Tujuan western blotting adalah untuk memisahkan protein pada gel sesuai dengan berat

molekulnya. Protein kemudian ditransfer ke membran di mana mereka dapat dideteksi

menggunakan antibodi.

PERSIAPAN SAMPEL.Panaskan sampel pada 95˚t C selama lima hingga 10 menit dalam buffer
sampel yang mengandung zat pereduksi seperti beta merkaptoethanol. Ini menghasilkan protein
yang dilinierisasi dengan muatan negatif yang sebanding dengan ukurannya. Tempatkan gel ke
dalam tangki elektroforesis dan tambahkan larutan penyangga, pastikan bagian atas wells/sumur
tertutup. Persentase akrilamida dari gel yang digunakan tergantung pada berat molekul protein
target. Masukkan penanda berat molekul/tangga protein ke jalur pertama, lalu masukkan sampel
ke dalam wells/sumur yang berdekatan. Semua sampel harus mengandung jumlah protein yang
sama.

Setelah semua sampel dimuat, tambahkan running buffer. Pasang tutup tangki elektroforesis.
Nyalakan daya dan setel voltase yang direkomendasikan oleh manufaktur gel dan tangki gel.
Anda seharusnya bisa melihat gelembung yang naik melalui tangki. Jalankan gel sampai bagian
dye front bergerak secukupnya ke bawah gel.

TRANSFER. Tahap selanjutnya adalah mentransfer protein dari gel ke membran. Membran
biasanya terbuat dari nitroselulosa atau PVDF. Keluarkan gel dari tangki dan lepaskan dengan
hati-hati dari wadah plastiknya. Potong wells/sumur dan kaki gel, lalu tempatkan gel ke dalam
buffer transfer. Siapkan tumpukan transfer dengan mengapit membran dan gel di antara kertas
saring dan spons. Membran harus paling dekat dengan elektroda positif dan gel paling dekat
dengan elektroda negatif. Gunakan roller kecil untuk menghilangkan gelembung di antara gel
dan membran. Tutup kotak transfer, dan rendam ke dalam tangki transfer yang berisi buffer
transfer. Tambahkan air ke ruang bagian luar agar sistem tetap dingin dan tutup. Nyalakan catu
daya untuk memulai transfer protein. Waktu dan voltase memerlukan pengoptimalan, jadi
periksa petunjuk dari pabrik sebagai panduan. Sekarang protein telah bermigrasi dari gel ke
membran nitroselulosa, protein yang diinginkan dapat dideteksi dengan antibodi. Membran dapat
dikeluarkan dari kaset dan penanda berat molekul harusnya dapat terlihat sekarang. Jika
diperlukan, transfer protein dapat dikonfirmasi dengan pewarnaan membran dengan larutan
Ponceau S.

BLOCKING.Untuk mencegah ikatan non spesifik dari antibodi, membran perlu diblok.
Tuangkan buffer blocking ke membran dan kocok perlahan di atas rocker. Biasanya ini
dilakukan dengan menggunakan larutan 5% persen susu atau Bovine Serum Albumin, BSA,
selama dua jam pada suhu kamar atau semalam pada suhu empat derajat C (Inkubasi pada suhu
kamar selama 2 jam atau semalam pada suhu 4˚) C). waktu dan jenis buffer pemblokiran harus
dioptimalkan, jadi untuk mengetahui detailnya, periksa lembar data antibodi utama yang ingin
Anda gunakan. Setelah membran terblokir, lepaskan buffer pemblokiran dan tambahkan antibodi
primer yang telah diencerkan ke dalam larutan yang sama.
INKUBASI ANTIBODI UTAMA. Inkubasi di atas rocker seperti sebelumnya. Biasanya,
inkubasi antibodi primer dilakukan selama satu jam pada suhu kamar, atau semalam pada suhu
empat derajat C. Konsentrasi antibodi dan waktu inkubasi perlu dioptimalkan. Lihat lembar data
antibodi untuk panduan. Tuang antibodi primer dan bilas membran dua kali dalam wash buffer.
Lanjutkan dengan satu kali pencucian 15 menit, dan tiga kali pencucian 10 menit di atas rocker.
Buffer pencuci biasanya menggunakan tris-buffered saline, TBS, atau buffered saline fosfat,
PBS, dengan 0,1% tween 20. Tuang buffer pencuci dan membran inkubasi dalam antibodi
sekunder konjugasi, yang telah diencerkan dalam buffer pemblokiran. Biasanya ini dilakukan
selama satu jam pada suhu kamar, tetapi konsentrasi antibodi dan waktu inkubasi perlu
dioptimalkan. Tuang antibodi sekunder dan cuci membran seperti yang ditunjukkan sebelumnya.

DETEKSI. Ada beberapa sistem yang berbeda untuk pendeteksian. Jika antibodi sekunder
terkonjugasi ke enzim, inkubasi membran dalam substrat yang sesuai sebelum imaging. Jika
antibodi sekunder adalah konjugat fluoresen, Anda dapat langsung melanjutkan ke langkah
imaging. Imaging dapat dilakukan dengan sinar-X atau dengan sistem imaging digital.
Tempatkan membran ke dalam baki imaging. Tempatkan baki imaging ke dalam sistem imaging.
Waktu pemaparan kemungkinan besar perlu dioptimalkan untuk mendeteksi pita dengan jelas
yang berkaitan dengan protein yang diinginkan.