ASISTENSI PRAKTIKUM ANALISIS INSTRUMEN

AKURASI, PRESISI, SELEKTIVITAS HPLC PCT

Disusun oleh :

Chelcie Lowra Pangesti 611910047

Dhita Rizky Amalia 611910051

Rinda Puspita Sari 611910074

Dimas Rizal 611910084

Rika Dwi Indasari 611910092

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS MACHUNG

2021
 MODUL 6 AKURASI PRESISI SELEKTIVITAS HPLC PCT

A. Tujuan Praktikum

1. Untuk mengetahui akurasi presisi selektivitas HPLC paracetamol.

2. Untuk memahami prinsip dan penggunaan metode HPLC.

B. Prinsip Dasar

PARASETAMOL (Asetaminofen/Paracetamol)

Gambar 1. Rumus Struktur Paracetamol

(Sumber: Moffat et al., 2005)

Parasetamol (C8H9NO2) atau asetaminofen berupa serbuk hablur, putih, tidak

berbau, rasa sedikit pahit. Mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari 101,0 %
C8H9NO2, dihitung terhadap zat anhidrat. Kelarutannya larut dalam air mendidih dan dalam
natrium hidroksida 1 N serta mudah larut dalam etanol. BM parasetamol adalah 151,16.
Parasetamol memiliki khasiat sebagai analgetikum dan antipiretikum (Depkes RI, 1995).

Absorbansi parasetamol pada max 245 nm dalam larutan asam adalah sebesar
668a sedangkan dalam larutan alkali atau basa absorbansinya sebesar 715a pada max 257 nm.
Identifikasi: Sistem HD—k 0.1; sistem HW—k 0.32; sistem HX—RI 264; sistem HY—RI
241; sistem HZ—waktu retensi 1.9 menit; sistem HAA—waktu retensi 5.6 menit; sistem
HAM—waktu retensi 2.0 menit; sistem HAX—waktu retensi 4.8 menit; sistem HAY—waktu
retensi 3.7 menit (Moffat et al., 2005).
 1. Kecermatan (accuracy)
Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis
dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai persen
perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan ditentukan
dengan dua cara yaitu metode simulasi (spiked-placebo recovery) yaitu memasukkan
analit ke dalam matriks blanko atau metode penambahan baku (standard
additionmethod) yaitu penambahan baku pada matriks sampel yang mengandung
analit (Harmita, 2004).

2. Keseksamaan (precision)
Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji
individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur
diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang
homogen. Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif
(koefisien variasi). Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan
(repeatability) atauketertiruan (reproducibility). Keterulangan adalah keseksamaan
metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan
dalam interval waktu yang pendek (Harmita, 2004.)

3. Selektivitas (Spesifisitas)
Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji
individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur
diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang
homogen. Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif
(koefisien variasi). Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan
(repeatability) atauketertiruan (reproducibility). Keterulangan adalah keseksamaan
metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan
dalam interval waktu yang pendek (Harmita, 2004).

C. Alat dan Bahan

3.1. Alat
a. Timbangan analitik
b. Batang pengaduk
c. Sendok tanduk
 d. Beaker glass
e. Erlenmeyer
f. Labu ukur
g. Pipet ukur
h. Mortir dan stamper
i. Botol vial
j. Bulb filler
k. Pipet tetes
l. Kertas perkamen
m. Membran filter
n. Alat ultrasonik
o. Syringe
p. HPLC dengan kolom reversed phase C18

3.2. Bahan
a. Tablet sampel (Pamol)
b. Serbuk baku parasetamol
c. Metanol dan air (70:30 v/v)

D. Metodelogi
a. Pembuatan Fase Gerak Air : Metanol (3:2)

600 ml aquadest dicampur dengan 400 ml metanol

p.a

Dimasukkan ke dalam labu ukur 1000 ml

Disaring melalui membran filter 0,45 µm

Di degassed selama 10 menit

Fase gerak aquadest : metanol (3:2)

b. Pembuatan larutan baku induk 1000 ppm
Ditimbang 10 mg Paracetamol p.a

Dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL

Dilarutkan dengan fase gerak ad tanda batas

Dikocok ad homogen

Larutan baku paracetamol 1000 ppm

c. Pembuatan Kurva Standar Paracetamol
Larutan baku induk paracetamol 1000 ppm

Diambil 100 µl, 120 µl, 1400 µl, 1600 µl, 1800 µl, 200 µl, 220 µl,
240 µl, 260 µl, 280 µl menggunakan mikropipet

Masukkan masing-masing ke dalam labu ukur 10 ml

Tambahkan fase gerak ad tanda batas

Kocok ad homogen

Larutan baku kerja 10 ppm, 12 ppm, 14 ppm, 16 ppm, 18 ppm, 20

ppm, 22 ppm, 24 ppm, 26 ppm, 28 ppm

Pindahkan ke dalam vial masing-masing (10 vial)

Dilakukan penyuntikan masing-masing sebanyak 10 µl

Diperoleh nilai TR, area, dan tinggi puncak

d. Uji Presisi
Ditimbang 100 mg sampel tablet paracetamol dalam
labu ukur 10 mL

Ditambahkan larutan standar paracetamol 1000

ppm dengan konsentrasi 8; 10; dan 12 ppm (80 µl;
100 µl; dan 120 µl)

Ditambahkan fase gerak ad tanda batas

Dikocok ad homogen

Dilakukan penyuntikan masing-masing sebanyak 10

µl

Replikasi 3 kali

Dihitung RSD rata-rata

e. Uji Akurasi
- Konsentrasi 80%
Ditimbang 100 mg sampel tablet paracetamol dalam
labu ukur 10 mL

Ditambahkan 96 µl larutan paracetamol 1000 ppm

Ditambahkan fase gerak ad tanda batas

Dikocok ad homogen

Dilakukan penyuntikan masing-masing sebanyak 10

µl

Replikasi 3 kali

Dihitung presentase recovery untuk menentukan

akurasi
- Konsentrasi 100%
Ditimbang 100 mg sampel tablet paracetamol dalam
labu ukur 10 mL

Ditambahkan 120 µl larutan paracetamol 1000

ppm

Ditambahkan fase gerak ad tanda batas

Dikocok ad homogen

Dilakukan penyuntikan masing-masing sebanyak 10

µl

Replikasi 3 kali

Dihitung presentase recovery untuk menentukan

akurasi
 - Konsentrasi 120%
Ditimbang 100 mg sampel tablet paracetamol dalam
labu ukur 10 mL

Ditambahkan 144 µl larutan paracetamol 1000

ppm

Ditambahkan fase gerak ad tanda batas

Dikocok ad homogen

Dilakukan penyuntikan masing-masing sebanyak 10

µl

Replikasi 3 kali

Dihitung presentase recovery untuk menentukan

akurasi

f. Uji Selektivitas

Penentuan selektivitas menggunakan HPLC dengan

metode degree bias

Mengamati nilai resolusi antara dua peak analitik

dengan peak lain

F. Perhitungan
a) Perhitungan Baku Induk

Larutan Baku Parasetamol 1000 ppm

Ditimbang paracetamol p.a 10 mg
Dilarutkan dengan fase gerak ad 100 ml
 1 ppm = 1 mg/L = 1 mg/1000 mL
massa (mg)
ppm = x 1000 ml/L
volume (ml)
10 mg
= x 1000 ml/L
10 ml
= 1000 mg/L = 1000 ppm

b) Perhitungan Fase Gerak

Fase gerak aquadest (3) : metanol (2) dibuat dalam 1000 ml
3
aquadest = x 1000 ml
5
= 600 ml
2
Etanol = x 1000 ml
5
= 400 ml
c) Pembuatan Kurva Standar Parasetamol
No Kadar (ppm) Dipipet μl Volume akhir (ml)
1. 10 10
100
2. 12 10
120
3. 14 10
140
4. 16 10
160
5. 18 10
180
6. 20 10
200
7. 22 10
220
8. 24 10
240
9. 26 10
260
10. 28 10
280

1. V1.C1 = V2.C2
V1 . 1000 ppm = 10ml . 10 ppm
10 ppm x 10 mL
V1 = = 0,1 ml = 100 µL
1000 ppm
2. V1.C1 = V2.C2
V1 . 1000 ppm = 10ml . 12 ppm
 12 ppm x 10 mL
V1 = 0,12 ml = 120 µL
1000 ppm =
3. V1.C1 = V2.C2
V1 . 1000 ppm = 10ml . 14 ppm
14 ppm x 10 mL
V1 = 0,14 ml = 140 µL
1000 ppm =
4. V1.C1 = V2.C2
V1 . 1000 ppm = 10ml . 16 ppm
16 ppm x 10 mL
V1 = 0,16 ml = 160 µL
1000 ppm =
5. V1.C1 = V2.C2
V1 . 1000 ppm = 10ml . 18 ppm
18 ppm x 10 mL
V1 = 0,18 ml = 180 µL
1000 ppm =
6. V1.C1 = V2.C2
V1 . 1000 ppm = 10ml . 20 ppm
20 ppm x 10 mL
V1 = 0,2 ml = 200 µL
1000 ppm =
7. V1.C1 = V2.C2
V1 . 1000 ppm = 10ml . 22 ppm
22 ppm x 10 mL
V1 = 0,22 ml = 220 µL
1000 ppm =
8. V1.C1 = V2.C2
V1 . 1000 ppm = 10ml . 24 ppm
24 ppm x 10 mL
V1 = 0,24 ml = 240 µL
1000 ppm =
9. V1.C1 = V2.C2
V1 . 1000 ppm = 10ml . 26 ppm
26 ppm x 10 mL
V1 = 0,26 ml = 260 µL
1000 ppm =
10. V1.C1 = V2.C2
V1 . 1000 ppm = 10ml . 28 ppm
28 ppm x 10 mL
V1 = 0,28 ml = 280 µL
1000 ppm =

d) Perhitungan Presisi
Membuat seri konsentrasi:
No Kadar (ppm) Dipipet μl Volume akhir (ml)
1. 8 80 10
2. 10 100 10
3. 12 120 10

1. V1.C1 = V2.C2
V1 . 1000 ppm = 10 . 8 ppm
8 ppm x 10 mL
V1 = 0,08 ml = 100 µL
1000 ppm =
2. V1.C1 = V2.C2
V1 . 1000 ppm = 10 . 10 ppm
10 ppm x 10 mL
V1 = 0,1 ml = 100 µL
1000 ppm =
3. V1.C1 = V2.C2
V1 . 1000 ppm = 10ml . 12 ppm
12 ppm x 10 mL
V1 = 0,12 ml = 120 µL
1000 ppm =

e) Perhitungan Akurasi

Pada uji akurasi, dari 3 titik yang dipakai (8 ppm, 10 ppm, dan 12 ppm)
yang digunakan untuk perhitungan presisi yaitu titik konsentrasi 10 ppm dengan
menggunakan % recovery 80%, 100%, dan 120%. Pengujian akurasi dilakukan
dengan 3 kali pengulangan pada masing-masing konsentrasi. Konsentrasi tersebut
meliputi:

80
1. ×12 ppm=9,6 ppm
100
100
2. ×12 ppm=12 ppm
100
120
3. ×12 ppm=14,4 ppm
100
Untuk pengambilan dari masing-masing konsentrasi larutan maka dipipet
larutan sebanyak:
9,6 ppm
1. ×10 mL=0,096 mL=96 μL
1000 ppm
 12 ppm
2. ×10 mL=0,12 mL=120 μL
1000 ppm
14,4 ppm
3. ×10 mL=0,144 mL=144 μL
1000 ppm

G. Kondisi Analisis
a) Fase gerak = air(3):metanol(2)
b) Fase diam = L1 kolom c18, diameter 1.5mm-2mm
c) Volume injeksi = 10μl
d) Flowrate = 1.5ml/min
e) Linearitas 5ppm-100ppm