BAB II

PEMBAHASAN
2.1 Cara Menghitung Konsesntrasi Asam Nukleat
2.1.1 Pengukuran DNA menggunakan spektrofotmeter
Pengukuran ini menggunakan H2O atau buffer TE 1X, untuk mensuspensikan
DNA. Dan tempatkan dalam kuvet, blanko yang digunakan adalah pelarutnya.
Larutkan DNA sampai memberikan pembacaan antara 0,1 sampai 1A.
Perhitungan :
Kuvet dengan pathlength 1 cm, pada 260 nm (OD260) = Absorban setara dengan :
1. 50µg/ml larutan ds DNA
2. 33µg/ml larutan ss DNA
3. 20-30µg/ml larutan ds oligonukleotida
4. 40µg/ml larutan RNA

Berikut cara menggunakan spektrofotmeter

Alat dan Bahan :

1. Kuvet kaca
2. Mikropipet
3. Yellow tip
4. Blue tip
5. Aquadest
6. Sample

Cara Kerja :

1. Masukkan 40 mikroliter sampel 1 dan 2 kedalam kuvet yang berbeda

menggunakan mikropipet dan yellow tip
2. Tambahkan 960 mikroliter aquadest ke masing-masing kuvet dengan
mikropipet menggunakan mikropipet dan blue tip, kemudian disuspensi
3. Kemudian siapkan blanko yang berisi aquadest saja
4. Dibaca menggunakan spektrofotometer UV VIS pada gelombang 260 nm dan
280 nm
5. Setting dulu spectrophotometer dengan Panjang gelombang 260nm
6. Lalu masukkan sampel dan blanko
 7. Ukur absorbansinya
- Sampel 1 (260nm) : 0,011 A
- Sampel 2 (260nm) : 0,073 A
8. Setting spektrofometer dengan Panjang gelombang 280nm
- Sampel 1 (280nm) : 0,001 A
- Sampel 2 (280nm) : 0,051 A

Cara menghitung :

Yang diketahui :

- Sampel 1 (260nm) : 0,011 A

- Sampel 2 (260nm) : 0,073 A
- Sampel 1 (280nm) : 0,001 A
- Sampel 2 (280nm) : 0,051 A
- Factor pengenceran : 25

Konsentrasi ds DNA = 50µG/ML × OD260 × factor pengenceran

2.2 Cara menilai kemurnian asam nukleat

2.2.1 Kemurnian sampel
Kemurnian sampel adalah umum untuk sampel asam nukleat terkontaminasi dengan
molekul lain (yaitu protein, senyawa organik, lainnya). Manfaat sekunder menggunakan
analisis spektrofotometri untuk kuantisasi asam nukleat adalah kemampuan untuk
menentukan kemurnian sampel menggunakan perhitungan 260 nm:280 nm. Rasio

260
absorbansi pada 260 dan 280 nm (A  ) digunakan untuk menilai kemurnian asam
280

260
nukleat. Untuk DNA murni, A   secara luas dianggap ~1,8 tetapi telah diperdebatkan
280
untuk menerjemahkan - karena kesalahan numerik dalam kertas Warburg asli - menjadi

260
campuran 60% protein dan 40% DNA. Rasio RNA A murni  adalah ~2.0. Rasio ini
280
biasanya digunakan untuk menilai jumlah kontaminasi protein yang tersisa dari proses
isolasi asam nukleat karena protein menyerap pada 280 nm.
Rasio absorbansi pada 260 nm vs 280 nm biasanya digunakan untuk menilai kontaminasi
DNA dari larutan protein , karena protein (khususnya, asam amino aromatik) menyerap
cahaya pada 280 nm. Kebalikannya, bagaimanapun, tidak benar dibutuhkan jumlah
kontaminasi protein yang relatif besar untuk secara signifikan mempengaruhi rasio
260:280 dalam larutan asam nukleat. 
Rasio 260:280 memiliki sensitivitas tinggi terhadap kontaminasi asam nukleat dalam
protein:

% % asam rasio
protein nukleat 260:280

100 0 0,57

95 5 1.06

90 10 1.32

70 30 1.73

Rasio 260:280 kurang sensitif terhadap kontaminasi protein dalam asam nukleat (tabel
ditunjukkan untuk RNA, DNA 100% kira-kira 1,8):

% asam nukleat % protein rasio 260:280

100 0 2.00

95 5 1.99

90 10 1.98

70 30 1.94

Perbedaan ini disebabkan oleh koefisien atenuasi massa yang jauh lebih tinggi

yang dimiliki asam nukleat pada 260 nm dan 280 nm, dibandingkan dengan
protein. Karena itu, bahkan untuk konsentrasi protein yang relatif tinggi, protein
memberikan kontribusi yang relatif kecil terhadap absorbansi 260 dan 280. Sementara
kontaminasi protein tidak dapat dinilai secara andal dengan rasio 260;280, ini juga berarti
bahwa hal itu memberikan sedikit kesalahan pada estimasi kuantitas DNA.