Hasil dan Pembahasan

Pemurnian PCLE
PCLE dimurnikan dari media kultur B47-9 memberikan hampir satu band
19,7-kDa di SDS-PAGE, meskipun kotoran yang sangat samar dapat dikenali di
daerah >75 kDa (Gambar 1). Aktivitas penurunan PBSA yang dipulihkan
diperkirakan 58,5% dari total aktivitas enzim asli (Tabel 2). Larutan enzim yang
dimurnikan memiliki aktivitas spesifik 1,47 kali lipat dibandingkan dengan
larutan enzim mentah (Tabel 2), menunjukkan bahwa PCLE menyumbang 68%
(w / w) protein yang disekresikan dalam media. PCLE dimurnikan dari media
kultur B47-9 memberikan hampir satu band 19,7-kDa di SDS-PAGE, meskipun
kotoran yang sangat samar dapat dikenali di daerah >75 kDa (Gambar 1).
Aktivitas penurunan PBSA yang dipulihkan diperkirakan 58,5% dari total
aktivitas enzim asli (Tabel 2). Larutan enzim yang dimurnikan memiliki aktivitas
spesifik 1,47 kali lipat dibandingkan dengan larutan enzim mentah (Tabel 2),
menunjukkan bahwa PCLE menyumbang 68% (w / w) protein yang disekresikan
dalam media.
Isolasi dan identifikasi gen PCLE
Sebuah fragmen DNA dari ca. 350 bp diperkuat oleh PCR menggunakan
primer merosot (F6 dan R10) dengan DNA genom strain B47-9 sebagai template.
Setelah DNA berjalan PCR, ca. 1.100 bp urutan hulu dan ca. 300 bp urutan hilir
diperkuat. Akhirnya, dengan menghubungkan urutan ketiga fragmen ini, urutan
1.711-bp terus menerus diperoleh dan disimpan ke GenBank. Dibandingkan
dengan urutan cDNA, gen PCLE ditemukan memiliki dua intron yang terletak
pada posisi 199-284 (86 bp) dan 500-552 (53 bp) dan urutan pengkodean yang
terdiri dari 681 bp coding untuk 227 asam amino (Gambar 2). Gen PCLE
terdeteksi sebagai lokus tunggal dalam genom oleh hibridisasi Selatan (data tidak
ditampilkan).
 Gambar 1. SDS-PAGE dari enzim peningsur BP yang dimurnikan. Jalur 1,
standar berat molekul; jalur 2, larutan enzim mentah; dan jalur 3, larutan enzim
yang dimurnikan. Panah menunjukkan posisi enzim yang dimurnikan
 Gambar 2. Urutan DNA PCLE dan urutan asam amino yang disimpulkan. Dua
intron dinaungi. Urutan promotor yang diprediksi, TATA-box, di wilayah
noncoding 5 'dan sinyal poliadenilasi, AATAAA, di wilayah noncoding 3'tertutup.
Urutan asam amino parsial yang dikonfirmasi oleh sekuensing peptida
digarisbawahi. Primer PCR yang digunakan dalam penelitian ini ditunjukkan oleh
panah. Urutan nukleotida telah diberi nomor dengan "A" dari kodon awal ATG
sebagai +1

Pencarian BLAST untuk urutan asam amino yang disimpulkan

mengungkapkan bahwa enzim ini memiliki kesamaan yang signifikan dengan
kutikula jamur. Keselarasan dengan beberapa kutikula yang diketahui yang
struktur kristalnya telah dikonfirmasi ditunjukkan pada Gambar 3. Urutan motif
cutinase, tiga residu asam amino yang sesuai dengan triad aktif, dan empat
cysteines diharapkan untuk membentuk dua ikatan disulfida benar-benar
dilestarikan.
Karakterisasi enzim
Ca2 + dan Mg2 + menunjukkan efek kontras pada aktivitas penurunan
PBSA yang dimulsi enzim. Ca2 + pada konsentrasi dari 1 hingga 2,5 mM
meningkatkan aktivitas hingga sekitar 3 kali lipat, sedangkan Mg2 + hampir
sepenuhnya menghambat aktivitas pada konsentrasi yang sama dan tidak
menyebabkan peningkatan bahkan pada konsentrasi yang lebih rendah (Gambar
4a). PCLE menunjukkan aktivitas peninggihan PBSA maksimum pada pH 7.2,
yang tidak aktif karena pH naik menjadi 10 atau turun menjadi 5,5 (Gambar 4b).
Aktivitasnya maksimum pada suhu 45 ° C dan menjadi hampir tidak aktif karena
suhu meningkat menjadi 55 ° C atau menurun menjadi 15 ° C (Gambar 4c).
Aktivitas residual sangat menurun ketika suhu pra-inkubasi melebihi 40 ° C
(Gambar 4c).
Spesifikasi Subrat PCLE
PCLE lebih suka substrat panjang rantai pendek seperti pNPvalerate (C5);
Namun, bahkan untuk substrat rantai panjang seperti pNP-stearate (C18), sekitar
24% dari aktivitas maksimum terdeteksi (Gambar 5a). Spektrum degradasi PCLE
untuk film pemeran BP berdasarkan TOC yang larut dalam air yang dirilis dari
film ditampilkan dalam Fig. 5b. Enzim mengungkapkan aktivitas penurunan yang
jelas untuk film PBS, PBSA, PBAT, PCL, dan PDLLA, tetapi tidak menurunkan
PLLA dan PHB sama sekali.