1.

Sterilisasi Alat dan Bahan

Tahap-tahap pencucian alat dan gelas. Alat-alat yang akan disterilisasi

terlebih dahulu harus dibersihkan dari lemak, kotoran ataupun senyawa

lainnya yang dapat mempengaruhi hasil sterilisasi dengan menggunakan

detergen ionik. Setelah dicuci persiapan alat untuk sterilisasi dengan cara alat-

alat dibungkus terlebih dahulu dengan kertas alumunium foil (alat berbahan

gelas) dan untuk kain kassa, tissue, dan kain flannel dimasukan pada amplop

perkamen tahan air, kemudian di sterilisasi kedalam autoklaf.

Langkah kerja sterilisasi adalah sebagai berikut :

 Autoklaf diisi dengan aquadest sesuai

 Memanaskan aquadest sampai mendidih

 Memasukan alat dan bahan yang akan di sterilisasikan, susun dalam rak autoklaf

 Memasukan rak kedalam autoklaf yang berisi air mendidih

 Autoklaf ditutup, kencangkan kunci penutup

 Klep pengaman yaitu, tempat uap air keluar untuk menjaga stabilitas tekanan, tetap

dibuka sampai terlihat ada uap air yang keluar ditandai dengan adanya air yang menetes

dari klep

 Menutup klep dan biarkan pemanasan terus berlangsung

 Perhatikan jarum petunjuk suhu dan tekanan yang perlahan-lahan akan naik
  Bila jarum telah mencapai suhu 121oC, maka klep pengaman akan berbunyi dan biarkan

selama 15 menit.

2. Cara Pembuatan Media Nutrient Agar Miring

Media agar yang digunakan adalah NA (Nutrient Agar). Pembuatan

nutrient agar miring akan digunakan untuk peremajaan bakteri

Staphylococcus aureus, dilakukan dengan cara :

 Menimbang sebanyak 1 gram NA (Nutrient Agar) dan 0,25 gram Sukrosa dilarutkan

kedalam 17 ml aquadest didalam beaker glass sambil dipanaskan dan diaduk sampai

berubah menjadi jernih dan homogen.

 Media NA (Nutrient Agar) dimasukkan kedalam 3 buah tabung reaksi (masing-masing

tabung reaksi diisi dengan 5 ml media NA (Nutrient Agar), kemudian disumbat dengan

kapas steril.

 Tiga buah tabung reaksi yang diisi media NA (Nutrient Agar) kemudian disumbat dan

sterilisasikan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.

 Kemudian memiringkan tabung reaksi dengan kemiringan 30o biarkan hingga padat.

Pembuatan media agar miring dilakukan secara aseptis.

3. Peremajaan Bakteri Staphylococcus aureus

Peremajaan biakan murni bakteri Staphylococcus aureus dilakukan

dengan cara :
  Setelah agar miring memadat, lakukan peremajaan bakteri Staphylococcus aureus .

Flambir jarum ose dari pangkal sampai ujung jarum hingga berwarna jingga kemerahan,

diamkan beberapa saat, lalu ambil inokula dari biakan bakteri Staphylococcus aureus

dengan menggunakan jarum ose

 Buka tutup tabung didekat api, tanam inokula biakan bakteri Staphylococcus aureus

kedalam media agar miring dengan cara menggoreskan jarum ose secara zig-zag

 Kemudian tutup kembali dengan kapas dana kasa steril

 Semua dilakukan secara aseptis

 Selanjutnya diinkubasi pada suhu 33-37oC selama 18-24 jam (Dirjen POM, 1995).

4. Pembuatan Suspensi Biakan Bakteri Staphylococcus aureus

Setelah diinkubasi selama 24 jam, biakan bakteri Staphylococcus aureus

dilarutkan dengan NaCl 0,9% steril yang diambil sebanyak 2,5 cc

disuspensikan kedalam tabung reaksi goyang-goyangkan beberapa saat hingga

tersuspensi sempurna, kemudian dibandingkan dengan larutan Mc.Farland.

5. Kesetaraan Mc.Farland

Standar Mc. Farland merupakan campuran kimia antara Barium Klorida

dan Asam Sulfat, jika direaksikan antara kedua bahan kimia ini berupa

endapan halus, Barium Sulfat. Ketika tercampur dengan baik, kekeruhan

standar Mc. Farland secara visual sebanding dengan suspensi bakteri.

 Standar Mc. Farland digunakan untuk membakukan perkiraan jumlah

bakteri dalam cairan suspensi dengan membandingkan kekeruhan uji suspensi

dengan standar Mc. Farland.

Standar Mc. Farland berada dalam bentuk skala yang bernomor 0,5 sampai

10 yang menjelaskan konsentrasi spesifik dengan bakteri per ml.

Cara membuat larutan Mc. Farland dengan cara :

 Disiapkan 11 tabung reaksi pada rak tabung dan dilabeli sesuai dengan skala Mc.Farland.

 Setiap tabung diisi dengan menggunakan larutan 1% BaCl2 dan 1% H2SO4 sesuai pada

tabel 3.5 Standar Mc.Farland.

 Kemudian tabung ditutup rapat kocok terlebih dahulu.

 Larutan ini akan stabil paling tidak selama 6 bulan.

Standar Mc. 1% Bacl2 1% H2SO4 Perkiraan jumlah

Farland (ml) (ml) suspensi bakteri/ml

0,5 0,05 9,95 1,5 x 108

1,0 0,10 9,90 3,0 x 108

2,0 0,2 9,80 6,0 x 108

3,0 0,3 9,7 9,0 x 108

4,0 0,4 9,6 1,2 x 109

5,0 0,5 9,5 1,5 x 109

6,0 0,6 9,4 1,8 x 109

7,0 0,7 9,3 2,1 x 109

8,0 0,8 9,2 2,4 x 109

 Standar Mc. 1% Bacl2 1% H2SO4 Perkiraan jumlah
Farland (ml) (ml) suspensi bakteri/ml

9,0 0,9 9,1 2,7 x 109

10,0 1,0 9,0 3,0 x 109

6. Pembuatan Media Agar Untuk Cawan Petri

Media agar yang digunakan yaitu media NA (Nutrient Agar). Pembuatan

media agar cawan petri yang akan digunakan untuk uji aktivitas antibakteri

sabun cair ekstrak daun Kemangi dan sabun cair ekstrak kulit Pisang Ambon

adalah sebagai berikut:

Tabel 3.6 Penimbangan bahan pembuatan media

cawan petri

Banyaknya Replikasi
No Bahan Satuan 1 cawan
cawan petri
petri

NA (Nutrient
1. gram 1 9
Agar)

2. Sukrosa gram 0,25 2,25

3. Aquadest ml 17 153

Pembuatan agar cawan petri digunakan dengan cara :

 Menimbang sebanyak 9 gram NA (Nutrient Agar) dan 2,25 gram

Sukrosa masukan kedalam beaker glass

 Tambahkan 153 ml aquadest

 Panaskan sampai larutan media NA (Nutrient Agar) menjadi jernih dan

homogeny

 Tuangkan kedalam erlenmeyer kemudian disumbat dengan kapas dan

kassa steril

 Lakukan sterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.