OT FadilaKurnia 08061181722067
OT FadilaKurnia 08061181722067
NIM : 08061181722067
2. Metode Penelitian
2.1.Preparasi Tanaman dan Ekstrak
Daun dan ranting dari P. pseudocaryophyllus (Gomes) Landrum
dikumpulkan di Lagoa Santa, Minas Gerais, Brazil, pada Oktober 2012. Ekstraksi
daun (1742,0 g) dan cabang (2896,0 g) dilakukan ekstraksi dengan metode
perkolasi menggunakan heksana, etil asetat dan etanol untuk peningkatan
polaritas. Lalu pelarut diuapkan dengan menggunakan rotatory evaporator (Buchi)
40°C, menghasilkan ekstrak kental berikut: daun heksan (HL, 30.0 g), cabang
heksan (HB, 3.8 g), daun etil asetat (EAL, 74,0 g), cabang etil asetat (EAB, 50,0
g), daun etanol (EEL, 236,0 g) dan cabang etanol (EEB, 182,0 g). Ekstrak air
diperoleh dengan perkolasi 70,0 g daun secara menyeluruh dan bubuk cabang
dengan air suling. Air dihilangkan dengan liofilisasi, menghasilkan 9,6 g ekstrak
kasar encer daun (AL) dan 4,9 g ekstrak kasar berair dari cabang (AB).
2.2. Skrining Fitokimia
Adanya tanin dan polifenol, flavonoid, glikosida dan antrakuinon aglikon,
triterpen, steroid, kumarin, alkaloid, saponin, glikosida kardiotonik, dan
proantosianidin dievaluasi dalam ekstrak P. pseudocaryophyllus. Analisis
dilakukan dengan menggunakan prosedur standar yang dijelaskan sebelumnya
(Farnsworth, 1966; Matos, 1997).
2.3. Uji oksidase xantin in vitro
Pengujian dengan ekstrak P. pseudocaryophyllus dilakukan menggunakan
metodologi sebelumnya yang dijelaskan oleh Ferraz Filha et al. (2006), dengan
modifikasi. EAL, EAB, EEL dan EEB dilarutkan dalam air suling dan DMSO
(1%) dengan konsentrasi akhir10.0; 20,0; 30,0; 40,0; 50.0 dan 100.0 μg / mL,
untuk mendapatkan Nilai IC50. Di cember yang berisi volume masing-masing
500 μLsampel ditambahkan 1,125 mL dapar fosfat (pH 7,4) dan 187,5 μL enzim
XO (0,28 U / mL). Sistem ini diinkubasi pada 30 ° C selama 10 menit. Setelah itu,
substrat xantin sebanyak 1.375 mL ditambahkan dan absorbansi segera diperoleh
setiap menit selama 10 menit pada 295 nm (Varian BIO-50). Allopurinol,
xanthine inhibitor oksidase, digunakan sebagai kontrol positif (10 μg / mL).
Hasilnya dinyatakan sebagai persentase penghambatan XO dan dihitung sebagai:
% penghambatan ¼ (kemiringan 1 pengujian / kemiringan kosong) 100.
2.4. Aktivitas Urikosurik Pada Tikus
Mencit Swiss albino jantan (25–30 g) dan tikus Wistar jantan (180–280 g)
dipasok oleh Universidade Federal de Ouro Preto. Hewan dibagi menjadi
kelompok eksperimen (n¼6), ditempatkan di kotak plastik dan dirawat pada siklus
terang 12 jam / gelap 12 jam, di suhu kamar 25 ° C. Mereka diberi makanan
standar dan air ad libitum.
Murugaiyah dan Chan (2009) sebelumnya menggunakan model ini dalam
studi anti-hiperurisemia. Tikus menerima kalium oksonat (200 mg / kg,
intraperitoneal) dan asam urat (1 g / kg, dengan gavage) agar menjadi
hiperurisemia. Makanan dan air ditarik semalaman sebelum penelitian. EAL,
EAB, EEL dan EEB (125 dan 250 mg / kg) disiapkan dalam larutan minyak
DMSO 5% dan obat yang digunakan secara klinis, benzbromarone (10 mg / kg)
dan probenesid (50 mg / kg) disiapkan dalam campuran etanol 10% dalam 20%
Tween 20 larutan air. Formulasi diberikan secara intraperitoneal ke tikus 30 menit
setelah induksi hiperurisemia. Urine dikumpulkan di tabung dan asupan air diukur
selama 5 jam setelah perawatan. Akhirnya, hewan dibius dengan ketamin dan
xylasine (masing-masing 40 dan 87 mg / kg), diberikan secara intraperitoneal,
untuk mengambil darah dari aorta perut. Sampel darah dipertahankan pada suhu
kamar sampai pembekuan darah dan, setelah itu, serumnya diperoleh setelah
sentrifugasi pada 3000g selama 10 menit. Serum dan sampel urin disimpan pada
suhu 20 ° C sampai pengukuran asam urat, yang dilakukan dengan metode
kolorimetri, menggunakan standar kit diagnostik (Bioclin, Brasil), menurut
produsen instruksi.
2.5. Uji in vivo xantin oksidase
Hati tikus dipotong segera setelah pengambilan darah, dicuci dalam larutan garam
0,9% dan disimpan dengan cepat pada suhu 80 ° C sampai diproses. Pemisahan
fraksi sitosol yang mengandung enzim dilakukan seperti yang dijelaskan (Haidari
et al., 2009; Zhu et al., 2004). Secara singkat, hati dihomogenisasi dalam 5 mL
dari 80 mM buffer natrium fosfat (pH 7,4). Homogenat disentrifugasi pada 3000g
selama 10 menit pada suhu 4 ° C. Lapisan lipid telah dihilangkan dan supernatan
disentrifugasi lagi p selama 60 menit pada 4 ° C, menghasilkan fraksi sitosol.
Fraksi ini sudah biasamengevaluasi aktivitas residu xantin oksidase hati menurut
metode yang sebelumnya dijelaskan oleh Hall et al. (1990) dengan modifikasi.
Pembentukan asam urat dipantau secara spektrofotometri. Singkatnya, 100 μL
dari fraksi sitosol hati diinkubasi sebelumnya dalam 5,4 mL larutan kalium
oksonat (1 mM) di 50 mM dapar natrium fosfat (pH 7,4) pada 35 ° C selama 15
menit. Setelah masa inkubasi, 1,2 mL larutan xantin (250 mM) ditambahkan
untuk memulai reaksi, dihentikan setelah 0 dan 30 menit dengan penambahan 500
μL 0,6 M HCl. Sampel disentrifugasi pada 3000g selama 5 menit dan asam urat
dalam supernatan diukur secara spektrofotometri pada 295 nm (Varian BIO-50).
Konsentrasi protein ditentukan menurut Bradford (1976) metode menggunakan
albumin serum sapi sebagai standar. Aktivitas enzim dinyatakan sebagai nmol
produksi asam urat.
2.6. Efek Peradangan Akibat Kristal Monosodium Pada Tikus
Aktivitas anti-inflamasi ekstrak P. Pseudocaryophyllus dievaluasi
menggunakan model dari metode yang dijelaskan sebelumnya oleh Rasool dan
Varalakshmi (2006). Pada hari pertama percobaan (waktu 0), inflamasi diinduksi
dengan injeksi 50 μL (80 mg / mL) kristal monosodium (MSU) ke dalam wilayah
subplantar tikus kaki belakang kanan, sedangkan kelompok kontrol normal
mendapat saline 0,9%. EAL, EAB, EEL dan EEB (125 dan 250 mg / kg)
disiapkan di 5% larutan berminyak DMSO. Indometasin (3 mg / kg) dalam
campuran 10% Tween 20 larutan air. Sampel diberikan secara gavage 1 jam
sebelum injeksi MSU dan diulangi setiap hari selama 2 hari lagi. Ketebalan kaki
antara wajah punggung dan perut dari kaki diperoleh dengan menggunakan
caliper aturan pada 0, 4, 24 dan 48 jam setelah injeksi MSU, sedangkan
pembengkakan inflamasi dinyatakan sebagai variasi ketebalan (Δ) versus waktu 0.
2.7. Analisis Statistika
Hasilnya disajikan sebagai kesalahan standar mean (S.E.M.) dari enam
hewan. Signifikansi statistik dari perbedaan dievaluasi dengan analisis varian
(ANOVA) diikuti oleh Tes Dunnett menggunakan GraphPad Prism 5.0 Software
(Inc., San Diego, CA, AS). Nilai IC50 dihitung dengan regresi linier.
4. Kesimpulan
Spesies P. pseudocaryophyllus menunjukkan aktivitas anti-hiperurisemia
yang luar biasa. ekstrak yang diuji mampu mengurangi asam urat serum melalui
dua jalur utama regulasi asam urat dalam tubuh manusia, dengan menghambat
pembentukan dan meningkatkan nya ekskresi. Oleh karena itu, ekstrak P.
pseudocaryophyllus dapat dianggap menjanjikan dalam pengobatan penyakit yang
berhubungan dengan hiperurisemia. Selain itu, ekstrak etil asetat juga memiliki
aktivitas antiinflamasi yang signifikan.
Beberapa flavonoid telah menunjukkan kemampuan untuk menghambat
xantin oksidase, anti-hiperurisemik dan aktivitas anti-inflamasi. Flavonoid
terdeteksi di semua ekstrak yang dievaluasi, sedang dipertimbangkan metabolit
utama di P. pseudocaryophyllus. Karena itu, kelompok metabolit ini mungkin
bertanggung jawab atas efek anti-hiperurisemik dan anti-inflamasi P.
Pseudocaryophyllus ekstrak.