LAPORAN PRAKTIKUM SEMENTARA II

IDENTIFIKASI ESCHERICHIA COLI

I. Dasar Teori
E. coli  tergolong bakteri Gram Negatif, berbentuk batang yang tidak membentuk spora, tidak
tahan asam dan ukurannya 2−3 x 0,6 μm (GORDON dan JORDAN, 1982). Bakteri ini dapat
ditemukan pada berbagai infeksi pada hewan dan merupakan agen primer atau sekunder dari infeksi
tersebut.Berdasarkan penyakit yang ditimbulkannya, dapat digolongkan menjadi dua kelompok.
Pertama, E. coli yang bersifat oportunistik, artinya dapat menyebabkan penyakit dalam keadaan
tertentu, misalnya kekurangan makanan atau mengikuti penyakit lain. Kedua, bersifat
enteropatogenik/ enterotoksigenik, E. coli yang mempunyai antigen perlekatan dan memproduksi
enterotoksin sehingga dapat menimbulkan penyakit.(LAY dan HASTOWO, 1992).
Isolasi mikroba merupakan upaya pembiakkan suatu jenis mikroba tertentu yang diperoleh dari
suatu sampel di dalam suatu media yang spesifik, sehingga selanjutnya dapat dilakukan identifikasi
dan konfirmasi. Setiap mikroba memiliki kebutuhan akan zat pertumbuhan yang spesifik sehingga
hal ini dapat dijadikan acuan dalam pemilihan media untuk isolasi, identifikasi dan konfirmasi.
Identifikasi mikroba yaitu Untuk mengetahui sifat-sifat morfologi bakteriuntuk mengenal nama
bakteri, maka bakteri dapat diperiksa dalam keadaan hidup atau mati. Pemeriksaan morfologi
bakteri ini perlu,. Disamping itu juga perlu pengenalan sifat-sifat fisiologisnya bahkan yang
merupakan faktor terentu dalam mengenal nama spesies suatu bakteri. Sedangkan konfirmasi
mikroba yaitu untuk mengetahui jenis bakteri dan koloninya. Konfirmasi jenis bakteri dapat
menggunakan berbagai pewarnaan, reaksi ensimatis atau reaksi biokimia, terutama jika identifikasi
menggunakan media masih meragukan/belum memuaskan.
Pada umumnya media yang digunakan untuk membiakkan mikroba mengandung air, sumber
energi (protein dan karbohidrat), zat hara (sumber karbon,  nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen dan
hidrogen), serta faktor penunjang pertumbuhan (seperti asam amino, vitamin).
Suatu media yang memenuhi kebutuhan mikroba untuk bertahan hidup dan melakukan
aktivitasnya secara normal diperlukan untuk melakukan isolasi jenis mikroba tertentu.Setiap media
spesifik memiliki kandungan senyawa tertentu yang dapat mendukung pertumbuhan mikroba
tertentu tetapi menghambat pertumbuhan jenis mikroba lainnya. Sebagai contoh Media MCA

Poltekkes Kemenkes Mataram 1

 ( MacConkey Agar) mengandung zat warna yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram
Positif, sedangkan bakteri Gram Negatif tetap tumbuh.
II. Tujuan Praktikum
Tujuan dilakukan praktikum identifikasi E.coli adalah untuk mengidentifikasi dan mengisolasi
bakteri Escherichia coli dalam sampel air.
III. Waktu dan Tempat
Hari, tanggal : Senin – Jum’at, 28 November – 2 Desember 2016
Waktu : 08.00 – 12.00 WITA
Tempat : Laboratorium Mikrobiologi Poltekkes Kemenkes Mataram
IV. Alat dan Bahan
 Alat :

1. Autoclave 8. Kertas timbang 16. Pipet ukur

2. Blue tip 9. Korek api 17. Filler
3. Cawan petridish 10. Lampu spiritus 18. Rak tabung
( besar dan kecil ) 11. Mikropipet 19. Tabung reaksi
4. Erlenmeyer 12. Neraca O’hauss 20. Tissue
5. Gelas beaker 13. Ose bulat 21. Batang Pengaduk
6. Inkubator 14. Ose jarum 22. Bak pewarnaan
7. Kapas dan kasa 15. Pipet tetes 23. Mikroskop

 Bahan
1. Air sungai 11. KOH 40% - TSI
2. Isolat 12. Alfa-naftol 14. Gula-gula:
3. Media EMB 13. IMVIC MUTSI : glukosa, laktosa,
4. Media NB - Indol dan sukrosa
5. Media MCA - Motility 15. Zat warna gram
6. Media NAS - Voges - Carbol Fuchsin
7. Media NAP proskower - Lugol
8. Indikator BCP - Simon citrate - Alkohol aceton
9. Reagen Kovac - Metilred - Safranin
10. Methyl Red - Urea
Poltekkes Kemenkes Mataram 2
V. Prinsip Kerja
Sampel ditanam di media NB dan di inkubasi 24 jam. Kemudian ditanam pada media
NAP,MCA, dan EMB koloni yang dicurigai atau mendekati bakteri E.coli dan dilakukan
pengecatan gram kemudian ditanam pada media NAS dan dilakukan pengecatan gram, apabila
ditemukan bakteri basil gram negative, dan dilanjutkan ke uji IMVIC MUTSI dan gula-gula.
VI. Skema Identifikasi

Mikroskopis: dengan pewarnaan gram

VII.Cara Kerja
1. Pembuatan Media
A. Media NAP
1. Ditimbang NB sebanyak 5,6 gram dan agar sebanyak 14 gr dalam 700 ml aquadest
2. Dihomogenkan dalam erlenmeyer dan didihkan
3. Media di sterilisasi dalam autoclave

Poltekkes Kemenkes Mataram 3

 B. Media NB (8 gram dalam 1000 mL)
1. Ditimbang NB 1.2 gram yang dilarutkan dalam 150 mL aquades
2. Dihomogenkan dalam erlenmeyer dan didihkan
3. Media di sterilisasi dalam autoclave
C. Media NAS
1. Ditimbang NB sebanyak 1.2 gram dan agar 3 gram dalam 150 ml aquadest
2. Dihomogenkan dan disterilisasi dalam autoclave.
3. Dinginkan dalam posisi miring
D. Media MCA (50 gram dalam 1000 mL)
1. Ditimbang MCA sebanyak 5 gram dalam 400 ml aquadest.
2. Dihomogenkan dalam erlenmeyer dan didihkan
3. Media di sterilisasi dalam autoclave
E. Media EMB (30 gram dalam 1000 mL)
1. Ditimbang sebanyak 3.6 gram dalam 400 ml aquadest.
2. Dihomogenkan dalam erlenmeyer dan didihkan
3. Media di sterilisasi dalam autoclave
F. IMVIC MUTSI
 Media AP ( Indol) (80 gram dalam 1000 mL)
1. Ditimbang sebanyak 2.04 gram dalam 80 ml aquadest.
2. Dihomogenkan dalam beaker glass
3. Media disterilisasi dalam autoclave
 Media MR-VP (17 gram dalam 1000 mL)
1. Ditimbang sebanyak 0.34 gram dalam 20 ml aquadest.
2. Dihomogenkan dalam beaker glass
3. Media disterilisasi dalam autoclave
 Media SCA (22.5 gram dalam 1000 mL)
1. Ditimbang SCA sebanyak 0.45 gram dalam 20 ml aquadest.
2. Dihomogenkan dalam beaker glass dan didihkan
3. Media disterilisasi dalam autoclave. Dinginkan dalam posisi miring

Poltekkes Kemenkes Mataram 4

  Media Motility
1. Ditimbang NB sebanyak 0.16 gram dan timbang agar sebanyak 0.08 gram dalam 20
ml aquadest.
2. Dihomogenkan dalam beaker glass dan didihkan
3. Media di sterilisasi dalam autoclave
 Media Urea (38.5 gram dalam 1000 mL)
1. Ditimbang urea sebanyak 0.77 gram dalam 20 ml aquadest.
2. Disiapkan tabung kosong dan H2O sejumlah volume yang dibutuhkan
3. Sterilkan di autoclave
4. Urea dilarutkan dengan H2O secara steril
 Media TSI (6.5 gram dalam 1000 mL)
1. Ditimbang TSI sebanyak 1.3 gram dalam 20 ml aquadest.
2. Dihomogenkan dalam beaker glass dan didihkan
3. Media disterilisasi dalam autoclave. Dinginkan dalam posisi miring
G. Gula – gula (1-2%)
1. Larutkan masing-masing 0.4 gram glukosa, laktosa, dan sukrosa masing-masing dalam
20 ml pelarut AP dan ditambahkan indicator BCP (Brom Cresol Purple) sebanyak 3 tetes
2. Kemudian homogenkan dan disterilkan dalam autoclave
2. Identifikasi E. coli
a) Hari pertama (I)
 Penanaman sampel pada media NB
 Kemudian inkubasi selama 24 jam dengan suhu 37oC
b) Hari Kedua (II)
 Amati perubahan yang terjadi secara makroskopis (kekeruhan, endapan atau perubahan
warna).
 Dilakukan pengecatan gram, amati dibawah mikroskop
 Apabila ditemukan bakteri gram negative maka lanjutkan penanaman ke media EMB,
NAP dan MCA
 Inkubasi 24 jam pada suhu 37oC.
c) Hari Ketiga (III)
 Amati koloni yang tumbuh pada media EMB, NAP dan MCA secara makroskopis.

Poltekkes Kemenkes Mataram 5

  Dilakukan pengecatan gram, amati dibawah mikroskop
 Apabila ditemukan bakteri gram negative maka lanjutkan penanaman ke media NAS
 Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC.
d) Hari Keempat (IV)
 Amati secara mikroskopis media NAS dengan pengecatan gram
 Amati dibawah mikroskop, apabila bakteri yang tumbuh masih sama maka lanjutkan
penanaman ke media IMVIC MUTSI dan gula-gula
 Inkubasi selama 24 jam pada suhu 370C

#catatan :

 Untuk media slant atau miring seperti pada media TSIA dan SCA. Dengan
menggunakan ose lurus (nahl), ambil sedikit suspensi bakteri pada media NAS
kemudian tusuk media sampai dasar tabung dan buat goresan pada daerah miring
(lereng).
 Untuk media semi solid seperti motility gunakan juga ose jarum dengan cara ambil
sedikit suspensi bakteri pada media NAS kemudian tusuk tegak lurus media hingga
dasar tabung kemudian tarik ose keluar media (tidak digores)
 Untuk media cair seperti Indol, MR-VP, Urea, dan gula-gula gunakan ose bulat
dengan cara ambil suspensi bakteri pada media NAS celupkan ose ke dalam tabung
dan homogenkan.
 Media yang sudah ditanami dimasukkan dalam incubator selama 24 jam dengan suhu
37˚C.
e) Hari kelima (V)
 Amati perubahan yang terjadi pada IMVIC MUTSI dan gula-gula
 Untuk media indol tambahkan dengan reagen covac’s 3 tetes.
 Untuk media MR ditetesi dengan indicator Methyl Red 3 tetes.
 Untuk media VP ditetesi dengan KOH 40% 1 tetes dan α- naftol 3 tetes.
 Hasil pengamatan disesuaikan dengan tabel biokimia untuk menentukan jenis bakteri.

Poltekkes Kemenkes Mataram 6

VIII. Hasil Pemeriksaan
A. UJI SECARA MAKROSKOPIS

Makroskopis NB EMB NAP MCA

Warna Terbentuknya Hijau metalic Putih keruh Merah tua
koloni kekeruhan metallic
Bentuk Bulat Bulat Bulat
Ukuran Koloni Koloni Koloni sedang
sedang sedang-besar
Elevasi Cembung Cembung Sedikit cembung
Permukaan Halus Halus Halus
Tepian Halus Halus Halus
Konsistensi lunak lunak Lunak
Permentasi Laktose
Permentatif

B. UJI SECARA BIOKIMIA

MEDIA GULA- MEDIA BIOKIMIA SPESIES

SAMPEL GULA
Glu Lak Suk Ind MR VP SCA Mot Urea TSI
Isolat 1 - - - - + + - + - A/A E. coli
+ gas
- H2S

IX. Pembahasan
Terjadi kekeruhan pada media NB yang menandakan adanya pertumbuhan bakteri pada media
tersebut. Hasil pemeriksaan pada mikroskop ditemukan bakteri gram negative berbentuk basil atau
streptobasil. Bakteri berwarna merah karena mampu mengikat zat warna safranin.
Pengamatan pada media MCA, NAP, dan EMB.
 Media MCA (Mac Conkay Agar)

Poltekkes Kemenkes Mataram 7

 Didapatkan hasil berupa ukuran koloni sedang, berwarna merah muda(rose)/merah tua, sedikit
cembung dan pinggirnya rata.
 NAP (Nutrient Agar Plate)
Didapatkan koloni berukuran sedang-besar, berwarna putih keruh, cembung dan permukaan
halus.
 EMB (Eosin Methylen Blue)
Didapatkan hasil pertumbuhan koloni yang memiliki cirri-ciri bulat, berukuran sedang,
berwarna hijau metallic dengan permukaan yang halus.
 NAS (Nutrient Agar Slant)
Dilakukan uji mikroskopis pada media NAS yaitu dengan melakukan pewarnaan gram.
 Gula-gula (Glukosa, Laktosa, dan Sukrosa)
Dari hasil pemeriksaan,semua menunjukkan hasil negatif karena tidak terjadi perubahan
warna menjadi kuning.
Interpretasi hasil: + warna kuning
 Indol : Uji indol bertujuan mengidentifikasikemampuan bakteri menghasilkan indol dengan
menggunakan enzim tryphophanase (Lefobffe, 2011). Produksi indol di dalam media
dimungkinkan karena adanya trypthopan menjadi indol, piruvat dan ammonia. Hal ini
digunakan sebagai bagian dari prosedur IMViC, sebuah tes yang dirancang untuk
membedakan antara anggota keluarga enterobacteriaceae (Hemraj, 2013).Reaksi indol hanya
bisa dilihat ketika pertumbuhan bakteri pada media ini ditambahkan dengan reagen Kovac’s.
Indol dikatakan positif jika terdapat cincin merah pada permukaannya. Hasil indol pada
praktikum dinyatakan negatif.
Interpretasi hasil : + terbentuk cincin merah
 MR : setelah ditambahkan dengan indicator metil red, media berubah menjadi merah
(positif).  Berarti terjadi fermentasi asam campuran (asam laktat, asam asetat, dan asam
formiat) oleh bakteri.
Interpretasi hasil: + warna merah
 VP : VP adalah tes yang digunakan untuk mendeteksi acetoin dalam kultur cair bakteri.
Pengujian ini dilakukan dengan menambahkan alpha-naftol dan kalium hidroksida dengan
kaldu voges proskauer yang telah diinokulasi dengan bakteri.  setelah penambahan KOH 40 %

Poltekkes Kemenkes Mataram 8

 dan α-nafto 1 %, warna media berubah menjadi cincin merah/ungu ( positif).. Ini disebabkan
bakteri memfermentasikan butanadiol/asetil metilkarbinol oleh bakteri.
Interpretasi hasil: + cincin merah/ungu
 Simmon’s Citrate didapatkan hasilnegatif (-), sebab tidak terjadi perubahan warna pada
media.  Ini disebabkan bakteri E.coli merupakan salah satu spesies yang tidak menggunakan
sitrat sebagai sumber karbon untuk metabolisme dengan tidak menghasilkan suasana basa.
Interpretasi hasil: + biru
 Motility : media uji motilitas digunakan untuk menentukan motilitas dari suatu
mikroorganisme. Uji motilitas sering kali digunakan dalam diferensiasi dari
Enterobacteriaceae( Shields dkk, 2013 ). Pergerakan bakteri dapat terlihat pada media ini
berupa berkas putih di sekitar tusukan. Adanya pergerakan ini bisa dilihat karena media semi
solid. Pergerakan dari bakteri tersebut Karena media semisolid dirancang dengan mengurangi
konsentrasi agar pada media yaitu sekitar 0,4% pada media yang hanya cukup untuk
mempertahankan bentuknya sementara memungkinkan pergerakan bakteri bergerak (Leboffe,
2011)
Interpretasi hasil: + Penyebaran/ Tusukan berbentuk seperti akar
 Urea: Hasil pengamatan dari uji urease adalah negative, hal ini ditunjukkan karena adanya
perubahan pada media uji urea yang dapat menghasilkan ammonia dan karbondioksida
terutama untuk mengetahui microorganism tersebut mempunyai enzim urease atau tidak.
Urease,hasil yang didapat adalah negatif karena warna media tidak berubah menjadi warna
merah muda.
Interpretasi hasil: + ungu/pink cerah
 TSIA agar adalah media diferensial yang digunakan dalam menentukan fermentasi
karbohidrat dan produksi H2S. Selain itu, uji TSIA ini juga dapat mendeteksi adanya gas hasil
dari metabolisme karbohidrat. TSIA membedakan bakteri berdasarkan fermentasi laktosa,
glukosa, dan sukrosa dan produksi hydrogen sulfide (H 2S). Hasil dari pengamatan untuk uji
TSIA pada E. Coli menunjukkan hasil A/Adengan gas positif dan H2S negative.
 Tidak terdapat endapan hitam pada media yang menandakan bahwa bakteri
tidak memiliki enzim desulfurase
 Adanya ruangan kosong atau udara pada media menandakan bahwa bakteri mampu
menghasilkan gas.

Poltekkes Kemenkes Mataram 9

 Interpretasi hasil:

- A/A : Lereng dan dasar berwarna kuning menandakan fermentasi glukosa dan
sukrosa/laktosa
- K/K : Lereng dan dasar berwarna merah menandakan tidak ada fermentasi
- K/A : Lereng merah dan dasar kuning menandakan fermentasi glukosa
- H2S : Berwarna hitam
- Gas : Ada gelembung
X. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, didapatkan hasil pada media EMB warna koloni
hijau metalik dengan bentuk koloni sedang, media MCA warna koloni merah muda karena
memfermentasikan laktosa, dan hasil dari uji biokimia (IMVIC MUTSI) adalah indol negative, MR-
VP positif, SCA negative, motility positif, urea negative, dan pada media TSIA terbentuk gas serta
warna lereng dan dasar berwarna kuning (A/A) serta pada uji gula-gula (Sukrosa, Glukosa, dan
Laktosa) tidak mengalami perubahan warna atau negative, sehingga pada praktikum ini dapat
disimpulkan bahwa bakteri dalam sampel adalah Escherichia coli.
XI. Dokumentasi

Media NAP Media MCA

Media EMB Media NAS

Poltekkes Kemenkes Mataram 10

 Media NB Hasil pewarnaan gram

IMVIC MUTSI dan gula-gula sebelum diinkubasi

IMVIC MUTSI dan gula-gula setelah diinkubasi

Poltekkes Kemenkes Mataram 11

XII.Daftar Pustaka

Poltekkes Kemenkes Mataram 12

Lampiran 1

Tabel Identifikasi E. Coli

Gula-gula Media Biokimia Indol MR VP

TSI Lereng
GL SK LK Mn MI Mot Urea SCA
Gas H2S Dasar
E.
+g +/- + + + +/- - - + - A/A + + -
coli

Poltekkes Kemenkes Mataram 13