MAKALAH BIOTEKNOLOGI FARMASI

“SISTEM KROMATOGRAFI”

DISUSUN OLEH :

NAMA : AINY RAMADHANY

NIM : G701 19 103

KELAS :B

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS TADULAKO

2021
 KATA PENGANTAR

Puji syukur diucapkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmatnya sehingga makalah ini dapat
tersusun sampai selesai. Tidak lupa saya mengucapkan terima kasih terhadap bantuan dari pihak
yang telah berkontribusi dengan memberikan sumbangan baik pikiran maupun materinya.

Saya sangat berharap semoga makalah ini dapat menambah pengetahuan dan pengalaman bagi
pembaca. Bahkan saya berharap lebih jauh lagi agar makalah ini bisa pembaca praktekkan dalam
kehidupan sehari-hari.

Bagi saya sebagai penyusun merasa bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan
makalah ini karena keterbatasan pengetahuan dan pengalaman saya. Untuk itu saya sangat
mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari pembaca demi kesempurnaan makalah ini

Palu, 04 November 2021

Ainy Ramadhany

G701 19 103
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ………………………………………………………….............................

DAFTAR ISI ……………………………………………………………………...........................

BAB I PENDAHULUAN ………...........................……………………………………………….

I.1 Latar Belakang …...…………………………………………………….....................................

I.2 Rumusan Masalah ...........………………………………………………....................................

I.3 Tujuan …..........…………………………………………………………...................................

BAB II PEMBAHASAN .........................………….…………………………………………….

II.1 Metode Kromotografi ................................…............................................................................

II.2 Jenis Reverse Phase (Rp) ................................…......................................................................

II.3 Jenis Ion Exchange................................….................................................................................

II.4 Jenis Gel Filtration ..............................…..................................................................................

II.5 Jenis Afinity ..............................…............................................................................................

II. 6 Jenis Hydrophobic Interaction Crhomatography ............................…....................................

BAB III PENUTUP ……………….......………………………………………..............................

III.1 Kesimpulan ....……………………...................................…………………………………...

III.2 Saran …….......…………………………………………....................................…….............

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................................…………

 BAB I

PENDAHULUAN

1. Latar Belakang

Sekarang ini deteksi sifat spesifik suatu senyawa menjadi sangat penting,terutama dalam
bidang farmasi, kimia, dan klinik, serta bidang lainnya. Suatu analisis kimia seperti
pengambilan cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu, isolasi senyawa yang
dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan pengukuran banyak
dilakukan. Banyak metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya,
akan tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk
mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi.

Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat. Karena

pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif.
Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan, dan
kromatografi preparatif hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni dari campuran.
Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa
sifat fisika umum dari molekul. Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa teknik
kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan
senyawa yang akan dipisahkan. Berdasarkan uraian tersebut, maka akan membahas tentang
metode kromatografi kolom.
2. Rumusan Masalah

1. Apa yang dimaksud dengan metode kromotografi ?

2. Apa yang dimaksud dengan jenis Reverse phase (RP) ?

3. Apa yang dimaksud dengan jenis ion exchange ?

4. Apa yang dimaksud dengan jenis gel filtration ?

5. Apa yang dimaksud dengan jenis afinity ?

6. Apa yang dimaksud dengan jenis hydrophobic interaction crhomatography ?

3. Tujuan Makalah

1. Untuk mengetahui mengenai metode kromotografi

2. Untuk mengetahui mengenai jenis Reverse Phase (RP)

3. Untuk mengetahui mengenai jenis ion exchange

4. Untuk mengetahui mengenai jenis gel filtration

5. Untuk mengetahui mengenai jenis afinity

6. Untuk mengetahui mengenai jenis hydrophobic interaction crhomatography

 BAB II

PEMBAHASAN

II.1 Pengertian kromotografi

Metode kromatografi adalah salah satu teknik pemurnian yang banyak dilakukan dalam
proses analisa kimia dan produksi karena sifatnya yang selektif. Pada proses produksi
biasanya kromatografi digunakan untuk proses pemurnian. Pemurnian secara kromatografi
dilakukan dengan cara memanfaatkan perbedaan sifat fisika-kimia umum dari bentuk
molekul atau ion, ukuran partikel, kelarutan dan lain-lain. Kromatografi adalah proses
pemisahan zat terlarut berdasarkan perbedaan migrasi suatu sistem yang terdiri dari fasa
diam dan fasa gerak. Salah satu fase gerak yang sering dipakai adalah molekul yang
memiliki perbedaan mobilitas sehingga terjadi perbedaan dalam adsorpsi, partisi,
kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul, atau kerapatan muatan ion. Perbedaan cara kerja
kromatografi itu memberikan variasi teknik seperti kromatografi penukar ion (ion
exchange chromatography), kromatografi eksklusi ukuran (size exclusion
chromatography), kromatografi fasa normal (phase normal chromatography), kromatografi
fasa terbalik (reverse phase chromatography), kromatografi afinitas (affinity
chromatography).

II.2 Jenis Reverse Phase (RP)

Reverse phase chromatography merupakan alat analitikal yang kuat dengan memadukan
sifat hidrofobik serta rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia pada
padatan inert seperti silika. Cara ini biasa digunakan untuk anggota ekstraksi dan
pemisahan senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatile). Istilah "fasa terbalik"
mempunyai latar belakang sejarah. Pada tahun 1970an, sebagian besar kromatografi cair
dilakukan menggunakan pendukung fasa diam (disebut juga dengan "kolom") berisi resin
silika atau alumina yang tidak dimodifikasi. Metode ini disebut "kromatografi fasa
 normal". Pada kromatografi fasa normal, fasa diam adalah hidrofilik sehingga mempunyai
afinitas yang kuat terhadap molekul hidrofilik dalam fasa gerak. Oleh karena itu, molekul-
molekul hidrofilik dalam fasa gerak cenderung untuk terikat (atau teradsorpsi) pada kolom,
sementara molekul-molekul hidrofobik mengalir melalui kolom dan dielusi pertama kali.
Dalam kromatografi fasa normal, molekul hidrofilik dapat dielusi dari kolom dengan
menaikkan polaritas larutan dalam fasa gerak.

Teknik ini diperkenalkan menggunakan rantai alkil yang berikatan kovalen pada fasa
pendukung, menciptakan fasa diam hidrofobik yang mempunyai afinitas yang lebih kuat
terhadap senyawa-senyawa hidrofobik. Penggunaan fasa diam hidrofobik diperhitungkan
sebagai lawan atau "kebalikan" dari kromatografi fasa normal, sehingga muncullah istilah
"kromatografi fasa terbalik". Kromatografi fasa terbalik melibatkan fasa gerak polar
(aqueous). Akibatnya, molekul-molekul hidrofobik cenderung teradsorpsi pada fasa diam
hidrofobik, dan molekul-molekul hidrofilik dalam fasa gerak akan melewati kolom dan
terelusi lebih dulu. Molekul-molekul hidrofobik dapat dielusi dari kolom dengan
menurunkan polaritas fasa gerak menggunakan pelarut organik (non-polar), yang dapat
mengurangi interaksi hidrofobik. Semakin hidrofobik suatu molekul, semakin kuat terikat
pada fasa diam, dan semakin tinggi konsentrasi pelarut organik yang diperlukan untuk
mengelusi molekul tersebut. Banyak perhitungan matematis dan eksperimental yang
digunakan dalam metode kromatografi lainnya juga diterapkan pada RPC (misal, resolusi
pemisahan bergantung pada panjang kolom). Hal ini dapat digunakan untuk pemisahan
molekul-molekul dengan variasi luas. Tetapi RPC tidak dapat digunakan untuk pemisahan
protein, karena pelarut organik yang digunakan dalam RPC dapat mendenaturasi sebagian
besar protein. Berdasarkan alasan inilah, kromatografi fasa normal lebih umum digunakan
untuk pemisahan protein.

II.3 Jenis Ion Exchange

Kromatografi penukar ion (ion exchange chromatography) sering digunakan dalam proses
pemurnian yang hanya diterapkan pada senyawa ionik, metode ini banyak digunakan
dalam memisahkan molekul protein terutama enzim. Perbedaan selektif antara fase diam
(resin) dengan senyawa target serta senyawa yang tidak kita inginkan (untargeted), maka
masing-masing komponen akan bergerak sepanjang kolom (fase diam) dengan laju alir
yang tergantung pada penyerapan karakteristik dalam kolom. Pada proses pemisahan ada
beberapa senyawa yang akan keluar dari kolom dengan interval waktu yang berbeda,
karena proses keseluruhannya adalah migrasi yang dihasilkan oleh tenaga pendorong
selektif dari fase gerak. Proses penahanan dan pelepasan senyawa kimia dalam proses
kromatografi salah satunya adalah karena bentuk dan struktur kolom terkemas (column
packing) atau resin terkemas (resin packing). Beberapa teknik pengemasan kolom
kromatografi dapat dibedakan berdasarkan parameter yang tergantung pada karakteristik
resin yang digunakan. Setiap resin memiliki liganda, basa, atau senyawa kimia yang
spesifik sebagai matriks resin. Proses pengemasan kolom akan berpengaruh terhadap
efisiensi kolom. Salah satu parameter yang berpengaruh adalah laju aliran linier (linier
flow rate). Dimana nilai laju aliran linier suatu resin memiliki batas interval dari tinggi
kolom yang digunakan.

Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digunakan untuk

pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida, protein. Cara ini bisa diterapkan
dalam dua tipe, adalah dalam kolom maupun ruang datar (planar). Terdapat dua tipe
pertukaran ion, adalah pertukaran kation (cation exchange) dan pertukaran anion (anion
exchange). Pada pertukaran kation, fase stasioner bermuatan negatif, sedangkan pada
pertukaran anion, fase stasioner bermuatan positif. Molekul bermuatan yang berada pada
fase cair akan menempuh kolom. Jika muatan pada molekul sama dengan kolom, maka
molekul tersebut akan terelusi. Namun jika muatan pada molekul tidak sama dengan
kolom, maka molekul tersebut akan membentuk ikatan ionik dengan kolom. Untuk
mengelusi molekul yang menempel pada kolom diperlukan penambahan larutan dengan
pH dan daya ionik tertentu. Pemisahan dengan cara ini sangat selektif dan karena biaya
untuk menjalankan cara ini murah serta kapasitasnya tinggi, maka cara ini biasa digunakan
pada awal anggota semuanya
II.4 Jenis Gel Filtration

Kromatografi filtrasi gel merupakan suatu proses pemisahan protein berdasarkan

perbedaan ukuran molekul dari suatu protein. Proses pemisahan menggunakan matriks gel
berpori yang ditempatkan di dalam kolom dan dikelilingi oleh pelarut. Teknik kromatografi
filtrasi gel bekerja dengan prinsip pemisahan berdasarkan ukuran molekul zat padat.
Mekanisme pemisahan yang terjadi adalah adsorpsi. Pada kromatografi filtrasi gel yang
terjadi berdasarkan ukuran molekul dari senyawa-senyawa dalam campuran. Fasa diam
pada kromatografi ini dibuat dengan ukuran pori tertentu dan seragam. Senyawa-senyawa
yang mempunyai ukuran lebih kecil atau mirip dengan pori pada permukaan fasa diam
akan diretensi. Dengan demikian, molekul-molekul yang lebih besar dielusi terlebih dahulu
dan molekul- molekul yang lebih kecil dielusi kemudian. Fase gerak yang digunakan
berupa suatu pelarut yang hanya berfungsi untuk melarutkan analit (senyawa yang
diinginkan). Jadi, dalam kromatografi jenis ini tidak terjadi interaksi antara fasa gerak
dengan fasa diam dan senyawa-senyawa dalam campuran. Fasa gerak hanya berfungsi
sebagai pembawa (carrier).

Fase diam yang digunakan dapat berupa silica atau polimer yang berpori (porus), sehingga
solut dapat melewati porus tersebut (lewat diantara partikel), atau berdifusi melalui fase
diam. Fase gerak pada kromatografi ini tidak berpengaruh, sehingga pelarut yang berlainan
yang mempunyai daya mensolvasi yang sama menghasilkan hasil yang sama. Sedikit
banyak fase gerak pada kromatografi filtrasi gel serupa dengan gas pada kromatografi gas
dalam hal fungsinya yang hanya sebagai medium netral yang memungkinkan molekul solut
memasuki fase diam. Fasa gerak dipilih untuk meminimalisir interaksi solut dengan
permukaan penyangga, memiliki kemurnian yang tinggi, tidak bereaksi dengan fase diam,
tercampurkan dengan komponen sistem, pelarutnya baik untuk cuplikan,dapat membasahi
permukaan kemasan dan viskositasnya rendah.
II.5 Jenis Affinity
Kromatografi afinitas merupakan varian dari kromatografi yang menggunakan spesifitas
biologis pada interaksi antara analit dan ligan pemisahan. Teknik yang digunakan oleh
kromatografi afinitas adalah mengadaptasi interaksi yang bersifat reversibel dan spesifik
layaknya peristiwa yang banyak terjadi pada sistem biologis seperti interaksi antigen
dengan antibodi atau enzim dengan substrat. Proses pemisahan dengan kromatografi
afinitas semakin disukai karena spesifitas biologisnya yang tinggi dan terhindarnya
komponen yang ingin dimurnikan dari kontaminasi mikroorganisme jika komponen
tersebut merupakan produk farmasi.
Sesuai dengan namanya, kromatografi afinitas menggunakan prinsip afinitas untuk
memurnikan atau memisahkan berbagai macam komponen. Afinitas merupakan gaya tarik
antar dua komponen atau zat yang besarannya sangat spesifik untuk tiap komponen. Gaya
tarik inilah yang akan membuat dua komponen berkombinasi satu sama lain. Interaksi
antara kedua komponen tesebut tidaklah terjadi karena sifat-sifat umum seperti titik
isoelektrik, hidrofobisitas, atau ukuran. Interaksi terjadi karena adanya spesifitas biologis
seperti bentuk atau konformasi yang dapat ‘mengenali’ komponen lain lalu berikatan
karena memiliki bentuk yang sesuai. Persitiwa ini terjadi pada interaksi enzim dengan
substrat atau antibodi dan antigen yang merupakan substansi biologis. Interaksi ini bersifat
sangat spesifik sehingga sangat bisa diandalkan untuk memurnikan produk dengan kualitas
tinggi.

II.6 Jenis Hydrophobic Interraction Chromotography

Kromatografi interaksi hidrofilik (atau kromatografi cair interaksi hidrofilik, HILIC)

adalah varian dari kromatografi cair fase normal yang sebagian tumpang tindih dengan
aplikasi kromatografi lain seperti kromatografi ion dan kromatografi cair fase terbalik.
HILIC menggunakan fase diam hidrofilik dengan tipe fase terbalik eluen.

Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) merupakan metode pilihan untuk

analisis senyawa polar yang saat ini banyak digunakan. HILIC pertama kali diperkenalkan
pada tahun 1990 oleh Alpert, menggunakan fase gerak campuran pelarut organik
khususnya asetonitril. Secara prinsip model pemisahan dilakukan seperti pada
kromatografi fase normal (Normal Phase) yaitu dengan kolom fase diam polar sedangkan
fase gerak berupa campuran pelarut organik (asetonitril 60-95%) dan pelarut protik yang
umumnya adalah air karena mempunyai sifat eluasi yang kuat dan garam mudah menguap
seperti ammonium asetat atau amonium format. Beberapa penelitian menyatakan bahwa
HILIC merupakan teknik pemisahan yang efektif untuk senyawa polar seperti protein,
peptida, nukleotida dan sediaan farmasi. Secara prinsip mekanisme kerja HILIC adalah
mekanisme partisi dari analit diantara lapisan air pada fase diam dan fase gerak. Ketebalan
lapisan air berbeda- beda tergantung pada tipe kolom. Untuk analit yang mengalami
mekanisme partisi, ketebalan lapisan air memegang peranan penting. Selain mekanisme
partisi, interaksi ion-exchange, ikatan hidrogen, ikatan dipol- dipol dan interaksi hidrofobik
juga terjadi pada HILIC. Gaya elektrostatik analit pada fase diam juga memegang peranan
penting. Kompleknya mekanisme retensi dan tersedianya bermacam-macam kolom HILIC
mengindikasikan bahwa pengembangan dan optimasi metode tersebut sangat diperlukan,
karena adanya perbedaan hidrofobilitas kolom, interaksi ion dan perbedaan struktur kimia
analit.
 BAB III

PENUTUP

III.1 Kesimpulan

Metode kromatografi adalah salah satu teknik pemurnian yang banyak dilakukan dalam
proses analisa kimia dan produksi karena sifatnya yang selektif. Pada proses produksi
biasanya kromatografi digunakan untuk proses pemurnian. Pemurnian secara kromatografi
dilakukan dengan cara memanfaatkan perbedaan sifat fisika-kimia umum dari bentuk
molekul atau ion, ukuran partikel, kelarutan dan lain-lain. Kromatografi adalah proses
pemisahan zat terlarut berdasarkan perbedaan migrasi suatu sistem yang terdiri dari fasa
diam dan fasa gerak. Salah satu fase gerak yang sering dipakai adalah molekul yang
memiliki perbedaan mobilitas sehingga terjadi perbedaan dalam adsorpsi, partisi,
kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul, atau kerapatan muatan ion. Perbedaan cara kerja
kromatografi itu memberikan variasi teknik seperti kromatografi penukar ion (ion
exchange chromatography), kromatografi eksklusi ukuran (size exclusion
chromatography), kromatografi fasa normal (phase normal chromatography), kromatografi
fasa terbalik (reverse phase chromatography), kromatografi afinitas (affinity
chromatography).

III.2 Saran

Sebaiknya para pembaca menerapkan jenis-jenis kromatografi pada penelitiannya dengan

baik dan benar agar mendapatlkan hasil penelitian yang memuaskan.
 DAFTAR PUSTAKA

Etik, W. Dkk. (2020). Optimasi Metode KCKT-ELSD dengan Pemisahan HILIC untuk
Penetapan Kadar Glukosamin Hidroklorida pada Suplemen Kesehatan. Jurnal Farmasi
Dan Ilmu Kefarmasian Indonesia Vol. 7 (2).

Hubert, C., et al. (2010). Development & Validation of a Sensitive Solid Phase Extraction/HILIC/
MS Method for the Accurate of Glucosamine in Dog Plasma. Journal of Chromatography
A; 1217; 3275- 3281.

Ikegami, T., et al. (2008). Separation Efficiencies in Hydrophilic Interaction Chromatography.

Journal of Chromatography A; 1184; 474–503.

Laksmi, N. C., et al. (2012). a Novel LC-ELSD Method for the Quantification of 2-Deoxy D-
glucose Using HILIC Chromatoghraphy. Schoolar Research Library : 591-598.

Leba, M. A. (2017). Buku Ajar Ekstraksi dan Real Kromatografi. Yogyakarta : CV.Budi Utama.

Lehninger, A. L. (1982). Dasar-dasar Biokimia Jlilid 1. Jakarta : Erlangga

Megantara, S., et al. (2016). Prediction of Log P and Spectrum Quersetin, Glucosamine and
Andrographolide and Its Corellation with Laboratory Analysis. International Journal of
Pharmacy and Pharmaceutical Science : 33-37.

Natasha, A. I. (2015). Kromatografi Afinitas. Bandung : Institut Teknologi Bandung.

Putra, E. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dalam Bidang Farmasi. Jurusan Farmasi
Fakultas dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara.

Sandy, L. (1987). High Performance Liquid Chromatography Analytical Chemistry by Open

Learning. London : John Willey and Sons Inc. Hal : 130-132.