31S3101-Fisiologi

ERA GENOMIC

Oleh:
Kelompok 14:
Nama/NIM: Novi Wulandari/31S18003
Nama/NIM: Mega Silalahi/31S18029

Program Studi teknik bioproses

Fakultas Bioteknologi
2019
Ringkasan
Asam sitrat adalah asam organik yang banyak digunakan dalam dunia industri seperti
industri minuman, makanan dan industri farmasi. Aspergillus niger adalah komponen utama
dalam pembuatan asam sitrat . Sejak dikeluarkannya urutan genom, data mutli-omic yang
ekstensif diperoleh dengan cepat yang dapat meningkatkan pemahaman kita tentang
mekamisme akumulasi asam sitrat dalam S.niger ke tingkat molekuler dan sistem. Saat ini
perkembangan pesat sistem CRISPR/Cas 9 sangat efisien untuk mengatasi gangguan genetik
skala genim pada A.niger dengan cara mengedit genomnya. Dalam makalah ini kami
merangkum tentang dampak biologi sistem terhadap mekanisme pengaturan molekul asam
sitrat, kemajuan strategi rekayasa metabolik untuk meningkatkan produksi asam sitrat dan
membahas tentang perkembangan dan penerapan sistem CRISPR/Cas 9. Rekayasa sistem
metabolik yang dilakukan akan mendesain ulang dan merekayasa A.niger sebagai pabrik sel
yang sangat optimal untuk industri produksi asam sitrat.
Daftar Isi

Ringkasan...............................................................................................................................................i
Daftar Isi................................................................................................................................................ii
Daftar Gambar.....................................................................................................................................iii
Daftar Tabel..........................................................................................................................................iv
BAB I Pendahuluan.............................................................................................................................1
Bab II Pembahasan...............................................................................................................................3
Biologi sistem meningkatkan pemahaman tentang regulasi asam sitrat pada A.niger................3
Genomik.............................................................................................................................................3
Transkriptomik.................................................................................................................................4
Proteomik...........................................................................................................................................5
Metabolomik dan fluksomik.............................................................................................................5
Model metabolik skala genom..........................................................................................................7
Rekayasa metabolik pada A.niger untuk meningkatkan produksi asam sitrat............................8
Generasi baru teknik untuk mempercepat rekayasa sistem metabolik pada A.niger................14
Prospek lebih lanjut........................................................................................................................17
Bab III Penutup...................................................................................................................................19
3.1 Kesimpulan..........................................................................................................................19
3.1 Saran....................................................................................................................................19
DAFTAR PUSTAKA..........................................................................................................................21
Daftar Gambar
Figure 1 Metabolic engineering strategies for enchancing......................................................................8
Figure 2 sistem pengedit genom CRISPR/Cas 9 pada A.niger................................................................16
Figure 3 Systemic metabolic engineering of A.niger cell factory for citric acid production..................17
Daftar Tabel
Table 1 Metabolic engineering strategies for enchaning citric acid production A.niger..........................9
Table 2 CRISPR/Cas9 genome editing systems used in A.niger...........................................................15
BAB I Pendahuluan
Paper yang digunakan dalam makalah ini berjudul “Systems metabolic engineering for
citric acid production by Aspergillus niger in the post-genomic era”. Paper ini ditulis oleh
Zhenyu Tong, Xiaomei Zheng, Yitong, Yong Cheng Shi dan Jibin Sun. Paper ini dipublis pada
tahun 2019. Paper ini dapat diakses dengan link berikut https://doi.org/10.1186/s12934-019-
1064-6. Latar belakang penelitian ini adalah sebagai berikut.
Asam sitrat (Asam 2-hydroxy-propane-1,2,3-tricarboxylic) adalah intermediate dari
siklus asam trikarboksilat yang digunakan untuk melepaskan atau menghasilkan energi dari
karbohidrat, lemak, dan protein melalui oksidari asetil-KoA. Asam sitrat juga merupakan salah
satu asam organik yang produksinya sangat penting karena banyak digunakan dalam
minuman, makanan, industri farmasi, detergen, kosmetik dan industri bahan kimia organik
(Karaffa, 2003; Legisa, 2007). Selain itu asam sitrat digunakan juga sebagai agen pengkhelat
untuk pembersihan dan pelapisan logam, pelumas, pakan ternak dan pelarut yang digunakan
untuk meningkatkan plastisitas dan fleksibel agar mengurangi kerapuhan zatnya
(Anastassiadis, 2008).
Dikarenakan banyaknya minat terhadap asam sitrat ini sehingga banyak ilmuan yang
ingin melakukan pengembangan produksi asam sitrat untuk mendapatkan hasil produksi yang
lebih banyak. Proses produksi asam asetat melibatkan mikroorganisme. Banyak ditemukan
mikrooganisme yang dapat mengakumulasi asam sitrat antara lain Absidia sp., Acremonium,
Botrytis, Eupenicillium, Penicillium, dan beberapa spesies Aspergillus (Aspergillus niger,
Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, Aspergillus luchensis, dan Aspergillus favus).
Selain jamur flamentous diatas ada juga bakteri dan strain ragi yang ditemukan dapat
menghasilkan asam sitrat. Bakteri yang dapat menghasilkan asam sitrat antara lain Bacillus
sp., Brevibacterium sp., Corynebacterium sp., Klebsiella sp., dan Pseudomonas sp.
(Anastassiadis, 2008). Strain ragi yang dapat menghasilkan asam sitrat antara lain Candida
sp. dan Yarrowia sp. (Papagianni, 2007). 80% produksi asam sitrat di seluruh dunia dihasilkan
dari hasil fermentasi submerged menggunakan A.niger (Dhillon; dkk, 2011).
Strain A.niger menghasilkan asam sitrat yang lebih besar hingga 80% daripada
mikroorganisme lain, sehingga A.niger digunakan sebagai mikroorganisme utama dalam
produksi asam sitrat (Papagianni, 2007). Selain karena jumlah produksi asam sitratnya besar,

1
A.niger juga digunakan sebagai mikroorganisme utama karena sifat fisiologisnya melekat dan
lebih cocok dalam industri. Sistem enzim pengurai polimer pada A.niger sangat kuat untuk
menghidrolisis banyak substrat polimer sehingga memungkinkan untuk tumbuh dan
melakukan fermentasi dengan cepat pada berbagai bahan mentah yang biayanya murah seperti
tepung jagung dan molase (Meyer; dkk, 2015). A.niger juga dapat bertahan dalam lingkungan
asam yang ekstrim sehingga resiko kontaminan akan berkurang.
Hasil produksi asam sitrat tertinggi hanyalah 0.95 g/g dari gula yang digunakan.
Sedangkan secara teoritis produksi asam sitrat dihasilkan sekitar 1.067 g/g glukosa.
Dikarenakan itu perlu dilakukan peningkatan produksi dikarenakan permintaan asam sitrat
sangat meningkat karena dapat digunakan untuk berbagai hal. Salah satu pengembangan yang
telah dilakukan untuk meningkatkan produksi asam sitrat adalah dengan mengembangkan
strain melalui mutagenesis acak dan proses penyarigan yang perlu memasok beberapa mutan,
yang merupakan penghambat untuk perbaikan lebih lanjut, karena seringkali akumulasi
bawaan dari mutasi yang merugikan dan mutasi yang tepat yang mengarah pada peningkatan
strain yang tidak diketahui. (Singh; dkk, 2018; Mayer; dkk, 2016).
Dengan adanya perkembangan pesat biologi sistem dan teknik pengeditan genom,
mekanisme molekuler yang mendasari fermentasi asam sitrat A.niger secara bertahap dapat
diungkapkan dan teknik metabolisme sistem ini dapat digunakan dalam mendesain ulang dan
mengoptimalkan A.niger sebagai pabrik sel (dalam melakukan metabolisme). akan tetapi di
sisi lain belum ada ulasan yang berfokus pada sisitem biologi dan rekayasa metabolik A.niger
dalam meningkatkan produksi asam sitrat. dengan adanya ulasan tersebut kami dapat
merangkum adanya dampak biologi sistem pada mekanisme pengaturan molekuler asam sitrat.
adapun strategi rekayasa metabolik yang digunakan untuk meningkatkan produksi asam sitrat
adalah dengan meninjau pengembangan sistem CRISPR / Cas9 untuk pengeditan genom di
A.niger dan juga kami mengusulkan bahwa untuk prospek yang akan mendatang dalam hal
rekayasa siklus metaboliknya dapat menggabungkan informasi genom, pendekatan
bioinformatika modern dan alat manipulasi genetik molekuler yang efisien dalam metabolisme
A.niger yang bertujuan agar dapat meningkatkan hasil yang optimal serta konsentrasi (titer)
dan produktivitas yang akan mengurangi biaya akan tetapi dapat meningkatkan kelestarian
lingkungan.

2
Bab II Pembahasan
Biologi sistem meningkatkan pemahaman tentang regulasi asam sitrat pada A.niger
Asam sitrat adalah intermediate pertama daris siklus TCA yang disentesis oleh
kondensasi asetil-KoA dan Oksaloasetat (Karaffa; dkk, 2003). Asetil KoA diubah dari piruvat
dengan pelepasan 1 mol CO2 di dalam mitokondria, Sedangkan okasaloasetat dihasilkan dari
karboksilasi piruvat dari piruvat dengan fiksasi 1 mol CO 2 di dalam sitoplasma. Asetil KoA
dan oksaloasetat yang dihasilkan akan masuk kedalam siklus TCA. Oxaloasetat akan diubah
menjadi asam malat dan masuk ke mitokondri melalui shuttle malat sitrat. Asam malat diubah
kembali menjadi oksaloasetat yang akan digunakan dalam sintesis asam sitrat. Satu molekul
glukosa diubah menjadi 1 mol asam sitrat, 1 mol ATP dan 3 mol NADH (Papagianni, 2007).
Sebagai intermediate dari siklus TCA, asam sitrat umumnya dikatabolisme oleh cis-
aconitase dan sitrat dan ATP biasanya memiliki umpan balik penghambat terhadap jalur
glikolisis (Legisa; dkk, 2007). Data multi omic A.niger termasuk genomik, transkriptomik,
proteomik dan metabolomik yang didapatkan dengan cepat, sehingga meningkatkan
pemahaman tentang A.niger ke tingkat molekuler. Kumpulan data ini yang berdampak pada
mekanisme pengaturan molekul asam sitrat.

Genomik
Genome terdiri dari semua informasi genetik suatu organisme dan sequence genome
membuka jalan untuk semua struktur gene dan analisis fungsi selain generasi jaringan
metabolisme dalam skala genom. Sudah banyak genome dengan fenotip yang berbeda dari
strain A.niger yang sudah tercatat pada Genome data base of National Center for
Biotechnology Information (NCBI) yang dapat dilihat pada tabel 1.
Perbandingan antara genom menghasilkan wawasan baru untuk mengidentifikasi
hubungan antara genotip dan fenotip dan menunjukkan keragaman strain dengan ciri-ciri
tertentu. Contohnya, dengan membandingkan CBS513.88 dengan genom strain tipe liar
asidogenik ATCC1015 yang mengandung sekitar 510 gen unik yang sejumlah besar
polimorfisme. Gen unik 396/510 tersebar merata di 7 kromosom CBS513.88 dan ATCC1015.
Pada CBS512.88 gen unik itu termasuk 2 alfaamilase, yang ditransfer secara ortizontal dari
Aspergillus oryzae untuk menghasilkan fenotip amilase berlebih ke CBS513.88. Sedangkan
gen unik di ATCC1015 tidak secara relevan langsung menghsilkan produksi asam sitrat.
3
Terdapat ¾ gen pengkode sintase poliketida putatif yang unik ditemukan di kedua genom
tersebut, yang akan menyebankan perbedaan metabolit sekunder pada strainnya (Andersen;
dkk, 2011). Studi perbandingan genomik inilah yang digunakan untuk memprediksi aspek
molekuler utama dalam produksi asam sitrat (Yin; dkk, 2017)
Studi genomik komparatif antara isolat industri yang berbeda telah di lengkapi dengan
profil genom dari isolat mutan dan strain progenitor yang digunakan untuk memprediksi aspek
molekuler utama dari produksi asam sitrat. Sebagai contoh genomik komparatif dari tiga strain
A.niger dengan efisiensi produksi sitrat dan morfologi pelet miselium yang berbeda A.niger
H915-1 menunjukkan titer sitrat tertinggi 157 g / L dan rendemen total gula 0,98 g / g dalam
85 jam dengan pellet. Sedangkan isolat A1 dan L2 yang terdegenerasi menghasilkan 117 g / L
dalam 92 jam dengan lebih sedikit cabang hifa dalam pelet dan 76 g / L dalam 160 jam dengan
rumpun miselium. Dua galur mutan tersebut yaitu A1 dan L2 menunjukkkan bahwa gen
mutasi yang paling menonjol pada hiper-produser H915-1 ditemukan menyandikan
dehidrogenase suksinat-semialdehida yang terlibat dalam pintasan GABA dan protein
aconitase , yang dapat mempengaruhi produksi asam sitrat (Yin; dkk, 2017). Morfologi pelet
miselium sangat mempengaruhi fermentasi asam sitrat, jalur biosintesis hidrofobin dan
melanin dalam agregasi konidia dan tabung germinal tidak menunjukkan perbedaan di antara
ketiga strain terebut akan tetapi protein dinding sel tidak pada H915-1 tidak ada. Adanya
penemuan isolat mutan ini memberikan kemungkinan bahwa strain gen target dapat di
perbaiki.
Transkriptomik
Transkriptomik merupakan tening yang penting dalam genomik fungsional A.niger.
Sebelum adanya data genom, pertama kali DNA microarray pada A.niger hanya dapat
menyelidiki perubahan transkripsi dari 15 gene (MacKenzie; dkk, 2005). Pada tahun 2008,
Anderson dkk mengembangkan microarray 3 spesies Aspergilus yaitu dengan
membandingkan transkriptomik A.niger, A.nidulans, dan A.oryzae. Dengan adanya
microarray, Salazar dkk juga menjelaskan keragaman dari regulasi transkripsi metabolisme
gliserol pada spesies Aspergillus. Perbandingan transkiptom juga mengungkapkan perbedaan
penting antara CBS513.88 dan ATCC1015 (Andersen; dkk, 2011). Perbedaan yang dapat
dilihat yaitu perbedaan tingkat transkripsi dalam suatu kondisi yang sama. Dimana tingkat

4
transkripsi ATCC1025 lebih tinggi sehingga genome ini ditargetkan untuk meningkatkan
produksi asam sitrat dengan teknologi ekspresi berlebih.
Dibandingkan dengan teknologi DNA microarray, RNA sequencing (RNA-seq)
semakin banyak digunakan untuk analisis transkriptom karena sensitivitas, akurasi, dan
resolusi yang lebih tinggi (Vikman; dkk, 2014). Setelah analisis transkriptom pertama dari
genus Aspergillus menggunakan RNA-seq dilakukan di A. Oryzae. RNA-seq banyak
digunakan dalam ekspresi gen global untuk menyelidiki respon transkripsi dan regulasi
A.niger termasuk pemanfaatan sumber karbon dan regulas, perkembangan konidia dan
miselium, biosintesis dinding sel, ekspresi cluster gen metabolit sekunder dan metabolisme
asam organik. dalam transkripsi H915-1 selama fermentasi asam sitrat ditemukan bahwa 4 79
gen menunjukkan regulasi transkripsi yang signifikan dalam jalur metabolisme shunt GABA
dan transporter. Adapun mekanisme nya seperti gen pengkode isomerase fosfat jalurnya diatur
ke atas, piruvat kinase jalurnya diatur ke bawah, enzim dalam siklus TCA jalurnya diatur ke
bawah. Adapun Efek tambahan dari penggunaan ATP dapat menghambat enzim di jalur EMP.

Proteomik
Sama dengan transkriptomics, proteomik merupakan komponen penting dalam biologi
sistem, yang memungkinkan penilaian kualitatif dan kuantitatif dari semua protein dalam
suatu organisme dengan kondisi yang berbeda. Lu dkk menggumpulakan intraselluler dan
ekstraselluler proteom A.niger dibawah substrat karbon yang berbeda dengan menggunakan
elektroforesis gel 2-D/MALDI-TOF dan nano-HPLC MS/ MS. Mereka juga menemukan
sekretom yang secara dramatis dipengaruhi oleh substrat karbon ekstrakseluler. Adav dkk
menganalisis profil protein sekresi A.niger menggunakan Proteomik kuantitatif iTRAQ dan
menunjukkan bahwa terdapat 102 enzim yang disekresi yang memiliki kemampuan yang kuat
dan potensi degradasi polimer. Studi ini menemukan strategi baru untuk mengidentifikasi
transporter baru dan meningkatkan efisiensi trasnpor substart dan produk.

Metabolomik dan fluksomik

Metabolik merupakan sumber paling penting dalam bioteknologi industri, dengan
menggunakan profil metabolit global identifikasi perantara biosintesis dan hambatan
metabolik menjelaskan adanya perbedaan diferensiasi fenotipe. badan kerja komunitas

5
metabolomik menstandarisasi eksperimen reproduktifitas maksimum dan metode persiapan
sampel non-selektif dengan metode dan teknisi ini penilaian kuantitatif dari berbagai strategi
pengambilan sampel, pendekatan quenching dan teknik ekstraksi, merupakan prasyarat untuk
menghasilkan kumpulan data berkualitas tinggi yang dapat mempengaruhi kualitas data
metabolit dan interpretasi.
Penyelidikan awal ke dalam A.niger metabolomics mengadopsi -45 ° C 60% methanol
quenching yang sebelumnya telah diterapkan dalam ragi. banyak kelompok menunjukkan
bahwa konsentrasi metanol yang tinggi menyebabkan pemulihan metabolit intraseluler yang
lebih rendah, akibatnya -20 ° C 40% metanol lebih disukai digunakan sebagai larutan
quenching. Namun ditemukan bahwa fltrasi cepat dengan nitrogen cair merupakan
peningkatan lebih lanjut untuk menghentikan metabolisme sel A.niger, mengingat kerusakan
sel minimal, memulihan metabolit intraseluler yang tinggi dan relatif efisiensi quenching yang
efisien (Zheng; dkk, 2018)
Beberapa metode ekstraksi metabolit intraseluler telah digunakan pada A.niger, seperti
kloroform, metanol, buffer (CM) atau boiling ethanol (BE) (Lameiras; dkk, 2015). boiling
ethanol (BE) menunjukkan efisiensi ekstraksi yang lebih rendah dari tiga asam organik
(piruvat, malat dan 2-oksoglutarat) dibandingkan dengan asam tradisional dan alkali. Pada
metode metode ekstraksi asam dan alkalin tidak kompatibel pada analisis MS dan analisis
metabolik global. (LC-MS / MS) digunakan untuk menyelidiki dinamika metabolit dari waktu
ke waktu untuk isolat A.niger yang memproduksi sitrat secara berlebihan. Analisis
metabolomik menyarankan bahwa aliran jalur Embden-Meyerhof pathway (EMP) yang tinggi
dan prekursor asam sitrat yang tinggi akan menghasilkan akumulasi sitrat yang tinggi.
Analisis fuxomics juga merupakan strategi yang ampuh untuk mengungkap sifat
metabolik dan distribusi in vivo fux pada jamur flamentous seperti A.niger. Analisis aliran
metabolik 13C, misalnya, telah digunakan untuk menyelidiki perbedaan metabolik pada galur
penghasil berlebih enzim mutan. ekspresi berlebih dari fruktofuranosidase menyebabkan
adanya aktivasi jalur pentosa fosfat sitosolat (PPP) dan enzim malik mitokondria, serta suplai
NADPH memainkan peran penting dalam produksi fruktofuranosidase.

6
Model metabolik skala genom
Metabolik skala-genom memainkan peran penting dalam mengintegrasikan informasi
multi-omics dan menganalisis fenotipe secara kuantitatif, yang dengan demikian
memungkinkan prediksi apriori dari perilaku organisme dan penjelasan mekanisme molekuler
yang mana mendukung fenotipe tersebut. jaringan metabolisme skala-genom pertama dari
A.niger berdasarkan informasi genom CBS513.88 dan ATCC9029 termasuk enzim dengan
988 nomor EC unik, 2443 reaksi dan 2349 metabolit. Salinan tambahan dari gen penyandi
alternatif mitokondria oksidoreduktase (AOX) dan sintase sitrat (CS) ditemukan pada A.niger,
yang mungkin berkontribusi pada akumulasi asam sitrat. Akibatnya, kerangka pembacaan
terbuka ini merupakan kandidat yang luar biasa untuk rekayasa regangan rasional
menggunakan toolkit A.niger ekstensif.
model metabolik dinamis dikembangkan dengan metode pemodelan baru analisis
keseimbangan fux dinamis (dFBA), dengan rangkaian waktu produksi asam sitrat fermentatif,
yang menyediakan platform yang kuat untuk secara akurat mengeksplorasi efek perubahan
genetik pada fermentasi asam sitrat secara dinamis (Upton; dkk, 2017). Adanya akumulasi
asam sitrat relevan dengan regulasi hidrolisis polifosfat dan perilaku pertumbuhan diauxic.
Batasan pada hidrolisis polifosfat memiliki peran penting untuk akumulasi asam sitrat dengan
membatasi pertumbuhan sel.
Adapun akumulasi asam sitrat pada A.niger yaitu, pemanfaatan dan transportasi karbon
yang efisien yang dihasilkan dari enzim hidrolitik yang kuat dan sistem transpor glukosa,
aliran glikolisis tinggi yang dihasilkan dari penghambatan umpan balik ATP dan sitrat,
aktivitas anaplerotik C4 yang tinggi yang dikatalisis oleh piruvat karboksilase untuk
mengamankan suplemen prekursor, cis-aconitase rendah dan aktivitas dehidrogenase isocitrate
untuk mencegah degradasi sitrat, rantai pernapasan alternatif efisien yang dimediasi oleh AOX
untuk mempercepat oksidasi NADH dan regenerasi NAD+ dengan produksi energi yang lebih
sedikit, siklus ATP yang sia-sia dan konsumsi yang dikatalisis oleh ACL, defisiensi Mn 2+
menjaga fux glikolisis tinggi tetapi fux degradasi sitrat rendah melalui siklus TCA, dan pelet
miselium kompak untuk mengamankan transfer oksigen dengan menurunkan viskositas kaldu
fermentasi, dan ketahanan asam yang tinggi dimediasi oleh GABA shunt. Dengan bantuan
biologi sistem, terutama pemodelan metabolik skala genom, sekarang mungkin untuk
mengidentifikasi hambatan sebagai target untuk rekayasa metabolik A.niger, yang berupaya

7
merancang dan mengoptimalkan pewarnaan baru yang mampu meningkatkan produksi asam
sitrat pada bahan baku berbiaya rendah, termasuk limbah agro-industri dan biomassa
lignoselulosa, dengan pengurangan konsumsi energi dan pencemaran lingkungan.

Rekayasa metabolik pada A.niger untuk meningkatkan produksi asam sitrat.

Dengan perkembangnanya pemahaman tentang regulasi metabolisme asam sitrat,
secara bertahap dapat dilakukan rekayasa metabolisme secara rasional yang telah menjadi
pendekatan yang ampuh untuk meningkatkan produksi asam sitrat. Strategi rekasayasa
metabolik dirangkum dalam gambar 1 dan tabel 1 dibawah ini.

Figure 1 Metabolic engineering strategies for enchancing

Beberapa strategis dibandingkan, seperti ekspresi berlebih dari invertase, inulinase,
isositrat iyase dan piruvat karboksilase digunakan pada strain yeast Y.lipolitica (tabel 2),
strategi rekayasa metabolik yang diterapkan pada A.niger lebih komprehensif, termasuk
peningkatan pemanfaatan sumber karbon, sintesis asam sitrat, suplemen prekursor dan rantai
pernapasan alternatif, menghilangkan penghambatan umpan balik, menghilangkan produk
sampingan, dan sebagainya.

8
Table 1 Metabolic engineering strategies for enchaning citric acid production A.niger
Strain Rekayas Original Titer Produktivi Yield (g/g By- Kondisi
a Strain (g/L) tas (g/L/h) gula yang produk fermentasi
strategi dikonsum
en)
Pemanfaatan Sumber karbon
TNA ∆agdA CGMC 172.7, 2.4 0.96 ↓52.95 Media
101∆agdA C10142 ↑8.68% % Liquefied
corn, 180
g/L total,
72 h
OG1 ∆agdA CGMC 185.7, 2.58 1.03 ↓88.24 Media
↑glaA C10142 ↑16.87% % Liquefied
corn, 180
g/L total,
72 h
Rekayasa biosintesis asam sitrat
50-2-12 ↑pfkA, NW129/ 55, no 0.33 0,64 - Media
↑pki NW131 change sintetitak,
140 g/L
sukrosa,
168 h
55-14 ↑citA NW129/ 46, 0.27 0,52 - Media
NW131 ↓114,6% sintetitak,
140 g/L
sukrosa,
168 h
Meningkatkan suplemen prekusor pada jalurnya
Acl1-acl2 ↑acl1, ATCC1 42,↑32% 0.35 0.42 - Media
↑acl2 1015 sintetitak,
100 g/L
sukrosa,
120 h
∆acl ∆acl1 AB4.1 increase - 0.043 Suksin -
d at,
oksalat
,
glisero
l.
Frds(V)- ↑Frds1, N402 29.5,↑59 0.1 0.46 Okasal Media
FumRs ↑FumRs .46% at sintetitak,
50 g/L
sukrosa, 14
days
Menghilangkan produk sampingan
9
NW185 ∆goxC1 NW131 90, 0.375 0.64 No Media
7, ↑63.64% oksalat sintetitak,
∆prfF28 140 g/L
sukrosa,
240h
Reduksi umpan balik penghambat
∆1-3 ∆ggsA ATCC1 115,↓4.1 - 0.82 - Media shu
1414 7% dan
jhonson,
140 g/L
sukrosa,
TE23 ↑mt- A158 ~120, 0.4 0.80 - Media
pfkA10 ↑~85% sintetitak,
150 g/L
sukrosa,
~300h
Rekayasa respon Mn2+ dan morfologi
Brsa-25-3 ↓Brsa- ATCC1 2.5, 0.042 - - Media
25 1414 ↑35% sintetik, 10
g/L
glukosa, 60
h dalam
tabung
chsC-3 ↓chsC CBS513 180.3, 2.5 1.02 - Media
.88 ↑3.56% Liquefied
corn, 177
g/L total
sugar , 72 h
Regulasi rantai respirator
CGMCC5 Penamb CGMC 125.6, 2.11 0.82 - Media
751 ahan 0.2 C5751 ↓20.75% Liquefied
mg/L corn, 184
antimici g/L total ,
nA 72 h
CGMCC5 Penamb CGMC 151.67, 1.89 0.74 - Media
751 ahan 0.1 C5751 ↑19.89% Liquefied
mg/L corn, 184
DNP g/L total
sugar, with
0.2
mikrogram/
mL
antimicin
A, 72 h
CGMCC1 ↑AOXI CGMC 135.78, 2.27 0.89 - Media

10
0142-72 C10142 ↑7.32% Liquefied
corn, 184
g/L total
sugar, with
0.2
mikrogram/
mL
antimicin
A, 72 h
CGMCC1 ↑AOXI CGMC 169.1, 2.35 0.92 - Media
0142-102 C10142 ↑6.29% Liquefied
corn, 184
g/L total
sugar, with
0.2
mikrogram/
mL
antimicin
A, 72 h
CGMCC1 ∆AOXI CGMC 140.1, 1.95 0.76 - Media
0142-3-4 C10142 ↓11.95% Liquefied
corn, 184
g/L total
sugar, with
0.2
mikrogram/
mL
antimicin
A, 72 h
CGMCC1 ∆AOXI CGMC 125.6, 1.74 0.68 - Media
0142-4-10 C10142 ↓20.75% Liquefied
corn, 184
g/L total
sugar, with
0.2
mikrogram/
mL
antimicin
A, 72 h

11
Pemanfaatan sumber karbon
Aspergillus niger dapat mengeksresikan campuran enzim hidrolitik untuk
mendegradasi polimer kompleks dengan cepat yang ditemukan pada substrat yang relatif
murah menjadi monosakarida. Sumber karbon yang digunakan dapat berupa pati jagung cair,
yang akan menghasilkan sisa gula dari hasil produksinya sekitar 2-3%. Dikarenakan hal itulah
perlu dilakukan pengurangan sisa gula dari hasil fermentasinya dengan penghapusan gen agdA
penyandi α-glukosidase. α-glukosidase adalah senyawa yang dapat mensintesis iso-maltosa
yang merupakam komponen utama sisa gula dalam kaldu fermentasi asam sitrat.

Menigkatkan jalur suplemen prekusor

Asetil-KoA dan oksaloasetat adalah dua substrat langsung untuk sintesis asam sitrat.
Asetil-KoA dihasilkan oleh piruvat dehidrogenase (PDH), sitosol asetil-KoA sintetase (ACS)
dan ATP-sitrat lyase (ACL), dan asam lemak beta-oksidasi (Chen; dkk, 2014). Produksi asetil-
KoA oleh ACL dapat mengkonsumsi sitrat sehingga ACL harus dipertimbangkan bukan
sebagai penyedia prekursor tetapi konsumen produk. Akan tetapi , fungsi ACL saat ini masih
belum jelas. penghapusan acl1 pada A.niger AB4.1 menunjjukkan bahwa adanya peningkatan
asam organik termasuk asam suksinat dan asam sitrat (Meijer; dkk, 2009). penghapusan dua
subunit ACL sitosol (ACL1 dan ACL2) pada A.niger ATCC1015 mengakibatkan penurunan
produksi asam sitrat bersamaan dengan konidiogenesis aseksual berkurang, perkecambahan
konidia dan pertumbuhan sel. Begitu pula sebaliknya ekspresi yang berlebih menunjukkan hal
yang sebaliknya.
Oxaloacetate dibentuk oleh karboksilasi piruvat sitoplasma dan selanjutnya diubah
menjadi asam malat. Setelah memasuki mitokondria melalui malat-shuttle sitrat, asam malat
diubah kembali menjadi oksaloasetat dan oksaloasetat mengambil bagian dalam sintesis asam
sitrat. Oleh karena itu, de Jongh dan Nielsen merekayasa sitosol reduktif TCA (rTCA) siklus
dengan memasukkan heterogen malate dehydrogenase, fumarase dan fumarate reductase (de
Jongh; dkk, 2008). Ditemukan bahwa ekspresi berlebih dari sitosol fumarase FumR dan
sitosolat fumarat reduktase Frds1 meningkatkan hasil dan produktivitas asam sitrat, sedangkan
malat dehidrogenase Mdh2 hanya mempercepat laju produksi awal. (de Jongh; dkk, 2008).
Hal ini menunnjukkan bahwa potensi untuk memperkenalkan seluruh jalur biosintesis baru di

12
A.niger dan menyoroti bagaimana kapabilitas industri dapat dikembangkan dengan
menggunakan teknik metabolisme sistem dan biologi sintetik.

Reducing Feedback Inhibition (mengurangi penghambatan pada umpan balik)

Hexokinase sangat dihambat oleh trehalosa 6-fosfat, namun gangguan sintase 6-fosfat
trehalosa (ggsA) menyebabkan adanya inisiasi akumulasi asam sitrat dan produksi asam sitrat
akhir berurang dibandingkan dengan strain induk atau multisopi transforman(Arisan; dkk,
1996). Adanya asimilasi trehalosa yang diaktivasi oleh jalur pensinyalan cAMP-PKA pada
tahap pertumbuhan awal mungkin meringankan penghambatan heksokinase, yang
mengakibatkan pergeseran metabolisme glukosa dari jalur pentosa fosfat (PP) ke glikolisis,
dan secara bersamaan memulai akumulasi asam sitrat (Legisa; dkk, 2007).
PFK adalah langkah pengendalian penting lainnya untuk glikolisis aliran metabolisme
melalui penghambatan atau aktivasi alosterik. ATP dan asam sitrat adalah penghambat PFK.
Modifikasi spontan pasca-translasi memiliki peran penting dalam menjaga aktivitas tinggi
A.niger PFK1 (Legisa; dkk, 2007) PFK1 asli berukuran (85 kDa) dibelah menjadi fragmen
tidak aktif berukuran (49 kDa) yang dapat diaktifkan kembali dengan fosforilasi PKA.
Fragmen PFK1 yang lebih pendek tidak hanya tahan terhadap penghambatan sitrat tetapi juga
lebih rentan terhadap efek positif seperti ; AMP, ion amonium dan fruktosa 2,6-bifosfat yang
menekan penghambatan ATP. Adanya perancangan pada fragmen PFK1 pendek aktif
mtpfkA10 dengan mutasi situs tunggal T89D untuk menghindari persyaratan fosforilasi.
A.niger TE23, dibuat dengan mengekspresikan fragmen PFK1 aktif yang lebih pendek di
A.niger A158.

Regulating the Respiratory Chain (Mengatur rantai pernafasan)

Dalam jalur sintesis asam sitrat, konversi kuantitatif glukosa menjadi asam sitrat yang
menghasilkan 1 mol ATP dan 3 mol NADH dalam Siklus oksidasi NADH oleh respirasi yang
bergantung pada sitokrom biasanya menghasilkan ATP berlebih yang akan menghambat PFK
dan merusak aliran glikolisis. ketika asam sitrat mulai terakumulasi, respirasi yang bergantung
pada sitokrom digantikan dengan jalur alternatif yang memungkinkan oksidasi NADH tanpa
adanya produksi ATP secara bersamaan (Karaffa; dkk, 2003; Papagianni; dkk, 2007). Pada
akumulasi asam sitrat, aktivitas enzim pernapasan yang bergantung pada sitokrom terutama
13
untuk Kompleks I menurun karena adanya defisiensi Mn2+ sedangkan aktivitas AOX
meningkat. beberapa inhibitor fosforilasi oksidatif, seperti antimisin A inhibitor
suksinatecitokrom c atau pelepas fosforilasi oksidatif 2,4-dinitrofenol (DNP) yang berlebih
akan meningkatkan produksi asam sitrat sebesar 169,1 g / L dalam media fermentasi dengan
antimisin A. Jadi dapat disimpulkan studi atau percobaan ini juga dapat membuka jalan untuk
rekayasa gabungan dari rantai pernafasan yang bergantung pada sitokrom dan rantai
pernafasan alternatif oleh rekayasa promotor (Hou; dkk, 2018).

Enggineering Mn2+ Response and Morphology (teknik respon Mn2+ dan morfologinya)
Mn2+ memiliki peranan yang penting dalam akumulasi asam sitrat, Mn2+ mengganggu
metabolisme A.niger dalam beberapa cara, misalnya dengan mencegah penggunaan kembali
sitrat, menekan sintesis makromolekul (protein, DNA, trigliserida dan fosfolipid),
meningkatkan degradasi protein dan konsentrasi NH4+ intraseluler, mengubah rasio asam
lemak jenuh dan tak jenuh dalam membran plasma, memodifikasi konsentrasi polisakarida
dari dinding sel, dan mempengaruhi morfologi (Papagianni; dkk, 2007). transporter asam
amino putatif di kode oleh gen Brsa-25 yang terlibat dalam regulasi pembentukan morfologi
sebagai respons terhadap Mn2+. Penurunan regulasi ekspresi Brsa-25 oleh antisense RNA
membentuk kembali pelet miselium dan meningkatkan produksi asam sitrat sebesar 10% (Dai;
dkk, 2004). Adanya gangguan RNA dari gen sintase kitin (chsC) juga menyebabkan proporsi
miselia terdispersi yang lebih rendah dalam pelet miselium dan meningkatkan produksi asam
sitrat sekitar 42,6% (Sun; dkk, 2018). Respon Mn2+ dan regulasi morfologi sangat kompleks
yang melibatkan sejumlah besar gen dengan fungsi yang berbeda. Oleh karena itu, teknologi
pengeditan gen multipleks yang efisien sangat dibutuhkan untuk menguji efek sinergis dan
interaksi gen individu dalam suatu jaringan.

Generasi baru teknik untuk mempercepat rekayasa sistem metabolik pada A.niger
Teknik genom terbaru yang dapat digunakan untuk mempercepat rekayasa sistem
metabolik A.niger adalah Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats /CRISPR
associated protein (CRISPR/Cas) dengan cara pengeditan genom yang dapat dilihat pada
Figure 2 dan Table 2.

14
 SgRNA ekspresi Gene editing Donor Efisiensi Advantage Limitation
promotor terminator DNA s
PgpdA TtrpC NHEJ- - Some Less PAM Perlu
mediated Limitation ditambahkan
gene HH dan HDV
disruption
Sintesis In HR-mediated PyrG/150 28-100% Pengeditan Sulit digunakan
vitro gene deletion 0 genom untuk regulasi
secara gen, tergantung
langsung pada uptake
sgRNA dan
stabilitasnya
PmbfA Ttrpc NHEJ- - Some Less PAM Perlu
mediated limitation penambahan
gene HH dan HD, dn
disruption more cloning
HR-mediated pyrG/690 100% effort
gene deletion dan 834
PhU6 Ploy(T)6 NHEJ- - 15% Less PAM motif
mediated cloning
gene effort
disruption
PyU6 - 20%
PanU6 HR-mediated - 23%
gene deletion
PanU6 Hph/40 36%
5SrRNA Ploy(T)6 NHEJ- - 95.28- Efisiensi -
mediated 100% tinggi,
gene sedikit
disruption cloning,
dan sedikit
limit PAM
HR-mediated Hph/40 100%
gene deletion
Multiplex 48.83%
gene editing
Table 2 CRISPR/Cas9 genome editing systems used in A.niger
Nodvig,dkk menyampaikan penggunaan sistem CRISPR pertama kali pada Aspergillus
sp. Dimana penggabungan plasmid tunggal dari Cas9 dan sgRNA dengan menggunakan RNA
polimerase II sebagai promotor. Dilakukan penambahan 2 ribosom yang diletakkan pada 5’-
end dan 3’-end pada sgRNA untuk memastikan struktunya tepat (gambar 2a) (Nodvig; dkk,
2015). Kuivanen dkk, mengadopsi transkripsi in vitro menggunakan promotor T7 untuk

15
konstruksi sgRNA dan kemudian mengubah sgRNA dengan Cas9 yang diekspresikan plasmid
menjadi protoplas (gambar 2b)(Kuivanen; dkk, 2016; Kuivanen; dkk, 2017). Zheng dkk,
mengidentifikasi satu promotor U6 endogen(PanU6) dan menguji efisiensi sistem
CRIPSR/Cas 9. Semua promotor di uji dengan mengaktifkan transkripsi RNA panduan dan
gangguan gen (Gambar 2c). Efisiensi sistem CRISPR/Cas 9 tertinggi pada A.niger didapatkan
dari hasil penggunaan promotor U6 yang lebih jelasnya dapat dilihat pada tabel 2.

Figure 2 sistem pengedit genom CRISPR/Cas 9 pada A.niger

16
Figure 3 Systemic metabolic engineering of A.niger cell factory for citric acid production
Prospek lebih lanjut
Perkembangan biologi sistem dan teknologi pengeditan genom digunakan untuk
merekayasa A.niger secara sistemik untuk produksi asam sitrat yang lebih ramah lingkungan,
dengan keamanan pangan yang lebih baik, dan peningkatan efektivitas biaya. Siklus Learn-
DesignBuild-Test (LDBT) dibuat unruk merekyasa metabolik yang disesuaikan pada skala
besar dengan menggabungkan analisis-omics, pendekatan biologi komputasi dan alat alat
manipulasi genetik molekuler dan platform through-put yang tinggi. Adapun penjelasan
tahapnya yaitu:
Yang pertama, untuk membangun jaringan stoikiometri dan / atau biologis dinamis,
diperlukan data omics kuantitatif yang lebih absolut untuk mencapai desain holistik isolat
penghasil asam sitrat.
Yang kedua, dalam tiga rekayasa metabolik telah dikembangkan beberapa desain
seperti dalam prediksi target, termasuk desain berbasis pengetahuan saat ini, desain berbasis

17
omics komparatif, dan desain pemodelan silico. Strategi desain berbasis pengetahuan umum
sebagian besar berfokus pada peningkatan suplemen prekursor, pengurangan pembentukan
produk sampingan dan penghambatan umpan balik, yang biasanya dibatasi oleh kompleksitas
regulasi metabolisme. Pendekatan desain yang dilakukan oleh omics komparatif adalah untuk
membedakan gen kunci yang berkontribusi pada fenotipe spesifik di mana pemilihan strain
dan desai kondisi yang dapat dibandingkan, jika tidak, akan sulit untuk menentukan gen kunci
dari berbagai potensi perbedaan. Dalam skala genom A.niger telah dikembangkan untuk
kondisi yang berlebih (pada model stokiometri) dan kinetik diperlukan untuk menggambarkan
multi-omics dan data proses serta memprediksi perilaku A.niger dalam merespon perubahan
interior dan eksterior selama fermentasi asam sitrat, sehingga pemodelan metabolik skala
genom akan menjadi pendekatan sistem utama untuk mengoptimalkan desain rekayasa
metabolik.

Yang ketiga, untuk membangun strain yang dirancang dengan baik sesuai permintaan
ada tiga aspek yang harus lebih diperhatikan, termasuk konstruksi modul biologis sintetis,
konstruksi sasis yang kuat dan pengembangan kotak alat manipulasi genetik multipleks.
Teknologi pengeditan genom CRISPR / Cas9 memfasilitasi verifikasi dan realisasi prediksi
target. Rekayasa genom multipleks dan pengeditan basa bebas penanda harus dilakukan di
A.niger untuk mempercepat siklus rekayasa metabolik sistem untuk industrialisasi akhir.
Yang terakhir, semua data pengukuran lengkap akan diterapkan pada desain strategi
selanjutnya baik data pengumpulan spora, budidaya strain, deteksi metabolit dan optimasi
fermentasi, harus dikembangkan untuk diuji dan menyaring strain yang dirancang dengan baik
dalam skala besar.

18
Bab III Penutup
3.1 Kesimpulan
Dengan perkembangan pesat biologi sistem dan biologi sintetik, tujuan utama masa depan
bioteknologi A.niger adalah menghasilkan strain perancang dan papbrik sel(dalam
metabolismenya) dengan hasil konsentrasi dan produktivitas yang lebih tinggi. Dalam
meningkatkan pemanfaatan substrat, menghilangkan sintesis produk sampingan,
menghilangkan efek umpan balik negatif, meningkatkan suplemen prekursor, meningkatkan
efisiensi pengangkutan substrat dan asam sitrat, mengoptimalkan NADH regenerasi dengan
mengatur rantai pernapasan, meningkatkan kekokohan dan ketahanan terhadap tekanan
lingkungan, mengatur morfologi untuk mengikuti proses operasi. Banyak strategi pengeditan
genom yang dapat diterapkan untuk mencapai rekayasa metabolik, termasuk rekayasa
promotor gen target dengan promotor yang dapat diinduksi, rekayasa faktor transkripsi,
rekayasa transporter, dan regulasi transkripsi melalui sistem CRSIPRi / CRSIPRa atau RNAi.
Sebagai kesimpulan, desain holistik dari analisis multiomik dan pemodelan dinamis,
pengeditan genom yang dikombinasikan dengan biologi sintetik memberikan harapan besar
untuk mencapai desain rasional A.niger pada tingkat sistem.

3.1 Saran
Kelompok kami menyarankan untuk melakukan rekayasa terhadap mikroorganisme lain
meskipun hasil dari produksi asam sitratnya rendah. Karena dengan adanya data lengkap kita
dapat membandingkan produksi asam sitrat pada setiap mikroorganisme.

19
DAFTAR PUSTAKA
Amalia, dkk. (2019). Proses Pembuatan Asam Sitrat dari Molasses dengan Metode
Submerged Fermentation. Jurnal Teknik ITS Vol.8, No.2. ISSN: 2337-3539 (2301
9271). http://ejurnal.its.ac.id/index.php/teknik/article/view/45960/5995
Tong, Zhenyu, dkk. (2019). Systems Metabolic Engineering For Citric Acid Production By
Aspergillus Niger In The Post-Genomic Era. Tong et al. Microb Cell Fact.
https://doi.org/10.1186/s12934-019-1064-6.

20