOBATAN TRADISIONAL
ETNIS BATAK TOBA DI SUMATERA UTARA. Media Konservasi.
https://doi.org/10.29244/medkon.25.1.98-102

Noviyanto, F., Hodijah, S., & Yusransyah, Y. (2020). Aktivitas Ekstrak Daun
Bangle (zingiber purpureum roxb.) Terhadap Pertumbuhan Bakteri
Pseudomonas aeruginosa. Journal Syifa Sciences and Clinical Research,
2(1), 31–38. https://doi.org/10.37311/jsscr.v2i1.2665

Pratiwi, H. D. (2017). UJI EFEKTIFITAS EKSTRAK ETIL ASETAT

RIMPANGBANGLE (Zingiber purpureum Roxb) DALAM MENGHAMBAT
PERTUMBUHAN BAKTERIStaphylococcus aureus DAN Escherichia coli.
Universitas Medan Area. Diambil dari
http://repository.uma.ac.id/handle/123456789/1926

Rijayanti, R. P. (2014). Uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun mangga

bacang (Mangifera Foetida L.) terhadap Staphylococcus aureus secara in

25
 vitro. Jurnal Mahasiswa PSPD FK Universitas Tanjungpura, 1(1).

Rassem, H. H., Nour, A. H., & Yunus, R. M. (2016). Techniques for extraction of
essential oils from plants: a review. Australian Journal of Basic and Applied
Sciences, 10(16), 117-127.

Sarah, Q. S., Anny, F. C., & Misbahuddin, M. (2017). Brine shrimp lethality
assay. Bangladesh Journal of Pharmacology.
https://doi.org/10.3329/bjp.v12i2.32796

Somesh, M., S. Rupali, S. Swati, M. Jose, M. Manish, 2015. In-vitro Comparative

Study on Antimicrobial Activity of five Extract of Few Citrus Fruit: Peel &
Pulp vs Gentamicin. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 9(1):
165-173.

Sari, M. Anindya Puspita (2016) AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL

DAN HEKSANA DAUN BANGLE (Zingiber cassumunarRoxb.) TERHADAP
Eschericia coli DAN Staphylococcus aureus. S1 thesis, UAJY.

Wang, Y., You, C. X., Yang, K., Wu, Y., Chen, R., Zhang, W. J., … Han, J.
(2015). Bioactivity of Essential Oil of Zingiber purpureum Rhizomes and Its
Main Compounds against Two Stored Product Insects. Journal of Economic
Entomology. https://doi.org/10.1093/jee/tov030

Wulandari, D. (2018). Pengaruh Minyak Atsiri Bangle (Zingiber Purpureum

Roxb.) sebagai Antibakteri terhadap Kualitas Sabun Cair. JURNAL
AGROINDUSTRI HALAL. https://doi.org/10.30997/jah.v4i1.882

26