Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.
com
Jurnal dari
Dipersonalisasi
Obat-obatan
Artikel
Biomarker Saliva untuk Deteksi Karies Gigi dan
Pemantauan Pribadi
Pune N. Paqué 1,*,† , Christopher Herzo 2,†, Daniel B. Wiedemeier 3 , Konstantinos Mitsakakis 4,5
Thomas Attin 1, Kai Bao 6, Georgios N. Belibasakis 6 , John P. Hays 7, Joël S. Jenzer 1, Wendy E. Kaman 7,8, Michal
KarpoSayaek 9, Philipp Korner 1, Johannes R. Peham 2, Patrick R. Schmidlin 1 , Thomas Thurnheer 1 ,
Florian J. Wegehaupt 1
Kutipan: Paque, PN; Herz, C.;
Wiedemeier, DB; Mitsakakis, K.;
Attin, T.; Bao, K.; Belibasaki, GN;
Hays, JP; Jenzer, JS; Kaman, KAMI;
dkk. Biomarker Saliva untuk Deteksi
Karies Gigi dan Pemantauan Pribadi.
J. Pers. Med.2021, 11,
235. https://doi.org/10.3390/
jpm11030235
Editor Akademik: Gaetano Isola
Diterima: 12 Februari 2021
Diterima: 19 Maret 2021
Diterbitkan: 23 Maret 2021
Catatan Penerbit: MDPI tetap netral
sehubungan dengan klaim yurisdiksi
dalam peta yang diterbitkan dan afiliasi
institusional.
Hak cipta: © 2021 oleh penulis.
Penerima Lisensi MDPI, Basel, Swiss.
Artikel ini adalah artikel akses terbuka
yang didistribusikan di bawah syarat
dan ketentuan lisensi Creative
Commons Attribution (CC BY) (https://
creativecommons.org/licenses/by/
4.0/).
J. Pers. Med.2021, 11, 235. https://doi.org/10.3390/jpm11030235
,
dan Nagihan Bostanci 6
1 Klinik Kedokteran Gigi Konservatif dan Pencegahan, Pusat Kedokteran Gigi, Universitas Zurich,
Plattenstrasse 11, 8032 Zurich, Swiss; thomas.attin@zzm.uzh.ch (TA); joel.jenzer@icloud.com (JSJ);
philipp.koerner@zzm.uzh.ch (PK); patrick.schmidlin@zzm.uzh.ch (PRS);
thomas.thurnheer@zzm.uzh.ch (TT); florian.wegehaupt@zzm.uzh.ch (FJW)
2 Institut Teknologi Austria, Diagnostik Molekuler, Giefinggasse 4, 1210 Wien, Austria;
christopher_herz@pall.com (CH); johannes.peham@ait.ac.at (JRP)
3 Layanan Statistik, Pusat Kedokteran Gigi, Universitas Zurich, Plattenstrasse 11, 8032
Zurich, Swiss; daniel.wiedemeier@zzm.uzh.ch
4 Hahn-Schickard, Georges-Koehler-Allee 103, 79110 Freiburg, Jerman;
konstantinos.mitsakakis@hahn-schickard.de
5 Laboratorium Aplikasi MEMS, IMTEK-Department of Microsystems Engineering,
University of Freiburg, Georges-Koehler-Allee 103, 79110 Freiburg, Jerman
6 Departemen Kedokteran Gigi, Divisi Penyakit Mulut, Karolinska Institutet, 141 04 Huddinge, Swedia;
kai.bao@ki.se (KB); george.belibasaki@ki.se (GNB); nagihan.bostanci@ki.se (NB)
7 Departemen Mikrobiologi Medis dan Penyakit Menular, Pusat Medis Universitas Erasmus
Rotterdam (Erasmus MC), 3015 GD Rotterdam, Belanda; j.hays@erasmusmc.nl (JPH);
wekaman@acta.nl (MINGGU)
8 Pusat Akademik untuk Kedokteran Gigi Amsterdam (ACTA), Departemen Biokimia Lisan, Universitas
Gratis Amsterdam dan Universitas Amsterdam, 1081 LA Amsterdam, Belanda
9 BioVendor-LaboratornSaya MedisSayana, sebagai, Divisi Produk Penelitian dan Diagnostik, Immunoassays,
Validasi Klinis & Layanan Pengujian Analitis BioVendor, Karasek 1767/1, 62100 Brno, Republik Ceko;
karpisek@biovendor.com
* Korespondensi: punenina.paque@zzm.uzh.ch ; Tel.: +41-(0)4-4634-3988
Para penulis ini berkontribusi sama untuk pekerjaan ini.
Abstrak: Penelitian ini menyelidiki potensi bakteri saliva dan penanda protein untuk mengevaluasi
status penyakit pada individu sehat atau pasien dengan gingivitis atau karies. Sampel air liur dari
individu yang bebas karies dan gingivitis (n = 18), pasien dengan gingivitis (n = 17), atau pasien dengan
lesi karies yang dalam (n = 38) dikumpulkan dan dianalisis untuk 44 kandidat biomarker (sitokin,
kemokin, faktor pertumbuhan, matriks metaloproteinase, inhibitor metalopeptidase, enzim proteolitik,
dan bakteri mulut terpilih). Data yang dihasilkan menjadi sasaran analisis komponen utama dan
digunakan sebagai set pelatihan untuk pemodelan hutan acak (RF). Analisis komputasi ini
mengungkapkan empat biomarker (IL-4, IL-13, IL-2-RA, dan eotaxin/CCL11) sangat penting untuk
penggambaran karies yang benar pada 37 dari 38 pasien. Model RF kemudian digunakan untuk
mengklasifikasikan 10 subjek (lima bebas karies/gingivitis dan lima dengan karies), yang diikuti selama
enam bulan. Hasilnya dibandingkan dengan penilaian klinis spesialis gigi, mengungkapkan korelasi
tinggi antara prediksi RF dan klasifikasi klinis. Karena sensitivitas superior model RF, ada perbedaan
dalam prediksi dua karies dan empat subjek bebas karies/gingivitis. Temuan ini menunjukkan IL-4, IL-13,
IL-2-RA, dan eotaxin/CCL11 sebagai biomarker saliva potensial untuk mengidentifikasi karies noninvasif.
Selanjutnya, kami menyarankan hubungan potensial antara pensinyalan JAK/STAT dan onset dan
perkembangan karies gigi.
Kata kunci: diagnostik; interleukin; penyaringan; pemantauan pribadi; air liur; biomarker; karies;
JAK; STAT
https://www.mdpi.com/journal/jpm
J. Pers. Med.2021, 11, 235 2 dari 18

1. Perkenalan
Tujuan utama dalam kedokteran gigi adalah pemeliharaan kesehatan mulut dan
pencegahan penyakit mulut, seperti karies atau periodontitis.1]. Penyakit-penyakit tersebut
didasarkan pada biofilm rongga mulut, yang dapat berkembang pada semua permukaan dalam
rongga mulut [2,3]. Pergeseran komposisi mikrobioma oral membuka jalan bagi patogen
oportunistik untuk menginduksi wabah dan perkembangan penyakit.4-6]. Perkembangan lesi
karies didorong oleh mikroorganisme, kebiasaan diet (frekuensi asupan karbohidrat, pH dan
kelengketan sisa makanan), dan faktor host (laju aliran saliva, respon imun, predisposisi genetik).7
] dan tindakan kebersihan) [8-10]. Mikroorganisme menghasilkan asam organik yang kuat selama
metabolisme karbohidrat mereka dan menginduksi hilangnya mineral dalam substansi gigi yang
menyebabkan kerusakan gigi.11]. Lesi karies yang berlanjut menyebabkan inflamasi pulpa, yang
menyebabkan pulpitis dan periodontitis periapikal. Beberapa bakteri, sepertiStreptokokus dan
Lactobacillus, terutama terkait dengan perkembangan lesi karies ini [2,12]. Biofilm yang menetap
di sekitar gigi pada sulkus gingiva juga dapat menyebabkan gingivitis.13,14]. Penyakit periodontal
ini menginduksi respon inflamasi pada pejamu, menyebabkan pembengkakan marginal pada
gingiva, peningkatan eksudasi cairan sulkus gingiva (GCF) dan peningkatan berturut-turut pada
kedalaman poket lokal.15]. Biofilm yang menginduksi gingivitis dan periodontitis terutama terkait
dengan bakteri anaerob Gram-negatif, sedangkan bakteri yang terkait dengan karies sebagian
besar terkait dengan bakteri fermentasi karbohidrat Gram-positif.15]. Namun, komposisi
mikrobioma mulut atau gigi tertentu mungkin tidak secara eksklusif terkait dengan pemeliharaan
kesehatan atau penyakit mulut.16]. Telah ditunjukkan bahwa pasien yang tidak melakukan
prosedur kebersihan mulut kemudian mengembangkan respons yang berbeda terhadap
akumulasi plak mereka.13,17,18]. Respons klinis yang berbeda ini memungkinkan klasifikasi
menjadi "resistensi periodontal" dan "periodontal-insufisiensi" atau "responden tinggi" dan
"responden rendah", masing-masing [18]. Oleh karena itu, respons pejamu terhadap rangsangan
patogen juga berperan dalam pemeliharaan kesehatan mulut atau perkembangan penyakit.
Dengan demikian, perubahan kecil patogen dalam rongga mulut dapat didiagnosis pada tahap
awal, dengan analisis molekuler dari penanda imun inang. Pergeseran komposisi biomarker
dalam GCF telah dijelaskan sebelumnya pada pasien gingivitis.19-21]. Untuk pasien karies,
kedekatan odontoblas dan pulpa gigi dengan lesi menyebabkan respon imun host yang
mengarah pada produksi dan pelepasan beberapa sitokin, kemokin, dan faktor pertumbuhan.22].
Respon inflamasi gingivitis dan karies terjadi dengan adanya air liur di seluruh rongga mulut.
Dengan demikian, cairan mulut ini bertindak sebagai matriks koleksi untuk molekul pertahanan
kekebalan yang dilepaskan dan mikroorganisme pada kedua penyakit.
Sebagian besar penelitian saat ini berfokus pada deteksi target biofluid potensial untuk
pasien periodontitis dengan menggunakan prosedur analitis untuk biofluida seperti saliva atau
cairan sulkus gingiva. Konsensus saat ini di antara para ahli gigi condong ke arah strategi
gabungan dan multitarget untuk identifikasi pasien berisiko tinggi/rendah, melalui penilaian
respons terhadap terapi dan prediksi stabilitas periodontal. Hal ini dapat dicapai dengan
kombinasi yang divalidasi dari biomarker saliva yang diturunkan dari inang dan patogen kunci.23-
26]. Panel biomarker umum termasuk sitokin (seperti interleukin IL-6 dan IL-1β), matriks
metaloproteinase (MMP-8 dan MMP-9), inhibitor metalopeptidase (TIMP-1) dan adanya patogen
periodontal (misalnya,Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tanerella forsythia,
Fusobacterium nucleatum, Campylobacter rektus, dan Prevotella intermedia) [27-33].
Pengetahuan tentang penanda respon imun pulpa gigi biasanya diperoleh dengan
penilaian langsung jaringan pulpa dan, lebih jarang, dengan analisis darah pulpa, serum
darah perifer, GCF, cairan dentin, atau cairan pulpa ekstraseluler.22,34]. Sayangnya, relatif
sedikit yang diketahui tentang kombinasi biomarker saliva yang diperlukan untuk
mengidentifikasi pasien karies atau pasien yang rentan terhadap karies.35,36]. Faktanya,
hanya sedikit penelitian yang menunjukkan perbedaan komposisi protein saliva antara
pasien sehat dan karies.37-39], dengan parameter saliva diselidiki termasuk peptida kaya
prolin dasar [37], total beban protein [38], dan komposisi protein total menurut pola berat
molekul [39]. Analisis molekuler untuk tanda karies saliva masih relatif belum dieksplorasi.
J. Pers. Med.2021, 11, 235 3 dari 18

Kontak langsung saliva dengan lesi oral, serta ketersediaan saliva yang sederhana,
menyoroti potensi penggunaannya sebagai media diagnostik untuk mendeteksi penyakit mulut.40
,41]. Selanjutnya, karena etiologi karies multifaktorial yang disebutkan di atas dan tantangan
terkait dalam pengembangan strategi pencegahan dan pengobatan, ada kebutuhan untuk
diagnosa cepat yang dipersonalisasi.42,43]. Faktanya, penemuan biomarker saliva yang sesuai
mungkin memungkinkan identifikasi awal pasien berisiko tinggi yang rentan mengalami gingivitis,
sementara memungkinkan deteksi dini perkembangan lesi karies. Selanjutnya, biomarker
tersebut dapat digunakan untuk menilai status individu yang sehat secara oral, termasuk dalam
pemantauan pasien, dari waktu ke waktu.
Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk menganalisis saliva dari 73 subjek, yang
dikelompokkan berdasarkan diagnosis klinis menjadi individu yang sehat, pasien dengan gingivitis
dan pasien dengan lesi karies dalam yang tidak diobati. Inti dari penelitian ini adalah pendekatan
multimetode eksplorasi yang bertujuan untuk mengidentifikasi biomarker yang sesuai yang dapat
memprediksi karies gigi. Tujuan kedua adalah untuk mendeteksi pasien gingivitis dalam kohort
yang sama. Selain itu, 10 subjek (lima bebas karies/gingivitis dan lima dengan karies) diikuti
selama enam bulan, dan saliva dikumpulkan untuk analisis biomarker. Dihipotesiskan bahwa
kombinasi penanda kandidat protein dan mikroba dapat memungkinkan diferensiasi antara
semua kelompok dan divalidasi lebih lanjut dengan 10 subjek tindak lanjut.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Populasi Studi dan Desain Studi

Individu yang datang untuk pemeriksaan atau perawatan gigi ke Pusat Kedokteran Gigi,
Zurich, dan yang memenuhi kriteria inklusi/eksklusi direkrut untuk penelitian ini (disetujui oleh
komite etika Swiss setempat dengan BASEC-no. 2016-00435 , tanggal persetujuan: 09.01.2016).
Sebanyak 120 subjek (Gambar1) diminta untuk berpartisipasi dalam penelitian sebelumnya (usia
minimum 18 tahun; rata-rata, 35,8 tahun; 57 perempuan) dan menyumbangkan air liur untuk
analisis mikroba dan identifikasi penyakit dengan uji qPCR (reaksi berantai polimerase kuantitatif).
12]. Dari kelompok ini, disimpan (-80 ◦C, tidak lebih dari enam bulan) air liur digunakan dari
subyek sehat (n = 29; usia rata-rata, 31,8; 18 perempuan), pasien dengan gingivitis (n = 22; usia
rata-rata, 35,4; 13 wanita), dan pasien dengan lesi karies terbuka (n = 69; usia rata-rata, 37,6; 26
perempuan). Data lengkap untuk semua metode yang diterapkan (44 biomarker) tersedia untuk
73 dari 120 sampel yang awalnya dikumpulkan dan dimasukkan dalam analisis prediksi
komputasi: pasien sehat (n = 18), pasien dengan gingivitis (n = 17), dan lesi karies terbuka (n = 38);
lihat Bagian2.7. Subyek yang berpartisipasi mengunjungi Pusat Kedokteran Gigi sebanyak dua
kali. Penunjukan pertama (30-60 menit) termasuk pemeriksaan gigi oleh dokter gigi yang
merawat. Subyek yang memenuhi syarat yang menandatangani persetujuan tertulis mengunjungi
Pusat untuk janji kedua (dalam waktu dua minggu), di mana pengumpulan air liur berlangsung.

Status kesehatan umum dan potensi kriteria masuk dan keluar dari subjek dinilai
oleh dokter gigi selama kunjungan pertama. Subyek yang sehat secara sistemik diminta
untuk berpartisipasi dalam penelitian ini dengan status kesehatan mulut yang dipilih
(kesehatan umum ditunjukkan dengan pengecualian pasien dengan diabetes; penyakit
jantung; infeksi, seperti tuberkulosis, hepatitis, penyakit menular seksual, dan HIV/AIDS;
tumor penyakit, dan gangguan pencernaan lambung yang menyebabkan muntah).
Subyek dikeluarkan jika mereka telah berpartisipasi dalam uji klinis lain dalam tiga
bulan terakhir sebelum pengumpulan air liur, perokok berat yang mengonsumsi > 10
batang rokok per hari (penggunaan rokok elektrik tidak disurvei secara terpisah), atau
wanita hamil atau menyusui. .≥4 sekstan dan ≤2 inci ≤2 sextants), gingivitis (tidak ada
lesi karies, dan skor PSI 1 inci). ≥4 sekstan dan ≤2 inci ≤2 sextants), atau pasien karies (≥
2 lesi karies dentin terbuka dan skor PSI ≤2 inci ≥ 6 sekstan).

Pendaftaran pasien dan pengumpulan air liur berlangsung dari September 2018 hingga April
2019 dan disetujui oleh komite etika Swiss setempat (BASEC-no. 2016-00435). Setiap subjek
mendonorkan saliva sebanyak satu kali (baseline). Untuk penyelidikan lebih lanjut, 10 subjek (5
J. Pers. Med.2021, 11, 235 4 dari 18

bebas karies/gingivitis dan lima dengan karies) dari kohort diminta untuk mengulangi donasi
saliva empat, lima, dan enam bulan setelah baseline. Air liur yang disumbangkan dari setiap
subjek yang berpartisipasi dianonimkan selama pengumpulan, dan akses ke data pasien hanya
tersedia untuk personel penelitian yang berwenang. Semua sampel air liur disaring untuk 44
kandidat biomarker (sitokin, kemokin, faktor pertumbuhan, matriks metaloproteinase, inhibitor
metalopeptidase, enzim proteolitik, dan bakteri mulut terpilih). Biomarker ini dipilih sebagai
pendekatan multitarget untuk mengatasi respons imun yang berbeda, yang sebagian sudah
digambarkan berkorelasi dengan penyakit mulut.27-33].

Gambar 1. Diagram alir yang menunjukkan desain penelitian, populasi penelitian, dan analisis saliva yang diterapkan. Biomarker dari
Panel Manusia Cytokine 30-Plex diberi kode warna untuk sitokin (hijau), kemokin (kuning), dan faktor pertumbuhan (biru).
* Eotaxin/CCL11.

2.2. Pengambilan sampel air liur

2.2.1. Koleksi Dasar Air Liur

Seperti yang dijelaskan dalam penelitian sebelumnya [12], protokol donasi air liur yang ketat
diikuti. Secara singkat, para peserta diminta untuk tidak makan, minum minuman manis, atau
melakukan tindakan kebersihan mulut pada malam sebelum donor air liur. Namun, asupan air diizinkan
J. Pers. Med.2021, 11, 235 5 dari 18

selalu. Donasi saliva standar dilakukan antara pukul 8.00 dan 10.00.44,45] dan dilakukan untuk
mendapatkan saliva utuh yang tidak distimulasi [46]. Sebuah video disediakan untuk
menginstruksikan subjek tentang metodologi untuk donasi air liur standar. Waktu pengumpulan
15 menit dijadwalkan, dan air liur dikumpulkan dalam tabung reaksi. Tabung yang berisi kurang
dari 1,8 mL air liur dibuang. Tabung dengan volume yang cukup kemudian divortex, diakuot
dalam tabung DNA ikatan rendah atau tabung ikatan rendah protein (Eppendorf, Wesseling-
Berzdorf, Jerman) tergantung pada pengujian berikut, dan disimpan di-80 ◦C.

2.2.2. Pengukuran Saliva Berulang pada Subyek Terpilih

Sepuluh subjek perwakilan dari kohort (lima bebas karies/gingivitis dan lima dengan
karies) diikuti selama enam bulan (Gambar 1). Analog dengan titik waktu 0 (dasar), pasien
menerima tiga pemeriksaan mulut lebih lanjut dan dikelompokkan ke dalam kelompok klinis
masing-masing, yaitu, "sehat", "gingivitis", atau "karies". Selama waktu pengamatan
berikutnya, tiga pengumpulan air liur berturut-turut terjadi, pada empat, lima, dan enam
bulan setelah pengumpulan awal. Pasien diminta pada setiap pertemuan pengambilan saliva
untuk menjawab pertanyaan mengenai perawatan gigi yang dilakukan, seperti perawatan
lesi karies, pencabutan gigi, dan apakah telah dilakukan pembersihan gigi secara
profesional. Selain itu, pasien ditanya tentang asupan antibiotik, perubahan pola nutrisi, dan
kontrol plak perawatan diri mereka. Status kesehatan mulut pasien dinilai selama setiap janji
pengumpulan air liur oleh spesialis gigi. Sampel air liur dikumpulkan mengikuti protokol
yang sama seperti yang digunakan untuk pengumpulan air liur awal, diberi kode, dan
disimpan untuk analisis lebih lanjut dari 44 penanda seperti yang dijelaskan sebelumnya.
Dataset yang dihasilkan terdiri dari pengukuran berulang dari 10 individu tambahan
kemudian digunakan sebagai dataset independen untuk memeriksa model statistik dan oleh
karena itu juga disebut sebagai "set data uji".

2.3. Analisis 30-Plex Biomarker dalam Air Liur

Untuk setiap sampel, alikuot dengan volume tertinggi dicairkan dari -80 ◦C
semalam pada 6 ◦C pada pengocok orbital pada 180 rpm untuk memastikan
homogenitas. Kemudian disentrifugasi pada 21.000 rcf selama 3 menit pada 4◦C. Total
25 μL supernatan digunakan untuk analisis dengan Cytokine 30-Plex Human Panel (Cat.
# LHC6003M, oleh Thermo Fisher Scientific, Tabel Tambahan S1). Rekomendasi
pabrikan diikuti selama analisis. Penangkapan sitokin dilakukan dengan inkubasi
semalaman. Langkah antibodi terbiotinilasi diperpanjang hingga 1 jam, dan kopling R-
phycoerythrin (R-PE), hingga 2 jam. Pengaturan instrumental dibuat sesuai dengan
protokol Panel Manusia 30-Plex dengan target jumlah manik 50. Akuisisi data dilakukan
pada sistem Luminex 200 (Invitrogen, 4088 Commercial Ave, Northbrook, IL, USA) dan
perangkat lunak xPONENT-nya ( Paket versi 3.1, Invitrogen, Waltham, MA, USA). Pelat
diukur dua kali, pada pengaturan Photomultiplier Tube (PMT) rendah dan tinggi.

2.4. Pengukuran MMP-8, MMP-9, dan TIMP-1

Konsentrasi MMP-8, MMP-9, dan TIMP-1 ditentukan dengan menggunakan kit ELISA
komersial (BioVendor-LaboratornSaya medisSayana as, Brno, Republik Ceko), sesuai dengan
instruksi pabrik [47,48]. Rentang kalibrasi disesuaikan untuk penentuan MMP-8 dalam
sampel air liur. Supernatan saliva dari setiap sampel pasien disentrifugasi pada suhu 4◦C
selama 10 menit pada 10.000× G dan kemudian diencerkan masing-masing 20, 40, atau 250
kali, dengan buffer pengenceran yang sesuai, dan digunakan untuk analisis.

2.5. Analisis Protease

Total aktivitas proteolitik saliva diukur seperti yang dijelaskan sebelumnya [49]. Singkatnya,
49μL saliva diinkubasi dengan 1 μL dari 800 μM PEK-054 ([FITC]-NleKKKKVLPIQLNAATDK-[KDbc]),
substrat yang digunakan untuk menilai aktivitas protease total. Larutan tripsin dari pankreas sapi
(500 U, Sigma-Aldrich Chemie BV, Zwijndrecht, Belanda) digunakan sebagai standar. Reaksi
diinkubasi pada suhu 37◦C selama 60 menit, dan peningkatan fluoresensi
J. Pers. Med.2021, 11, 235 6 dari 18

ditentukan dengan menggunakan pembaca pelat mikro fluoresensi (FLUOstar Galaxy, BMG
Laboratories) pada panjang gelombang eksitasi 485 nm dan panjang gelombang emisi 530 nm. Semua
sampel air liur dianalisis dalam rangkap dua.

2.6. qPCR
2.6.1. Ekstraksi DNA untuk qPCR
DNA diekstraksi menggunakan GenEluteTM DNAKit Genomik Bakteri (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, USA) dan protokol untuk preparasi bakteri Gram-positif dan spesies Streptococcus (dengan
penambahan 250 unit/mL mutanolysin) dengan langkah lisis yang berkepanjangan. Untuk setiap
pasien, 920μL air liur diputar pada 18.000 rcf selama 3 menit. Pelet yang tersisa disuspensikan
kembali dalam larutan enzim yang terdiri dari lisozim dan mutanolisin dan diinkubasi selama 1
jam pada suhu 37◦C pada Thermomixer (1400 rpm, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Jerman).
Perawatan RNase dilakukan sesuai dengan rekomendasi pabrikan. Waktu inkubasi selama
pengobatan proteinase K diperpanjang hingga 30 menit pada 55◦C pada 1400rpm. DNA dielusi
dalam 135μL dari 10 mM TrisHCl (pH 8,8) dan disimpan di
-25 ◦C.

2.6.2. Desain Oligonukleotida dan Spesifisitas Primer dan Probe

Set primer dan probe baru dirancang untuk bakteri strain P. gingivalis,
T. forsythia, T. denticola, F. nucleatum, C. rectus, P. intermedia, A. actinomycetemcomitans,
S. mutans, S. sobrinus dan Lactobacilli yang terkait secara oral [12]. Urutan target diekstraksi
dari database "Nukleotida" [50] disediakan oleh National Center for Biotechnology
Information (NCBI) dan “Human Oral Microbiome Database” (HOMD), milik Forsyth Institute
di Cambridge, MA, USA [5]. Set primer dan probe menargetkan gen RNA ribosom 16S kecuali
untuk A. actinomycetemcomitans dan S. sobrinus. Ketersediaan dan heterogenitas yang
terbatas dari sekuens 16S rRNA A. actinomycetemcomitans dalam database NCBI Nucleotide
berarti bahwa faktor virulensi dan gen toksin LtxA menjadi sasaran sebagai gantinya.
Streptokokus menampilkan kesamaan urutan tinggi dalam genera mereka; karenanya, gen
23S rRNA (uracil-5-)-methyltransferase RumA dipilih untuk meningkatkan spesifisitas deteksi.
Desain oligonukleotida secara eksklusif dilakukan menggunakan Primer3 [51]. Cakupan
oligonukleotida, serta spesifisitas, pertama kali dikonfirmasi secara in silico menggunakan
Primer Blast dalam kombinasi dengan database “tidak berlebihan/nukleotida (nr/nt)”,
“kromosom semua organisme”, dan “HOMD 16S rRNA RefSeq”. Hasilnya divalidasi di
laboratorium menggunakan DNA referensi genom bakteri yang disediakan oleh Leibniz
Institute DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (https://
www.dsmz.de/), dan ATCC, Koleksi Budaya Tipe Amerika (www.lgcstandards-atcc.org) [12].

2.6.3. qPCR dupleks

qPCR dilakukan menggunakan format dua warna menggunakan "TaqMan Lyophilized 1-Step
qPCR MasterMix" khusus pada Roche Light Cycler 480II. Setiap reaksi mengandung bahan pasien
yang diekstraksi atau DNA genom referensi dan kontrol amplifikasi internal, yang terdiri dari 0,01
ng DNA genom Serinicoccus marinus. Probe yang menargetkan bakteri yang terkait secara oral
diberi label dengan 6-carboxyfluorescein (6-FAM), sedangkan probe kontrol internal menggunakan
LightCycler Red 610 milik Roche. Protokol bersepeda dua langkah diterapkan, dimulai dengan
aktivasi awal selama 2 menit pada 95◦C diikuti oleh 40 siklus bergantian antara 95 ◦C selama 3 detik
dan 60 ◦C selama 30 detik. Pertama, kurva standar eksternal dihasilkan dalam tiga qPCR berturut-
turut untuk setiap takson oral menggunakan DNA referensi genom bakteri yang disorot di Bagian
2.6.2. Standar termasuk enam konsentrasi dalam peningkatan 10 kali lipat dari 10 ng menjadi 0,1
pg [12]. Nilai untuk setiap standar kemudian diubah menjadi setara genom dengan mengekstraksi
ukuran genom setiap strain dari Majelis NCBI [52], mengalikannya dengan berat molekul rata-rata
pasangan basa, dan mengkorelasikannya dengan enam konsentrasi standar. Selanjutnya, DNA
pasien yang diekstraksi menjadi sasaran qPCR, dan nilai Cq yang sesuai secara langsung
dikuantifikasi dan diubah menjadi setara genom berdasarkan kurva standar yang ditetapkan
sebelumnya.
J. Pers. Med.2021, 11, 235 7 dari 18

2.7. Statistik dan Analisis Komputasi

Data sampel air liur hanya digunakan jika semua metode molekuler diterapkan pada sampel
tersebut, sehingga menghasilkan pengukuran 44 penanda dalam 73 sampel. Semua pengukuran
dinyatakan sebagai ekuivalen genom, unit absorbansi (AU), pg/mL, atau ng/mL (tergantung pada
biomarker) dan dikompilasi dalam spreadsheet. Hanya data di atas batas deteksi (tergantung
pada masing-masing biomarker) yang digunakan secara langsung (Tabel Tambahan S2).
Pengukuran di bawah batas deteksi diperhitungkan menggunakan metode setengah minimum [53
].
Data dasar (“set data pelatihan”) digunakan untuk analisis komponen utama (PCA) pada
matriks korelasi dan untuk melatih hutan acak (RF). Selain itu, dataset ini juga menjadi dasar
untuk membandingkan tingkat penanda IL-4, IL-13, IL-2-RA, dan eotaxin/CCL11 antara
individu sehat, pasien dengan gingivitis, dan pasien dengan lesi karies dalam yang tidak
diobati menggunakan metode nonparametrik. -way ANOVA (tes jumlah peringkat Kruskal-
Wallis) diikuti oleh perbandingan berpasangan menurut Conover. Data tambahan dari
mengingat 10 subjek (“set data uji”) disiapkan dengan cara yang sama, tetapi hanya
digunakan untuk memeriksa prediksi RF. RF dipilih daripada algoritma lain karena
menawarkan sifat prediksi yang kuat dalam kombinasi dengan karakteristik model yang
cukup dapat diinterpretasikan dan cocok [54,55]. Semua analisis komputasi dilakukan
dengan perangkat lunak statistik R [56], termasuk paket ggplot2 [57], PMCMRplus [58],
hutan acak [59], dan FactoMineR [60].

3. Hasil
Sampel air liur dari 120 subjek dikumpulkan dan dianalisis dengan metode molekuler yang
berbeda, skrining untuk 19 sitokin, 7 kemokin, 4 faktor pertumbuhan, 2 metalloproteinase, 1
inhibitor metalopeptidase, 1 protease, dan 10 bakteri yang terkait secara oral (Gambar 1). 1). Data
hanya dikenakan pemodelan statistik lebih lanjut jika hasil untuk semua pengujian (44 protein dan
penanda DNA yang menonjol) tersedia. Secara keseluruhan, ini menyumbang 73 sampel air liur,
18 di antaranya dikelompokkan sebagai sehat, 17 sebagai gingivitis, dan 38 sebagai pasien karies.

3.1. Frekuensi Biomarker yang Terdeteksi

Data dikumpulkan pada berbagai titik waktu oleh mitra proyek selama studi ini.
Visualisasi awal memungkinkan penilaian kualitas data seperti yang ditunjukkan dalam
matriks batas deteksi (Gambar2). Dapat dilihat bahwa data untuk A.
actinomycetemcomitans, S. sobrinus, dan Lactobacilli oral berada di bawah batas deteksi
pada sebagian besar subjek. Selain itu, tidak ada data untuk semua pengukuran IL-1-RA dan
IL-5. Tes yang tersisa, bagaimanapun, menunjukkan kinerja yang sangat kuat (data di atas
batas deteksi; lihat Tabel Tambahan S2).

3.2. Analisis Komponen Utama (PCA)

Komponen utama pertama mencakup 36% dari total varians dalam data, sedangkan
komponen utama kedua menyerap 8,4% dari total varians (Gambar 3). Ada tumpang tindih yang
mendalam antara kelompok sehat dan gingivitis, sedangkan kelompok karies umumnya dapat
dibedakan dengan lebih baik. Ini menunjukkan bahwa kelompok tersebut menunjukkan profil
penanda yang berbeda.
J. Pers. Med.2021, 11, 235 8 dari 18

Gambar 2. Matriks deteksi semua biomarker (sumbu x) pada 73 subjek yang dianalisis (sumbu y). Kode
warna menunjukkan data yang diukur di atas (biru) atau di bawah (merah) batas deteksi. Angka di
sebelah kiri sesuai dengan jumlah pasien dengan pola biomarker yang sama di atas/di bawah batas
deteksi. Angka di sebelah kanan mewakili jumlah biomarker di bawah batas deteksi per baris.

Gambar 3. Hasil yang diperoleh dari principal component analysis (PCA) dengan dimensi pertama pada sumbu x (36%) dan dimensi kedua pada
sumbu y (8,4%). Kelompok-kelompok tersebut dipisahkan berdasarkan warna dan bentuk (karies = kotak merah; gingivitis = segitiga hijau; karies
= lingkaran merah). Tiga bentuk yang lebih besar terletak di pusat gravitasi untuk setiap kelompok.
J. Pers. Med.2021, 11, 235 9 dari 18

3.3. Biomarker untuk Membedakan Status Kesehatan Mulut

Mengikuti PCA, pendekatan multidimensi lainnya (model pembelajaran yang diawasi hutan
acak) diterapkan pada dataset pelatihan untuk mengekstraksi diskriminator terkuat yang
berpotensi mampu menetapkan pasien dengan benar ke dalam tiga kelompok studi klinis. Angka4
menggambarkan diskriminator terkuat yang diplot menurut rata-rata penurunan akurasi: IL-4,
IL-13, dan IL-2-RA, diikuti oleh eotaxin/CCL11. Ini adalah empat pengklasifikasi yang
memungkinkan perbedaan terbaik pasien karies, sehat, dan gingivitis dengan
mempertimbangkan semua penanda yang diukur.

Gambar 4. Hasil hutan acak yang diplot menurut rata-rata penurunan akurasi, menunjukkan
diskriminator terkuat, yaitu, IL-4, IL-13, IL-2-RA, dan eotaxin/CCL11.

Menariknya, hanya empat penanda yang diperlukan untuk menghasilkan diskriminasi

terbaik antara kelompok kesehatan mulut yang berbeda, yaitu, IL-4, IL-13, dan IL-2-RA serta
kemokin eotaxin/CCL11 (Gambar 4). Bakteri mulut tidak memainkan peran penting. Tidak
ada perbedaan yang signifikan secara statistik yang ditemukan antara pasien sehat dan
gingivitis mengenai biomarker yang diuji (Tabel1). Namun demikian, ada perbedaan yang
signifikan secara statistik antara karies dan dua kelompok klinis lainnya (Gambar ).5, Meja 1).
Peningkatan kadar biomarker dapat diamati untuk keempat biomarker pada karies, jika
dibandingkan dengan kelompok sehat dan gingivitis. Data rata-rata± standar deviasi
dihitung untuk semua biomarker. Level biomarker pasien dengan lesi karies dalam adalah
44,9 pg/mL± 6,8 pg/mL untuk IL-4, 4,6 pg/mL ± 2,6 pg/mL untuk IL-13,
J. Pers. Med.2021, 11, 235 10 dari 18

158,9 pg/mL ± 44,4 pg/mL untuk IL-2-RA, dan 1,7 pg/mL ± 0,9 pg/mL untuk eotaxin/CCL11.
Biomarker IL-13 berada di bawah batas deteksi pada kelompok sehat dan gingivitis.

Tabel 1. P-nilai dari empat biomarker IL-4, IL-13, IL-2-RA, dan eotaxin/CCL11 saat membandingkan
pasien dengan karies, pasien dengan gingivitis, dan individu yang sehat.

Biomarker Karies/Gingivitis Karies/Sehat Gingivitis/Sehat

IL-4 1.5 × 10-15 4.1 × 10-13 0.17
IL-13 4.0 × 10-13 3.1 × 10-12 0,52
IL-2-RA 3.3 × 10-6 1.0 × 10-4 0.35
Eotaxin/CCL11 8.1 × 10-5 4.4 × 10-4 0,56

Gambar 5. Plot kotak dari empat pengklasifikasi kelompok terkuat (IL-4, IL-13, IL-2-RA, dan eotaxin/CCL11) berdasarkan klasifikasi hutan
acak, dengan nilai median dan rentang interkuartil untuk setiap kelompok ditampilkan (individu sehat, pasien dengan gingivitis , dan
mereka yang mengalami karies). P-nilai diturunkan dari uji Kruskal-Wallis diikuti dengan perbandingan berpasangan post hoc menurut
Conover. n =P > 0,05; ***P ≤ 0,001 (lihat Tabel 1 untuk spesifik P-nilai).

3.4. Plot Pemuatan PCA

Plot pemuatan PCA dihasilkan untuk memvisualisasikan korelasi potensial antara
biomarker yang diuji dan kelompok sampel. Arah dan sudut plot menunjukkan korelasi
positif antara IL-2-RA dan IL-13, diikuti oleh IL-4 (Gambar6). Pengamatan menarik lainnya
adalah bahwa periodontitis dan bakteri terkait karies tidak mungkin berkorelasi, meskipun,
seperti yang diharapkan, aktivitas protease bakteri tampaknya berkorelasi lebih baik dengan
strain terkait periodontitis. Satu-satunya strain terkait karies yang menunjukkan korelasi
positif dengan IL-4, IL-13, dan IL-2-RA adalahStreptococcus mutans (hijau).
J. Pers. Med.2021, 11, 235 11 dari 18

Gambar 6. Plot pemuatan PCA memvisualisasikan korelasi antara biomarker yang diuji dan kelompok sampel, dikelompokkan
berdasarkan kesamaannya. Panah berwarna merah menunjukkan empat biomarker (diurutkan dari atas ke bawah): IL-4, IL-13,
IL-2-RA, dan eotaxin/CCL11. NSS. mutans panah berwarna hijau, di dekat IL-4.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memanfaatkan biomarker yang diukur untuk
memprediksi status kesehatan klinis pasien (Tabel 1). Menggunakan algoritma RF, hasilnya
kemudian dibandingkan dengan penilaian klinis awal dari spesialis gigi. Keseluruhan
kesalahan out-of-bag sebesar 30%. Namun, ada perbedaan yang mencolok dalam kesalahan
klasifikasi antara masing-masing kelompok, seperti yang dapat dilihat pada Tabel2.
Kelompok karies dapat dibedakan dengan jelas dari gingivitis dan kelompok sehat
(kesalahan klasifikasi 2,6%), sedangkan gingivitis dan kelompok sehat tidak dapat dibedakan
secara memuaskan berdasarkan biomarker yang diselidiki (kesalahan klasifikasi 58,8 % dan
61,1%, masing-masing).

Meja 2. Matriks kebingungan membandingkan prediksi model hutan acak (RF) menggunakan biomarker (atas)
dengan penilaian oleh spesialis gigi (kiri).

Status Sehat Radang gusi Karies Kesalahan Klasifikasi (%)

Sehat 7 10 1 58.8
Radang gusi 8 7 2 61.1
Karies 1 0 37 2.6
J. Pers. Med.2021, 11, 235 12 dari 18

3.5. Perbandingan Prediksi Model RF dan Penilaian Klinis

Prediksi model RF diterapkan pada kohort 10 subjek (lima bebas karies/gingivitis
dan lima dengan karies) yang merupakan bagian dari kelompok pengukuran berulang
(set data uji). Prediksi komputasi kemudian dibandingkan dengan klasifikasi klinis yang
dilakukan selama janji pengumpulan air liur oleh praktisi gigi. Selain pengukuran air liur
titik waktu 0 (T0, baseline), tiga pengukuran berturut-turut dilakukan empat bulan (T1),
lima bulan (T2), dan enam bulan (T3) setelah T0. Perbandingan klasifikasi oleh model RF
dan klasifikasi klinis divisualisasikan pada Gambar7. Klasifikasi RF subjek sehat identik
dengan klasifikasi klinis untuk 13 dari 20 titik pemeriksaan (Gambar7, Pasien Sehat).
Perbedaan kecil dalam kelompok yang sehat dapat diamati dalam tujuh contoh. Model
memprediksi kondisi gingivitis bertentangan dengan spesialis klinis.

Gambar 7. Status klinis dari lima pasien sehat dan lima pasien karies dinilai dan diklasifikasikan oleh
spesialis gigi serta oleh prediksi RF berbasis biomarker (Pasien Sehat_1 hingga _5, dan Pasien
Kariogenik_1 hingga _5). Grafik memvisualisasikan dan membandingkan hasil klasifikasi berdasarkan
pemodelan RF (putih) dan penilaian klinis oleh spesialis gigi (hitam) untuk setiap titik waktu (T0 =
baseline, T1 = setelah 4 bulan, T2 = setelah 5 bulan, dan T3 = setelah 6 bulan). Tabel di bawah grafik
menunjukkan konsentrasi biomarker masing-masing dalam pg/mL, dengan N/D = nilai di bawah batas
deteksi.
J. Pers. Med.2021, 11, 235 13 dari 18

Semua pasien karies yang ditindaklanjuti selama penelitian mengubah kelompok selama
pengukuran saliva berulang—dari karies menjadi sehat—seperti yang ditunjukkan oleh praktisi
gigi mereka. Pemeriksaan klinis pasien ini akhirnya menunjukkan gigi yang bebas karies.
Perubahan dalam diet atau kontrol plak perawatan diri, asupan antibiotik, pencabutan gigi, atau
pembersihan gigi profesional didokumentasikan dan tersedia di Tabel Tambahan S3. Prediksi RF
berbasis biomarker untuk pasien sehat mulut yang dinilai secara klinis ini menghasilkan
kesimpulan yang berbeda untuk empat pasien (Pasien Kariogenik_1 dengan Karies T2 dan T3, dan
Pasien Kariogenik_4 dengan Karies T2 dan T3). Berdasarkan model RF dan tingkat biomarker
saliva, pasien ini tetap diklasifikasikan sebagai pasien karies (Gambar ).7). Namun, secara
keseluruhan, ada kesepakatan yang baik, dengan 16 dari 20 klasifikasi yang cocok antara ahli gigi
dan model RF.

4. Diskusi
Dari 44 biomarker potensial, total empat biomarker saliva ditemukan menunjukkan potensi
kuat sebagai pengklasifikasi untuk membedakan antara individu yang sehat dan pasien karies. Ini
adalah interleukin IL-4 dan IL-13, reseptor interleukin IL-2-RA, dan kemokin eotaxin/CCL11.
Dengan menggunakan, terutama, keempat biomarker ini, pasien karies dapat diklasifikasikan ke
dalam kelompok yang benar dengan tingkat kepastian yang sangat tinggi (kesalahan klasifikasi
2,6%). Prediksi RF didasarkan pada set pelatihan dari 73 subjek dan digunakan untuk penilaian
kesehatan dan prediksi 10 individu (lima bebas karies/gingivitis dan lima dengan karies), yang
diikuti selama periode enam bulan (set data uji) . Hasilnya menunjukkan bahwa prediksi RF
berbasis biomarker pada pasien karies lebih sensitif daripada penilaian klinis oleh spesialis gigi.
Sebuah diskriminasi yang berbeda antara kelompok yang sehat dan gingivitis tidak mungkin
dalam penelitian ini. Oleh karena itu, hipotesis awal ditolak sebagian. Diferensiasi yang jelas dari
kelompok karies berdasarkan protein tetapi bukan biomarker bakteri diaktifkan dan divalidasi
dengan 10 subjek tindak lanjut.
Sehubungan dengan IL-4 dan IL-13, sejak 1993, telah ditetapkan bahwa gen IL-13
terkait erat dengan gen IL-4 pada kromosom 5q 23-31 [61,62], dan bahwa ada homologi
urutan dan subunit bersama yang bertanggung jawab untuk transduksi sinyal antara kedua
gen ini. Telah disarankan bahwa baik IL-4 dan IL-13 adalah modulator in vitro yang poten,
penting dalam regulasi respon imun Th2.63]. Ditunjukkan bahwa sitokin Th2, seperti IL-4,
IL-5, dan IL-13, bersama-sama dengan eotaxin/CCL11, mengatur aspek penting rekrutmen
eosinofil, inflamasi alergi, dan hiperresponsif saluran napas pada asma.62]. Sebuah studi
baru-baru ini tentang monosit dan makrofag manusia mengkonfirmasi bahwa IL-13
menggunakan kaskade pensinyalan IL-4-RA-JAK2-STAT3 dan IL-13-RA-Tyk2-STAT1/STAT6 (JAK
= Janus kinase; STAT = transduser sinyal dan aktivator protein transkripsi), sedangkan IL-4
hanya dapat menggunakan sumbu IL-4-RA-JAK1-STAT3/STAT6 [64]. Kelompok yang berbeda
menyelidiki potensi IL-13 sebagai aktivator pensinyalan JAK3-STAT6 dalam sel yang
mengekspresikan IL-2-RG dan IL-4-RA [65]. Meskipun awalnya tidak disebutkan, Thermo
Fisher Scientific mengkonfirmasi bahwa uji “Cytokine 30-PlexHuman Panel” yang digunakan
dikembangkan menggunakan protein IL-2-RA (Nomor Aksesi: P01589). Potensi reaktivitas
silang dan pengukuran IL-2-RG yang tidak disengaja selain IL-2-RA harus dinilai lebih lanjut.
Asumsi bahwa pensinyalan JAK-STAT berpotensi berperan dalam karies gigi didukung oleh
penelitian pada sel ligamen periodontal manusia (HPDLC). Studi tersebut mengungkapkan
bahwa IL-4 sangat penting dalam aktivasi STAT6 dan pelepasan eotaxin/CCL11 kemoatraktan
spesifik eosinofil.66].
Khususnya, dari hasil kami, empat dari 20 pengukuran tindak lanjut pada kelompok karies
berbeda antara penilaian klinis oleh dokter gigi dan prediksi komputasi berdasarkan biomarker.
Pemeriksaan klinis menunjukkan gigi bebas karies setelah menempatkan tambalan pada lesi
karies terbuka dari dua pasien (Pasien Kariogenik_1 dan Pasien Kariogenik_4 setelah lima dan
enam bulan). Menariknya, kedua pasien awalnya menunjukkan lesi karies yang beragam pada
banyak gigi secara bersamaan, artinya perawatan karies dilakukan pada semua lesi karies
terbuka. Setelah mereka dirawat, dokter gigi mengklasifikasikan pasien ini sebagai sehat, menurut
kriteria klasifikasi penelitian. Namun, molekul
J. Pers. Med.2021, 11, 235 14 dari 18

analisis menunjukkan adanya respon imun terkait karies yang sedang berlangsung.
Biomarker yang menetap, yang terdeteksi dalam air liur dari dua pasien yang dirawat
dengan banyak karies ini, mungkin dipicu karena lesi karies awal yang multipel dan
berasal dari tubulus dentin terbuka atau GCF. Selanjutnya, perbedaan dalam klasifikasi
pasien sehat mungkin terkait dengan protokol klasifikasi klinis yang digunakan selama
janji awal dan pendaftaran subjek penelitian, karena pemeriksaan gigi termasuk
skrining untuk lesi karies dan validasinya dengan radiografi, yang memungkinkan
gambaran yang jelas. klasifikasi. Namun, kelompok sehat dan gingivitis hanya ditandai
dengan tidak adanya lesi karies dan poket gigi dengan kedalaman lebih dari 3 mm.
Perdarahan saat probing,

≥4 sekstan dan ≤2 inci ≤2 sekstan). Diferensiasi klinis ini mungkin telah ditingkatkan jika
skor perdarahan lain telah digunakan [67].
Dampak rendah dari tingkat populasi bakteri pada kekuatan klasifikasi keseluruhan model
RF berpotensi dapat dijelaskan oleh beberapa aspek yang berbeda. Sampai batas tertentu,
periopatogen tidak diharapkan berperan dalam diferensiasi dan klasifikasi karies. Mereka
dimasukkan dalam penelitian ini karena potensi keterlibatan mereka dalam gingivitis. Meskipun
tidak ada satu-satunya spesies bakteri yang dapat diidentifikasi sebagai faktor penyebab gingivitis.
68], spesies bakteri yang dipilih untuk pengujian ini telah lama diketahui terkait dengan penyakit
periodontal [69]. Selain itu, bakteri terkait karies tidak berkontribusi kuat pada klasifikasi
keseluruhan dalam penelitian ini, seperti yang ditunjukkan oleh pemodelan RF. Untuk deteksi
qPCR, ada dua penyebab potensial untuk nilai yang hilang, tidak adanya atau sedikitnya jumlah
analit dalam air liur pasien atau kinerja pengujian yang tidak memadai. Seperti yang dijelaskan
sebelumnya, semua set primer dan probe divalidasi menggunakan DNA referensi genom
menggunakan standar mulai dari 0,1 pg hingga 10 ngDNA. qPCR diulang pada tiga hari berturut-
turut, mempersiapkan semua reagen dari awal setiap kali, dengan pedoman MIQE yang diikuti
selama penelitian [70]. Kelimpahan yang rendah dariAggregatibacter actinomycetemcomitans
pada populasi umum telah dilaporkan [71]. Namun, tampaknya kinerja pengujian untuk
Streptokokus sobrinus dan Lactobacillus mungkin telah terganggu oleh adanya inhibitor saliva.
Oleh karena itu, tidak dapat sepenuhnya dikecualikan bahwa bakteri tersebut merupakan
pendorong penting dalam pengembangan atau identifikasi karies gigi. Total protease manusia,
matriks metalloproteinase, dan tingkat inhibitor metalopeptidase tidak meningkatkan
prediktabilitas (karies, gingivitis, atau sehat) dalam penelitian ini. Namun, kontribusi besar mereka
terhadap prediksi karies tidak diharapkan, karena protease MMP-8 dan MMP-9 adalah bagian dari
"jaringan protease" yang sangat kompleks, yang terutama terkait dengan penyakit periodontal
destruktif.72].
Kurangnya penelitian di bidang tanda-tanda karies saliva sampai saat ini mungkin
didasarkan pada sifat diagnostik karies saat ini, yang terutama diterapkan dengan
pemeriksaan visual termasuk perangkat deteksi karies optik, penilaian taktil, dan radiografi.
73,74]. Analisis molekuler yang disajikan dalam publikasi ini menyelidiki beragam biomarker
protein saliva dan tingkat populasi bakteri, dan hasilnya berpotensi digunakan untuk
meningkatkan sensitivitas deteksi karies, serta untuk meningkatkan strategi pencegahan
karies. Penjelasan lengkap tentang jalur yang mendasari dan mekanisme yang terlibat tidak
mungkin karena penelitian ini pertama kali berkaitan dengan skrining biomarker potensial
yang mampu memprediksi karies gigi. Data menunjukkan hubungan potensial antara
pensinyalan JAK/STAT dan respons imun Th1/Th2 terkait; Namun, penelitian lebih lanjut
harus dilakukan ke arah ini.
Percobaan di masa depan juga harus menguji penerapan universal dari empat
biomarker untuk kelompok pasien lain, misalnya pasien dengan periodontitis, perokok
berat, atau wanita hamil dan menyusui. Selanjutnya, efek potensial pada respon imun oral
dan mikrobioma setelah konsumsi alat penguap dan rokok elektrik harus ditangani.
J. Pers. Med.2021, 11, 235 15 dari 18

5. Kesimpulan
Penelitian saat ini mengidentifikasi empat biomarker (IL-4, IL-13, IL-2-RA, dan eotaxin/CCL11)
yang memungkinkan diagnosis karies gigi yang benar pada 37 dari 38 pasien menggunakan
analisis RF. Sepuluh subjek diikuti selama periode enam bulan, dengan status kesehatan mulut
mereka dinilai secara klinis dan dibandingkan dengan prediksi RF berbasis biomarker. Kami
menyarankan validasi lebih lanjut dari empat biomarker (IL-4, IL-13, IL-2-RA, dan eotaxin/CCL11)
dalam konteks pensinyalan JAK/STAT dan karies gigi. Hasil kami menyoroti pentingnya uji
molekuler sensitif tambahan, bertindak dengan cara melengkapi metodologi penilaian klinis yang
ada dan memungkinkan pendekatan holistik dan personal untuk deteksi dan terapi karies. Tes
biomarker dapat memfasilitasi pendekatan ini dan memungkinkan dokter gigi untuk secara
akurat melacak pemulihan pasien menuju lingkungan mikro mulut yang sehat. Penelitian ini telah
meletakkan dasar untuk pengembangan tes diagnostik berbasis air liur yang sederhana dan layak
secara ekonomi yang bertujuan untuk menilai ada/tidaknya karies gigi secara personal.

Bahan Tambahan: Berikut ini tersedia secara online di https://www.mdpi.com/2075-442 6/11/3/235/s1.

Tabel S1: Gambaran Umum Panel Manusia Sitokin 30-Plex, Tabel S2: Batas deteksi atas dan bawah
kuantifikasi dengan pengujian, Tabel S3: Kumpulan data yang dikompilasi termasuk data penilaian klinis
semua subjek.

Kontribusi Penulis: Konseptualisasi, PNP, CH, DBW, KM, JRP dan NB; kurasi data,
PNP, CH, DBW dan JSJ; Analisis formal, PNP, CH, DBW dan JSJ; akuisisi pendanaan,
KM, TA, GNB, JRP dan NB; Investigasi, PNP dan CH; Metodologi, PNP, CH, DBW dan NB;
Administrasi proyek, PNP, CH, KM, TA, GNB, JRP, FJW dan NB; Sumber daya,
KM, TA, KB, JSJ, WEK, MK, JRP, PRS, TT dan NB; Perangkat Lunak, DBW; Pengawasan,
KM, TA dan JRP; Validasi, PNP, CH dan DBW; Visualisasi, PNP, CH dan DBW; Tulisan—draf asli, PNP
dan CH; Penulisan—review & editing, PNP, CH, DBW, KM, TA,
GNB, JPH, JSJ, WEK, MK, PK, JRP, PRS, TT, FJW dan NB Semua penulis telah membaca dan
menyetujui versi naskah yang diterbitkan.

Pendanaan: Penelitian ini didanai oleh program penelitian dan inovasi Horizon 2020 Uni Eropa,
dengan nomor hibah 633780 (proyek “DIAGORAS”).

Pernyataan Dewan Peninjau Kelembagaan: Penelitian dilakukan sesuai dengan pedoman

Deklarasi Helsinki, dan disetujui oleh komite etika Swiss setempat (BASEC-no. 2016-00435, tanggal
persetujuan: 09.01.2016).

Pernyataan Persetujuan yang Diinformasikan: Informed consent diperoleh dari semua subjek yang terlibat dalam
penelitian.

Pernyataan Ketersediaan Data: Data tersebut terkandung dalam artikel atau Materi Tambahan. Data
yang disajikan dalam penelitian ini tersedia di Data Tambahan S3.

Ucapan terima kasih: Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada Helga Lüthi-Schaller atas laboratorium dan
dukungan teknisnya yang luar biasa selama proyek dan eksperimen dan berterima kasih atas ide-ide konstruktifnya.

Konflik kepentingan: Para penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan.

Referensi
1. Chapple, ILC; Van Der Weijden, F.; Doerfer, C.; Herrera, D.; Shapira, L.; Polak, D.; Madianos, P.; Louropoulou, A.; Machtei, E.; Dono, N.;
dkk. Pencegahan primer periodontitis: Mengelola gingivitis.J.klin. Periodontol.2015, 42, S71–S76. [CrossRef] Sanz, M.; Beighton,
2. Amerika Serikat; Curtis, M.; Curi, JA; Dige, saya.; Domisch, H.; Ellwood, R.; Giacaman, RA; Herrera, D.; Herzberg,
MC; dkk. Peran biofilm mikroba dalam pemeliharaan kesehatan mulut dan dalam perkembangan karies gigi dan penyakit
periodontal. Laporan konsensus kelompok 1 dari lokakarya EFP/ORCA Bersama tentang batas antara karies dan penyakit
periodontal.J.klin. Periodontol2017, 44, S5–S11. [CrossRef] Socransky, SS; Haffajee, AD Ekologi mikroba periodontal.
3. Periodontol. 20002005, 38, 135–187. [CrossRef] [PubMed] Marsh, PD Pentingnya menjaga stabilitas mikroflora alami mulut.
4. sdr. Lekuk. J.1991,
171, 174–177. [CrossRef]
5. Dewhirst, FE; Chen, T.; Izard, J.; Pendeta, BJ; penyamak kulit, ACR; Yu, W.-H.; Laksmanan, A.; Wade, WG Mikrobioma Oral
Manusia.J. Bakteri. 2010, 192, 5002–5017. [CrossRef]
J. Pers. Med.2021, 11, 235 16 dari 18

6. Marsh, P. Ekologi Mikroba Plak Gigi dan Signifikansinya dalam Kesehatan dan Penyakit. Adv. Lekuk. Res.1994, 8, 263–271. [
CrossRef] [PubMed]
7. Shungin, D.; Haworth, S.; Divaris, K.; Agler, CS; Kamatani, Y.; Lee, MK; Giling, K.; Hindi, G.; Alaraudanjoki, V.; Pesonen, P.; dkk.
Analisis genom karies gigi dan periodontitis yang menggabungkan data klinis dan yang dilaporkan sendiri.Nat. komuni.2019,
10, 1–13. [CrossRef]
8. Zaura, E.; Cate, JT Plak Gigi sebagai Biofilm: Studi Percontohan Pengaruh Nutrisi pada pH Plak dan Demineralisasi Dentin.
Karies Res. 2003, 38, 9–15. [CrossRef]
9. Rosier, B.; Van Loveren, C.; Zaura, E.; Loo, B.; Keijser, B.; Crielaard, W.; Lagerweij, M. Insiden Karies pada Populasi Dewasa Muda yang Sehat
dalam Hubungannya dengan Diet.Klinik JDR. terjemahan Res.2016, 2, 142–150. [CrossRef]
10. Hujoel, PP; Lingström, P. Nutrisi, karies gigi dan penyakit periodontal: Sebuah tinjauan naratif.J.klin. Periodontol.2017,
44, S79–S84. [CrossRef] [PubMed]
11. Selwitz, RHI; Ismail, A.; Pitts, NB Karies gigi.Lanset 2007, 369, 51–59. [CrossRef]
12. Paqué, PN; Herz, C.; Jenzer, JS; Wiedemeier, DB; Attin, T.; Bostanci, N.; Belibasaki, GN; Bao, K.; Korner, P.; Fritz, T.; dkk. Analisis
Mikroba Saliva untuk Mengidentifikasi Penyakit Mulut Menggunakan Uji qPCR yang Kompatibel dengan Point-of-Care.
J.klin. Med.2020, 9, 2945. [CrossRef]
13. Trombelli, L.; Tatakis, DN; Scapoli, C.; Bottega, S.; Orlandini, E.; Tosi, M. Modulasi ekspresi klinis gingivitis yang diinduksi plak. II.
Identifikasi subjek "penanggap tinggi" dan "penanggap rendah".J.klin. Periodontol.2004, 31, 239–252. [CrossRef] [PubMed]

14. Trombelli, L.; Scapoli, C.; Orlandini, E.; Tosi, M.; Bottega, S.; Tatakis, DN Modulasi ekspresi klinis gingivitis yang diinduksi plak. AKU AKU
AKU. Tanggapan dari "penanggap tinggi" dan "penanggap rendah" terhadap terapi.J.klin. Periodontol.2004, 31, 253–259. [CrossRef] [
PubMed]
15. Larsen, T.; Fiehn, N.-E. Infeksi biofilm gigi—Pembaruan.APMI 2017, 125, 376–384. [CrossRef] [PubMed]
16. Hajishengallis, G.; Darveau, RP; Curtis, MA Hipotesis kunci-patogen.Nat. Pdt. Mikrobiol.2012, 10, 717–725. [CrossRef] [PubMed]

17. Loe, H.; Theilade, E.; Jensen, SB Eksperimental Gingivitis pada Manusia.J.Periodontol. 1965, 36, 177–187. [CrossRef]
18. Bostanci, N.; Silbereisen, A.; Bao, K.; Grossmann, J.; Nanni, P.; Fernandez, C.; Nascimento, GG; Belibasaki, GN; Lopez, R. Saliva
proteotipe toleransi dan ketahanan gingivitis.J.klin. Periodontol.2020, 47, 1304–1316. [CrossRef] [PubMed]
19. Offenbacher, S.; Barros, S.; Mendoza, L.; Mauriello, S.; Preisser, J.; Lumut, K.; De Jager, M.; Aspiras, M. Perubahan tingkat
mediator inflamasi cairan sulkus gingiva selama induksi dan resolusi gingivitis eksperimental pada manusia.J.klin. Periodontol.
2010, 37, 324–333. [CrossRef]
20. Bostanci, N.; Ramberg, P.; Wahlander, .; Grossman, J.; Jonsson, D.; Barnes, VM; Papapanou, Proteomik Kuantitatif Bebas Label PN
Mengungkapkan Protein yang Diatur Secara Berbeda dalam Gingivitis Eksperimental.J. Proteome Res. 2013, 12, 657–678. [CrossRef]
21. Gupta, G. Cairan sulkus gingiva sebagai indikator diagnostik periodontal- I: Enzim turunan host dan produk pemecahan jaringan.
J. Med. Kehidupan2012, 5, 390–397.
22. Farges, J.-C.; Keller, J.-F.; Carrouel, F.; Durand, SH; Romeas, A.; Bleicher, F.; Lebecque, S.; Staquet, M.-J. Odontoblas dalam respon
imun pulpa gigi.J. Eks. Zool. Bagian B Mol Dev. Evolusi2009, 312B, 425–436. [CrossRef] [PubMed]
23. Giannobile, Virginia Barat; Beikler, T.; Kinney, JS; Ramseier, CA; Morelli, T.; Wong, DT Saliva sebagai alat diagnostik untuk penyakit periodontal:
Keadaan saat ini dan arah masa depan.Periodontol. 20002009, 50, 52–64. [CrossRef] [PubMed]
24. Kc, S.; Wang, XZ; Gallagher, JE; Sukriti, K. Sensitivitas diagnostik dan spesifisitas biomarker saliva yang diturunkan dari host pada penyakit
periodontal di antara orang dewasa: Tinjauan sistematis.J.klin. Periodontol.2019, 47, 289–308. [CrossRef] [PubMed]
25. Greenwood, D.; Afacan, B.; Emingil, G.; Bostanci, N.; Belibasakis, GN Pergeseran Mikrobioma Saliva sebagai Respons terhadap Hasil Perawatan
Periodontal.Proteom. klinik aplikasi2020, 14, e2000011. [CrossRef]
26. Lundmark, A.; Hu, YOO; Huss, M.; Johannsen, G.; Anderson, AF; Yucel-Lindberg, T. Identifikasi Mikrobiota Saliva dan Kaitannya
Dengan Mediator Inflamasi Host pada Periodontitis.Depan. Sel. Menulari. Mikrobiol.2019, 9, 216. [CrossRef] [PubMed]
27. Korte, DL; Kinney, J. Obat yang dipersonalisasi: Pembaruan biomarker saliva untuk penyakit periodontal.Periodontol. 20002015,
70, 26–37. [CrossRef]
28. Jaedicke, KM; Preshaw, PM; Taylor, JJ Sitokin saliva sebagai biomarker penyakit periodontal.Periodontol. 20002015,
70, 164-183. [CrossRef]
29. Kinney, J.; Morelli, T.; Braun, T.; Ramseier, C.; Herr, A.; Sugai, J.; Shelburne, C.; Rayburn, L.; Singh, A.; Giannobile, W. Saliva / Patogen
Biomarker Tanda Tangan dan Perkembangan Penyakit Periodontal.J. Penyok. Res.2011, 90, 752-758. [CrossRef]
30. Silbereisen, A.; Alassiri, S.; Bao, K.; Grossmann, J.; Nanni, P.; Fernandez, C.; Tervahartiala, T.; Nascimento, GG; Belibasaki,
GN; Heikkinen, A.; dkk. Proteomik Kuantitatif Bebas Label versus Tes Berbasis Antibodi untuk Mengukur Enzim Berasal Neutrofil
dalam Air Liur.Proteom. klinik aplikasi2019, 14. [CrossRef]
31. Akcalı, A.; Bostanci, N.; zçaka, .; ztürk-Ceyhan, B.; Gümüş, P.; Buduneli, N.; Belibasaki, GN Asosiasi antara Sindrom Ovarium
Polikistik, Mikrobiota Oral dan Respons Antibodi Sistemik.PLoS SATU 2014, 9, e108074. [CrossRef]
32. Ebersole, JL; Nagaraja, R.; Akers, D.; Miller, CS Biomarker saliva yang ditargetkan untuk diskriminasi kesehatan dan penyakit periodontal.
Depan. Sel. Menulari. Mikrobiol.2015, 5, 62. [CrossRef]
33. Sexton, WM; Lin, Y.; Kryscio, RJ; Dawson, DR; Ebersole, JL; Miller, CS Biomarker saliva penyakit periodontal sebagai respons
terhadap pengobatan.J.klin. Periodontol.2011, 38, 434–441. [CrossRef]
J. Pers. Med.2021, 11, 235 17 dari 18

34. Rechenberg, D.-K.; Galicia, JC; Peters, OA Penanda Biologis untuk Peradangan Pulpa: Tinjauan Sistematis.PLoS SATU 2016,
11, e0167289. [CrossRef] [PubMed]
35. Martins, C.; Buczynski, AK; Maia, LC; Siqueira, WL; Castro, GFBDA Protein saliva sebagai biomarker untuk karies gigi— Tinjauan
sistematis.J. Penyok. 2013, 41, 2–8. [CrossRef] [PubMed]
36. Farges, J.-C.; Alliot-Licht, B.; Renard, E.; Ducret, M.; Gaudin, A.; Smith, AJ; Cooper, PR Gigi Pulp Pertahanan dan Mekanisme
Perbaikan Karies Gigi.Mediasi radang.2015, 2015, 1–16. [CrossRef] [PubMed]
37. Ayad, M.; Van Wuyckhuyse, B.; Minaguchi, K.; Raubertas, R.; Bedi, G.; Penagihan, R.; Bowen, W.; Tabak, L. Asosiasi peptida kaya prolin
dasar dari sekresi kelenjar parotis manusia dengan pengalaman karies.J. Penyok. Res.2000, 79, 976–982. [CrossRef]
38. Tulunoglu, O.; Demirtas, S. Kadar antioksidan total saliva pada anak berhubungan dengan karies, usia, dan jenis kelamin.Int. J. Pediatr. Lekuk.
2006, 16, 186-191. [CrossRef]
39. Roa, NS; Chaves, M.; GHaimez, M.; Jaramillo, LM Asosiasi protein saliva dengan karies gigi pada populasi Kolombia.
Acta Odontol Latinoam 2008, 21, 69–75.
40. Yoshizawa, JM; Schafer, CA; Schafer, JJ; Farrel, JJ; Pendeta, BJ; Wong, DTW Biomarker Saliva: Menuju Utilitas Klinis dan Diagnostik
Masa Depan.klinik Mikrobiol. Putaran.2013, 26, 781–791. [CrossRef] [PubMed]
41. Streckfus, CF; Bigler, LR Saliva sebagai cairan diagnostik.Dis. 2002, 8, 69–76. [CrossRef]
42. Mitsakakis, K.; Stumpf, F.; Strohmeier, O.; Klein, V.; Mark, D.; Von Stetten, F.; Peham, JR; Herz, C.; Paqué, P.; Wegehaupt, F.; dkk. Diagnosis infeksi
saluran pernapasan dan mulut di kursi/tempat tidur, dan identifikasi resistensi antibiotik untuk pemantauan dan pengobatan yang
dipersonalisasi.pejantan Teknologi Kesehatan. Memberitahukan.2016, 224, 61–66.
43. Belibasaki, GN; Bostanci, N.; Rawa, PD; Zaura, E. Aplikasi mikrobioma oral dalam kedokteran gigi pribadi.Lengkungan. Biola
Oral.2019, 104, 7–12. [CrossRef]
44. Proctor, GB Fisiologi sekresi saliva. Periodontol. 20002016, 70, 11–25. [CrossRef]
45. Dige, I.; Schlafer, S.; Nyvad, B. Perbedaan akumulasi biofilm gigi awal antara malam dan siang.Akta Odontol. Pindai.2011,
70, 441–447. [CrossRef]
46. Navazesh, M.; Kumar, SK Mengukur aliran saliva.Selai. Lekuk. Asosiasi2008, 139, 35S–40S. [CrossRef]
47. 4Hong, aku.; Pae, H.-C.; Lagu, YW; Cha, J.-K.; Lee, J.-S.; Paik, J.W.; Choi, S.-H. Biomarker Cairan Oral untuk Mendiagnosis Gingivitis pada Manusia:
Sebuah Studi Cross-Sectional.J.klin. Med.2020, 9, 1720. [CrossRef]
48. Costantini, E.; Sinjari, B.; Piscopo, F.; Porreca, A.; Real, M.; Caputi, S.; Murmura, G. Evaluasi Sitokin Saliva dan Tingkat Vitamin D
pada Pasien Periodontopathic.Int. J. Mol. Sci.2020, 21, 2669. [CrossRef] [PubMed]
49. Verhulst, MJL; Teeuw, WJ; Bizzarro, S.; Muris, J.; Matahari.; Nicu, EA; Nazmi, K.; Bikker, FJ; Loos, BG Alat cepat dan non-invasif untuk skrining
periodontitis dalam pengaturan perawatan medis.Kesehatan Mulut BMC 2019, 19, 87. [CrossRef]
50. Nukleotida: Bethesda (MD): Perpustakaan Kedokteran Nasional (AS), Pusat Informasi Bioteknologi Nasional. 1988. Tersedia
online:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ (diakses pada 6 Mei 2017).
51. Untergasser, A.; Sayatan, saya.; Koressaar, T.; Kamu, J.; Kain Adil, SM; Remm, M.; Rozen, SG Primer3—kemampuan dan antarmuka baru.
Asam Nukleat Res. 2012, 40, e115. [CrossRef] [PubMed]
52. Majelis: Bethesda (MD): Perpustakaan Kedokteran Nasional (AS), Pusat Nasional untuk Informasi Bioteknologi. 2012. Tersedia
online:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ (diakses pada 6 Mei 2017).
53. Wei, R.; Wang, J.; Jumlah.; Jia, E.; Chen, S.; Chen, T.; Ni, Y. Pendekatan Imputasi Nilai Hilang untuk Data Metabolomik Berbasis
Spektrometri Massa.Sci. Reputasi.2018, 8, 1–10. [CrossRef]
54. Paluszynska, A.; Biecek, P.; Jiang, Y. randomForestExplainer: Menjelaskan dan Memvisualisasikan Hutan Acak dalam Hal Kepentingan
Variabel. Paket R versi 0.10.1. Tersedia secara online:https://CRAN.R-project.org/package=randomForestExplainer (diakses pada 9
Maret 2020).
55. Ehrlinger, J. ggRandomForests: Menjelajahi Hutan Acak secara Visual. Paket R versi 2.0.1. Tersedia secara online:https://
CRAN.Rproject.org/package=ggRandomForests (diakses pada 17 Maret 2021).
56. Tim Inti R. R: Bahasa dan Lingkungan untuk Komputasi Statistik. Yayasan R untuk Komputasi Statistik: Wina, Austria, 2018;
Tersedia secara online:https://www.R-project.org (diakses pada 4 Februari 2021).
57. Wickham, H. ggplot2: Grafik Elegan untuk Analisis Data; Musim Semi: New York, NY, AS, 2016; P. 213.
58. Pohlert, T. PMCMRplus: Hitung Perbandingan Ganda Berpasangan dari Jumlah Peringkat Rata-rata Diperpanjang. Paket R versi 1.4.4.
2020. Tersedia online:https://CRAN.R-project.org/package=PMCMRplus (diakses pada 4 Februari 2021).
59. Liaw, A.; Wiener, M. Klasifikasi dan Regresi oleh randomForest.R Berita 2002, 2, 18–22.
60. L, S.; Josse, J.; Husson, F. FactoMineR: Paket AnRP untuk Analisis Multivariat.J.Stat. lunak2008, 25, 1–18. [CrossRef]
61. Paul, WE Sejarah interleukin-4. Sitokin 2015, 75, 3–7. [CrossRef] [PubMed]
62. Minty, A.; Chalon, P.; Derocq, J.-M.; Dumont, X.; Guillemot, J.-C.; Kaghad, M.; Labit, C.; Leplatois, P.; Liauzun, P.; Miloux, B.; dkk.
lnterleukin-13 adalah limfokin manusia baru yang mengatur respons inflamasi dan imun.Nat. Biol Sel.
1993, 362, 248–250. [CrossRef]
63. Zurawski, G.; De Vries, JE Interleukin 13, suatu sitokin mirip interleukin 4 yang bekerja pada monosit dan sel B, tetapi tidak pada sel T.
kekebalan. Hari ini1994, 15, 19–26. [CrossRef]
64. Bhattacharjee, A.; Shukla, M.; Yakubenko, Wakil Presiden; Mulya, A.; Kundu, S.; Cathcart, MK IL-4 dan IL-13 menggunakan jalur
pensinyalan terpisah untuk ekspresi gen target dalam monosit/makrofag yang diaktifkan secara alternatif.Gratis. radikal. Biol. Med.
2013, 54, 1–16. [CrossRef]
J. Pers. Med.2021, 11, 235 18 dari 18

65. Malabarba, MG; Rui, H.; Jerman, HHJ; Chung, J.; Kalthoff, FS; Farrar, WL; Kirken, RA Interleukin-13 adalah aktivator ampuh JAK3
dan STAT6 dalam sel yang mengekspresikan reseptor interleukin-2-γ dan reseptor- interleukin-4.Biokimia. J.1996,
319, 865–872. [CrossRef]
66. Hosokawa, Y.; Hosokawa, aku.; Shindo, S.; Ozaki, K.; Matsuo, T. IL-4 Memodulasi Produksi CCL11 dan CCL20 dari Sel Ligamen
Periodontal Manusia yang Distimulasi IL-1β.Sel. Fisiol. Biokimia.2016, 38, 153–159. [CrossRef] [PubMed]
67. Weijden, GA; Timmerman, MF; Nijboer, A.; Reijerse, E.; Velden, U. Perbandingan pendekatan yang berbeda untuk menilai perdarahan saat
probing sebagai indikator gingivitis.J.klin. Periodontol.1994, 21, 589–594. [CrossRef] [PubMed]
68. Lopez, R.; Hujoel, P.; Belibasakis, GN Pada patogen periodontal diduga: Sebuah perspektif epidemiologi.Keracunan 2015,
6, 249–257. [CrossRef] [PubMed]
69. Bostanci, N.; Bao, K.; Kayu Hijau, D.; Silbereisen, A.; Belibasakis, GN Penyakit periodontal: Dari lensa mikroskop cahaya hingga
spesifikasi proteomik dan sekuensing generasi berikutnya.Adv. klinik Kimia2019, 93, 263–290. [CrossRef] [PubMed]
70. Bustin, SA; Benes, V.; Garson, JA; Hellemans, J.; Huggett, J.; Kubista, M.; Mueller, R.; Nolan, T.; Pfaffl, MW; Shipley, GL; dkk.
Pedoman MIQE: Informasi Minimum untuk Publikasi Eksperimen PCR Waktu Nyata Kuantitatif.klinik Kimia2009,
55, 611–622. [CrossRef] [PubMed]
71. Baik, DH; Markowitz, K.; Furgang, D.; Velliyagounder, K. Aggregatibacter actinomycetemcomitansas sebagai Kolonisasi Awal Jaringan
Mulut: Epitel sebagai Reservoir?J.klin. Mikrobiol.2010, 48, 4464–4473. [CrossRef]
72. Cavalla, F.; Hernandez-Rios, P.; Sorsa, T.; Biguetti, C.; Hernandez, M. Matrix Metalloproteinases sebagai Regulator Inflamasi
Periodontal.Int. J. Mol. Sci.2017, 18, 440. [CrossRef]
73. Schwendicke, F.; Brouwer, F.; Paris, S.; Stolpe, M. Mendeteksi Lesi Karies Sekunder Proksimal.J. Penyok. Res.2015, 95, 152–159. [CrossRef
] [PubMed]
74. Brouwer, F.; Askar, H.; Paris, S.; Schwendicke, F. Mendeteksi Lesi Karies Sekunder.J. Penyok. Res.2016, 95, 143-151. [CrossRef]