infectious laryngotracheitis

kelompok : Ameylia , alya yuvida, alya nur mahdani

1. Pengambilan, pengolahan dan pengiriman

Pengambilan dan Pengiriman Spesimen Untuk isolasi virus ILT, trakea dan
lelerannya, serta jaringan paru harus segera diambil pada saat fase akut awal penyakit.
Sampai suhu dalam botol steril dan disimpan dalam dingin. Jaringan trakea yang
terinfeksi diambil untuk menunjukkan adanya inklusi intranuklear secara histopatologi.
Sampel ke dalam botol berisi larutan buffer formalin 10%.

Sampel serum diperlukan untuk uji virus neutralization (VN) terhadap ILT untuk
menentukan adanya infeksi/penularan sebelumnya. Sampel serum harus disimpan atau
dikirim dalam keadaan dingin.

2. Metode diognosa :

● Isolasi virus
Untuk mengisolasi virus ILT dilakukan dengan cara menginokulasikan bahan
pemeriksaan berupa eksudat trakhea, larynx dan suspensi paru ke dalam telur ayam
berembrio (sebaiknya telur Spesific Pathogenic Free, SPF) yang berumur 9-12 hari ke
bagian membran korio alantoik (CAM). Bahan pemeriksaan eksudat dapat diambil
dengan menggunakan kapas bertangkai yang diulaskan pada bagian eksudat trakhea.
Pengambilan harus sedini mungkin setelah hewan terinfeksi oleh virus ILT dan juga
harus dalam keadaan segar, karena virus ILT tidak dapat terdeteksi bila pengambilan
spesimen melebihi waktu 6 hari dari munculnya gejala klinis penyakit (BAGUST, 1986).

Selain menggunakan telur ayam berembrio, isolasi virus ILT dapat pula
menggunakan biakan jaringan yaitu biakan jaringan hati embrio ayam (CELT), ginjal
ayam (CK) (WILLIAMS et al., 1992; BAGUST dan Guy, 1997), dan ginjal embrio ayam
(CEK) (CLARKE et al., 1980). HUGHEST dan JONES (1988) telah membandingkan
antara isolasi menggunakan . CAM, CEL dan CK, ternyata isolasi dengan biakan jaringan
CELT lebih sensitif bila dibandingkan dengan menggunakan CAM dan CK. Karena itu,
pemakaian biakan jaringan CELT merupakan alternatif yang baik dalam upaya
pengisolasian virus ILT. Setelah virus ILT berhasil diisolasi, kemudian diidentifikasi
dengan serum positif standar anti virus ILT dengan menggunakan uji AGID atau SN
● Serologis
Identifikasi secara tidak langsung dapat dilakukan secara serologis dengan
mengetahui antibodi virus ILT ‘(Jordan, 1990). Tripothy dan Hanson (1989)
menyatakan ada beberapa teknik uji serologis yaitu: uji agar gel presipitasi, uji
netralisasi, uji enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), dan uji antibodi
fluoresen dengan fluoresen-isothiocyanate yang dilabelkan pada antibodi spesifik
terhadap virus ILT.

Identifikasi Serologis :

A. Uji Agar Gel Presipitasi (AGP).

Agar muni (agar murni) 0,3% dilárutkan dalam aquadestilata steril,

didihkan hingga mendidih, kemudian diteteskan pelan-pelan pada obyek
gelas yang ditempatkan di meja datar. Lapisan yang terbentúk didiamkan
sampai dipindahkan dan dipindahkan ke dalam inkubator suhu 37°C
selama 24 jam (proses pelapisan/pelapisan). Kaca objek tersebut
kemudian diambil dan ditambahkan agar murni 1% dalam phosphate
buffer saline (PBS), yang mengandung 8,5% NaCl sebanyak 5 ml dengan
pipa ukur 5 ml. Setelah mengeras dibuat sumuran satu di teng dan
dikelilingi dua sumuran sesuai pola yang ada Spesimen virus ILT isolat
MF sebanyak 50 mikroliter. diteteskan ke dalam sumuran di tengah
menggunakan mikropipet, sedangkan sumuran d sekelilingnya diteteskan
serum anti isolat MF dar serum anti virus ILT (kontrol positif) sebanyak
50 mikroliter. ditempatkan dalam cawan petri berdiameter 20 obyek
tersebut kemudian dilapisi dengan kapas basah yang ditempatkan di atas
meja dalam serta diinkubasi pada suhu kamar selama 24-48 jam. Uji AGP
positif bila terbentuk garis presipitasi di antara sumuran antigen dan
antibodi (Beard. 1989)

B. Uji Netralisasi.
Prosedur uji netralisasi mengacu pada Beard (1989), yaitu; serum
anti virus kedua, diinaktivasi dalam penangas air pada suhu 56°C selama 1
jam. Serum tersebut kemudian 'diencerkan secara bertingkat 2 sampai 2
dalam suatu tabung reaksi ukuran 7 ml. Tiap 0,5 ml enceran serum anti
ditambahkan 0,5 ml virus ILT isolat MF yang didalamnya terkandung 10
kali 500 DI-50, Dosis inokulasi yang diberikan adalah 0,1 ml yang berarti
setiap inokulasi mengandung virus 500 DI-50 (Sardjono komunikasi
pribadi). Sebagai kontrol yang digunakan serum normal atau PBS. Uji
netralisasi bekerja secara berpasangan/homolog, dan secara
bersamaan/heterolog. Uji tersebut menggunakan telur ayam berembrio
umur 9-12 hari dengan inokulasi pada membran. Prosedur kerja inokulasi
tersebut mengacu pada metode Burleson et al, korio alantois 1999
C. Uji ELISA
a. Penyiapan antigen ELISA ILT Antigen
 ELISA ILT dibuat dan disiapkan mengikuti prosedur
MEULEMANS dan HELEN (1982) dengan beberapa modifikasi. Virus
yang dipergunakan adalah virus ILT yang telah diatenuasi (Laryng-Vac
Intervet). Virus ini ditumbuhkan pada biakan sel yang dibuat dari sel hati
embrio ayam specific pathogenic free (SPF) pada flask plastik ukuran 175
cm2 . Sel ini selanjutnya disebut cell liver (CELi). Sel yang telah diinfeksi
virus ILT diinkubasikan pada suhu 370 C selama 48-72 jam. Bila pada
biakan sel telah terlihat cytopathogenic effect (CPE), sel kemudian
dibeku-cairkan dua kali. Cairan supernatan dari biakan sel diambil dan
dipusing dengan kecepatan 5.000 x g selama 30 menit. Selanjutnya cairan
supernatan tadi dipusing kembali menggunakan sentrifuse ultra dengan
kecepatan 50.000 x g pada suhu 40 C selama 120 menit. Pelet yang
dihasilkan ditambah larutan tris bufferpH7,4dan disimpan pada suhu –300
C. Kontrol antigen disiapkan dari biakan jaringan sel CELi yang tidak
diinfeksi dengan virus ILT. Cel ini dibeku-cairkan dua kali. Selanjutnya
diproses dan disimpan sama seperti pembuatan antigen ELISA ILT dan
disimpan pada suhu –30 derajat C.

b. Pembuatan serum standar ILT

Serum standar negatif diperoleh dari 8 ekor ayam SPF berumur 6
minggu. Sedangkan serum standar ILT dibuat pada 8 ekor ayam SPF umur
6 minggu yang divaksin dengan vaksin komersil (Laryngo-vac, Intervet).
Vaksinasi pertama diberikan melalui intra trakea dengan dosis 102, 4
TCID50. (MEULEMANS dan HALEN, 1982). Setelah 3 minggu ayam
diinfeksi dengan virus asal vaksin ILT komersial (Laryngo-vac, Salsbury
Lab. Inc. Charles City, Iowa) secara intra muskuler. Virus vaksin ini
ditumbuhkan terlebih dahulu pada biakan jaringan CELi dan dimurnikan.
Pemurnian virus ini menggunakan sentrifuse ultra dengan kecepatan
50.000 x g pada suhue 40 C selama 120 menit dan selanjutnya pellet virus
yang diperoleh dimasukkan pada sucrose gradient dengan konsentrasi 30%
dan 50% kemudian di pusing dengan kecepatan 50.000 x g pada suhu 40 C
selama 120 menit. Lapisan awan antigen yang terbentuk kemudian
dicampur dengan Freund’s Complete Adjuvant dengan perbandingan 1:1
(YORK et al., 1983). Darah ayam diambil pada minggu ke 2 dan 3 pasca
vaksinasi ke dua. Serumnya dipisahkan dan dikumpulkan (pooled sera).
Serum ini memiliki titer antibodi virus ILT dengan uji ELISA (kit
produksi Tropbio) yaitu, pada standar group ELISA 7 atau 256 ELISA
unit (Eu). Serum ini dapat digunakan sebagai standar positif serum
terhadap virus ILT (YORK et al., 1983
 c. Prosedur ELISA Prosedur
Dari teknik ELISA yang dikembangkan mengikuti prosedur OIE
(1996) dengan modifikasi yaitu, menggunakan lempeng mikrotiter dari
bahan polysterene (Nunc Laboratories). Setiap lubang lempeng mikrotiter
diisi 50µl antigen, dan diinkubasikan pada suhu 37 C selama 60 menit.
Lempeng mikrotiter dicuci 3 kali dengan phosphat buffer saline (PBS) pH
7,2 mengandung 0,05% tween20 (PBST). Sebanyak 50 µl serum ayam
diencerkan 1:100 dalam Tris-EDTA-NaCl (TEN) dan 5% casein (TENC)
lalu ditambahkan ke dalam lempeng mikrotiter. Selanjutnya lempeng
mikrotiter diinkubasi-kan selama 60 menit pada suhu kamar dan dicuci
dengan PBST sebanyak 3 kali. Kemudian 50 µl konjugat Rabbit
antichicken IgG-HRPO (Sigma. Cat. log no. A.9046) ditambahkan
kedalam setiap lubang lempeng mikrotiter dan dibiarkan selama 60 menit
pada suhu kamar, selanjutnya lempeng mikrotiter dicuci dengan PBST 3
kali. Setiap lubang lempeng ditambahkan 100 µl substrat 2,2–Azino-di-(3-
athyl-benzthiazolinsulfonat(6) (ABTS) (Sigma. Cat. log no. A.1888) dan
dibiarkan pada suhu kamar selama 60 menit. Intensitas warna yang
dihasilkan diukur dengan alat pembaca ELISA pada panjang gelombang
490 nm dan dinyatakan dalam nilai densitas optik (OD).
 Daftar Pustaka
Bagust, T.J. dan Guy, J.S. 1997.Laryngotracheitis. Dalam Calnek, B.W., Barnes, H.J.,
Beard, C. W., McDougld, L. R., dan Saif, Y.M. (eds). Diseases of Poultry. Tenth
edition. Iowa State University Press., Ames, Iowa. Hal.: 527-536.

Beard, C.W. 1989. Serologic Procedures. Dalam Purchace, H.G., Arp, H. L.,
Domermuth„ C. H., dan Pearson, J.E. (eds). A Laboratory Manual for the
Isolation and Identification of Avian Pathogens. Third edition. Kendall/Hunt
Publishing Company, Iowa. Hal.: 192-200.

Hanson, L.E., dan Bagust, T.J. 1991. Laryngotrncheitis. dalam: Calnek,

B.W., Barnes, H.J., Beard, C.W., Reid,W.M. dan Yoder Jr., H.W. (eds).
Diseases of Poultry. Ninth edition. Iowa State University Press, Ames, Iowa.
pp: 485-592.

Jordan, F.T.W. 1990. Infectious Laryngotracheitis. Dalam Jordan, P.T.W. (ed) . Poultry
Diseases. The University Press, Cambridge, Creat Britain. Hal.: 154-158.

Indriani et al. (2002). Pengembangan Teknik Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Elisa)
Untuk Mendeteksi Adanya Antibodi Terhadap Virus Infectious Laryngotracheitis
(Ilt) Dalam Serum Ayam. Jitv, 7(2), 130–137.