BAB IV

METODE PENELITIAN
4.1 Lokasi Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Sintesis, Laboratorium Formulasi

Sediaan Farmasi, Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Kimia Terpdu
Universitas Muhammadiyah Malang.

4.2 Alat Penelitian

4.2.1. Pembuatan Serbuk Simplisia

1. Mesin penggiling (Blender)

2. Pengayak mesh 20 dan 40
3. Timbangan analitik balance Scout Pro 400 g
4. Oven BINDER

4.2.2. Proses Ekstraksi

1. Timbangan analitik balance Scout Pro 400 g

2. Gelas ukur
3. Desikator
4. Cawan Porselen
5. Penyaring Buchner 100 mm
6. Oven BINDER
7. Pipet tetes
8. Batang pengaduk
9. Stopwatch
10. Sudip besi
11. Erlenmeyer
12. Beaker glass
13. Rotary evaporator vacuum Buchi R-215
14. Mesin pengaduk
4.2.3. Pengujjian Difusi Cakram
1. Inkubator
 2. Autoklaf
3. Micro pipet
4. Laminar Air Flow
5. Tabung reaksi
6. Hot plate
7. Bunsen
8. Pipet volume
9. Kertas saring
10. Erlenmeyer
11. Penjepit
12. Cawan petri
13. Kawat ose
4.2.4. Identifikasi Senyawa dengan KLT
1. Cawan porselen
2. Chamber
3. Lempeng KLT
4. Hot plate
5. Vortex
6. Penampak noda
7. Pinset
8. Pipa kapiler 5µl
9. Sinar UV
10. Timbangan analitik balance Scout Pro 400 g
4.3. Bahan Penelitian

4.3.1. Bahan Uji

Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging buah
Limonia acidissima L. yang didapatkan dari daerah Kecamatan Rasanae Barat,
Kota Bima, NTB dan telah diidentifikasi oleh UPT. Balai Materia Medika, Dinas
Kesehatan, Jawa Timur.
Mikroba uji adalah Propionibacterium acnes yang diperoleh dari
Laboratorium Mikrobiologi dan Parasitologi Universitas Muhammadiyah
Malang.
4.3.2. Proses Ekstraksi
1. Pelarut n-heksan teknis
2. Daging buah Limonia acidissima
4.3.3. Pengujian Difusi Cakram
1. Fraksi n-heksan daging buah Limonia acidissima L.
2. Sabouraud Dextrose Agar (SDA)
3. Aqudest steril
4. Nistatin
5. Bakteri Propionibacterium acnes
6. DMSO
4.3.4. Identifikasi Senyawa dengan KLT
1. N-Heksana teknis
2. Etil asetat teknis
3. Asam sulfat 10%
4. Larutan KOH 10%
5. FeCl3 1%
6. Reagen Dragendorff
7. Reagen anisaldehida-asam sulfat
4.4. Variabel Penelitian

4.4.1. Variabel Bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah komponen senyawa kimia

pada fraksi n-heksan daging buah Limonia acidissima dengan konsentrasi tertentu.
4.4.2. Variabel Terikat

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah diameter zona hambat

yang dihasilkan oleh senyawa uji. Senyawa uji pada penelitian ini adalah
senyawa yang terdapat pada fraksi n-heksan Limonia acidissima yang dapat
menghambat pertumbuhan Propionibacterium acnes yang ditandai dengan
adanya daerah bening disekitar senyawa uji yang ada pada media agar sebagai
parameter untuk menentukan diameter zona hambat (mm) senyawa dari fraksi n-
heksan.
4.5 Definisi Operasional
1) Senyawa uji pada penelitian ini adalah senyawa yang terdapat pada fraksi
etanol buah Limonia acidissima L. yang dipisahkan dengan teknik
pewarnaan.

2) Diagonal zona hambat adalah zona bening yang dihasilkan oleh aktivitas
senyawa uji fraksi etanol buah Limonia acidissima L., dimana besarnya
diagonal zona bening tersebut menandakan daya hambat dari aktivitas
senyawa uji fraksi etanol buah Limonia acidissima L.

4.5. Penyiapan Sterilisasi Alat dan Bahan

Semua alat yang digunakan terlebih dahulu disterilkan melalui proses

sterilisasi, yaitu dengan cara sterilisasi kering dan sterilisasi basah. Alat dan bahan
yang akan disterilkan antara lain yaitu, cawan petri, erlenmeyer, penjepit,
spatula, Soud Dextrose Agar (SDA),dan alat serta bahan lain yang akan
digunakan pada sterilisasi di autoklaf.

4.5.1. Sterilisasi Kering

Sterilisasi kering meliputi cara sterilisasi dengan api langsung dan cara
sterilisasi dengan oven pemanas.

1. Sterilisasi dengan api langsung

Sterilisasi ini dilakukan terhadap peralatan seperti jarum ose, pinset,
spatel, mulut tabung dan batang pengaduk.
2. Sterilisasi dengan oven pemanas
Oven pemanas digunakan untuk sterilisasi peralatan gelas yang tidak
berskala, seperti cawan petri, tabung reaksi dan pipet. Alat-alat yang
disterilkan dimasukkan ke dalam oven setelah mencapai suhu 160°C
selama 1-2 jam.

4.5.2. Sterilisasi Basah

 Sterilisasi basah dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Peralatan yang
disterilkan dengan sterilisasi basah diantaranya gelas ukur, Erlenmeyer, dan pipet
tetes. Proses sterilisasi ini dilakukan pada suhu 121°C selama 15 – 20 menit.

4.6. Metode Penelitian

4.6.1. Rancangan Penelitian

Penelitian ini bersifat eksperimental yang bertujuan untuk mendapatkan

data diameter zona hambat senyawa dalam fraksi n-heksan daging buah Limonia
acidissima L. terhadap pertumbuhan bakteri Propionibacterium acnes serta
mengetahui golongan senyawa yang terdapat pada ekstrak n-heksan daging buah
Limonia acidissima L. secara in vitro dengan metode difusi cakram.

Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan dua perlakuan yakni kelompok

uji yaitu ekstrak n-heksan dan kelompok kontrol yaitu nistatin. Penelitian ini
melalui beberapa tahapan, yaitu:

1. Persiapan simplisia
2. Penarikan komponen senyawa/Ekstraksi
3. Pemisahan komponen senyawa dengan metode KLT
4. Pengujian antibakteri dengan metode difusi cakram

4.6.2. Kerangka Operasional

4.8 Prosedur Kerja

4.8.1 Proses Ekstraksi Bahan Uji dengan Pelarut N-heksan
Pada proses ekstraksi yang akan dilakukan pada penelitian ini adalah dengan
metode maserasi bertingkat dengan menggunakan 3 macam pelarut yaitu pelarut
n-heksan, etil asetat dan etanol. Dalam pembuatan ekstraknya digunakan serbuk
daging buah Limonia acidissima sebanyak 1300 g yang diekstraksi dengan pelarut
n-heksan dengan menggunakan metode maserasi kinetik selama 4 jam sebagai
berikut :
1) Masukkan 1300 g serbuk hasil daging buah ke dalam bejana bermulut
besar.
 2) Ekstrak daging buah Limonia acidissima ditambahkan dengan 13.000 ml
(perbandingan 1:10) n-heksan direndam selama 24 jam dan disaring
dengan corong Buchner dan tampung filtratnya. (filtrat 1 dan residu 1)
3) Residu 1 dimaserasi kembali dengan n-heksan sebanyak 6.500 ml
(perbandingan 1:5) direndam selama 24 jam, saring dan tampung
filtratnya. (filtrat 2 dan residu 2)
4) Residu 2 dimaserasi kembali dengan n-heksan sebanyak 6.500 ml
(perbandingan 1:5) direndam selama 24 jam, saring dan tampung
filtratnya. (filtrat 3 dan residu 3)
5) Proses maserasi ini dilakukan dengan metode yang sama secara berulang
sampai pada filtrat tidak lagi menunjukkan adanya komponen yang tertarik
dengan pelarut n-heksan (maserasi dilakukan hingga semua senyawa yang
terdapat pada daging buah Limonia acidissima tertarik oleh pelarut n-
heksan). Hal ini ditandai saat dilakukan tes pada plat KLT dengan
penotolan sebanyak 5 µl pada masing-masing filtrat hingga untuk melihat
kepekatan dari filtrat hingga tidak terdapat noda yang terbentuk.
6) Filtrat dikumpulkan lalu dipekatkan dengan rotary evaporator vacuum
pada suhu 50ºC sampai diperoleh larutan ekstrak kental.
7) Kemudian pindahkan ekstrak kental ke cawan porselen. Ekstrak kental
dikeeringkan di oven pada suhu 40ºC sampai bobot constant. Ekstrak
disimpan dilemari pendingin.
4.8.2 Identifikasi Senyawa dengan KLT
Ekstrak n-heksan daging buah Limonia adicissima ditimbang sebanyak 50
mg, dilarutkan dalam 1 ml n-heksan pada wadah tertutup rapat. Totolkan
sebanyak satu kapiler (5µl) pada lempeng KLT, kemudian dieluasi dengan
berbagai macam fase gerak. Pemillihan eluen n-heksan dan etil asetat memilik
alasan bahwa kedua eluen tersebut cenderung stabil dan memiliki viskositas yang
rendah, selain itu kombinasi eluen tersebut memberikan selektifitas yang memadai
untuk campuran bahan yang akan dipisahkan khususnya pada penelitian ini
bersifat semipolar. Eluen dipilih pada konsentrasi yang sesuai dengan sampel
yang dipisahkan agar kromatografi dapat berjalan dengan baik.pemilihan
kombinasi eluen ditujukan agar tidak memberikan hasil yang bervariasi.
 1. Fase diam : silica gel TLC 60 F254 31 2.
2. Optimasi fase gerak
1) N-heksan : Etil asetat = 8:2
2) N-heksan : Etil asetat = 7:3
3) N-heksan : Etil asetat = 6:4
4) N-heksan : Etil asetat = 5:5
5) N-heksan : Etil asetat : Asam formiat = 8:2:1
6) N-heksan : Etil asetat : Asam formiat = 8:2:2
7) N-heksan : Etil asetat : Asam formiat = 8:2:3
4.8.3 Identifikasi Kompenen Senyawa
Kompenen senyawa yang sudah dipisahkan dengan metode KLT
dilakukan identifikasi senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada ekstrak n-
heksan daging buah Limonia acidissima dengan penampak noda sebagai berikut :
a. Alkaloid : dragendorff (noda berwarna jingga)
b. Flavonoid : Asam sulfat 10 % (noda berwarna kuning intensif)
c. Terpenoid/steroid : Anisaldehida asam sulfat dengan pemanasan (noda
berwarna ungu atau merah ungu)
d. Polifenol dan tanin : Pereaksi FeCl3 (noda bewarna hitam)
e. Antrakinon : Larutan KOH 10% dalam methanol (noda bewarna
kuning, kuning coklat) (Harbone,1987)
f. Saponin : ekstrak 0,3 gram ditambahkan 10 ml air suling, dikocok
kuat selama 30 detik, dengan adanya buih (stabil selama 30 menit
setinggi 3 cm) menandakan hasil uji positif saponin.
4.8.4 Pembuatan Konsentrasi Larutan Uji
Pembuatan konsenntrasi larutan uji dibuat dengan cara sebagai berikut :
1) Timbang fraksi n-heksan daging buah Limonia acidissima
sebanyak 100 mg larutkan dalam 0,1 ml DMSO, ditambahkan
aquadest steril sampai 1.0 ml. Sehingga diperoleh larutan uji 100
mg/ml.
2) Timbang fraksi n-heksan akar Jatropha gossypifolia L sebanyak 50
mg larutkan dalam 0.1 ml DMSO, ditambahkan aquadest steril
sampai 1.0 ml. Sehingga diperoleh larutan uji 50 mg/ml.
 3) Timbang fraksi n-heksan akar Jatropha gossypifolia L sebanyak 25
mg larutkan dalam 0.1 ml DMSO, ditambahkan aquadest steril
sampai 1.0 ml. Sehingga diperoleh larutan uji 25 mg/ml.
4.8.5 Preparasi Media
Dalam penelitian ini digunakan media Nutrien Agar (NA). Pembuatan
media Nutrient Agar Plate dengan cara menimbang agar nutrien sebanyak 28
gram, lalu masukkan dalam gelas ukur. Tambahkan aquades sebanyak 1 liter.
Untuk mempercepat pelarutan, gelas ukur tersebut diletakkan di atas pengaduk
magnet. Larutan yang sudah larut dituang ke labu erlenmeyer, kemudian mulut
erlenmeyer disumbat dengan kapas yang selanjutnya ditutup dengan alumunium
foil, kemudian disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit.
Larutan agar nutrient yang telah disterilisasi dituangkan ke dalam cawan petri
hingga membeku pada suhu kamar.
4.8.6 Preparasi Bakteri
Pada proses peremajaan, bakteri Propionibacterium acnes yang berasal
dari biakan murni diambil satu ose steril kemudian ditanamkan pada cawan petri
yang berisi media Nutrient Agar sebanyak 20 ml. Kemudian diinkubasi selama 24
jam dengan suhu 37º C. Bakteri yang diambil dari hasil peremajaan bakteri
menggunakan jarum ose steril, dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9
ml aquadest steril. Kemudian divortex agar suspense bakteri Propionibacterium
acne homogen. Untuk melihat kekeruhan bakteri dapat dibandingkan dengan
standart McFarland. MC Farland adalah penyetaraan konsentrasi mikroba dengan
menggunakan larutan BaCl2 1% dan H2SO4 1%. Standart kekeruhan McFarland
dimaksudkan untuk menggantikan perhitungan mikroba satu per satu dan untuk
memperkirakan kepadatan sel yang akan digunakan pada prosedur pengujian
antimikroba (Haris dkk, 2013). Apabila kekeruhan masih belum sama, dapat
ditambahkan aquadest steril atau bakteri Propionibacterium acne lagi, hingga
didapatkan kekeruhan yang sama. Dari kekeruhan yang sama dengan standart
McFarland tersebut, maka didapatkan suspensi bakteri dengan tingkat kekeruhan
108 cfu/ml (colony forming unit/ mililiter) dan sesuai dengan standart McFarland.
Kemudian disiapkan dua tabung reaksi kosong diisi 9 ml aquadest steril (tabung 2
dan tabung 3). Selanjutnya dipipet 1 ml pada tabung 1 dan masukkan pada tabung
2 kemudian di vortex hingga homogen. Hasil dari tabung 2 tersebut didapatkan
tingkat kekeruhan bakteri 107 cfu/ml. Kemudian dari tabung 2 dipipet 1 ml dan
dimasukkan dalam tabung 3 lalu di vortex hingga homogen. Hasil dari tabung 3 di
dapat tingkat kekeruhan bakteri 106 cfu/ml.
Tabel IV.1 Standar Kekeruhan McFarland (Sutton,2011)
Skala McFarland CFU (x108 ml) 1% BaCl2/ 1% H2SO4 (ml)
0,5 < 300 0,05/9,95
1 300 0,1/9,9
2 600 0,2/9,8
3 900 0,3/9,7
4 1200 0,4/9,6
5 1500 0,5/9,5
6 1800 0,6/9,4
7 2100 0,7/9,3
8 2400 0,8/9,2
9 2700 0,9/9,1
10 3000 1,0/9,0

Kemudian diambil dengan cotton bud steril yang telah ditiriskan terlebih
dahulu pada dinding tabung, kemudian ditanam pada media agar dengan metode
streak plate (metode cawan gores) dengan cara digoresan secara kontinyu sampai
setengah permukaan agar, membentuk garis horisontal disatu cawan petri.
Kemudian putar cawan 180º dan lanjutkan goresan sampai habis. Dilanjutkan
goresan dari arah yang berlawanan dengan cara yang sama, dan diakhiri dengan
memutar cotton bud pada tepi cawan membentuk arah 180º. Goresan yang
bersinambung bertujuan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru. Setelah
itu, media dibiarkan selama 15 menit agar bakteri dapat berdifusi ke media.
4.8.7 Pembuatan Standart Mcfarland
Larutan H2SO4 0,36 N dicampurkan dengan BaCl2.2H2O 1,175% dalam
sebuah tabung. Tabung dikocok sampai terbentuk larutan keruh. Kekeruhan ini
dipakai sebadai standard kekeruhan bakteri.
4.8.8 Pengujian Difusi Cakram
 Proses pengujian antibakteri untuk metode difusi cakram, antara lain
sebagai berikut:
1. Disiapkan vial yang telah berisi larutan uji dengan konsentrasi 100 mg/ml,
50 mg/ml dan 25 mg/ml.
2. Disiapkan preparasi bakteri dalam media cair dengan volume total kurang
dari 100 ml.
3. Bakteri yang telah dipreparasi diambil dengan cara mencelupkan kapas lidi
steril satu kali, lalu diletakkan pada tepi tabung reaksi, kemudian kapas
lidi steril tersebut diputar agar bakteri yang akan dioleskan tidak terlalu
banyak. Setelah itu dioleskan pada Nutrien Agar dan diratakan.
4. Media Nutrien Agar yang telah dioleskan bakteri Escherichia coli
dibiarkan dahulu lima menit supaya mengering. Disk kertas saring dengan
berdiameter 6 mm sebanyak 3 buah yang telah ditetesi sampel uji dan
kontrol positif (kloramfeikol) 1 buah berbentuk disk, kemudian diletakkan
pada media pembenihan dengan jarak tiap cakram 3 cm dan dari tepi
lempeng sebesar 2 cm. Disk kertas saring ditekan lembut dengan
menggunakan pinset pada permukaan lempengan sehingga terdapat kontak
yang baik antara disk lempengan agar. Jarak diatur sedemikian rupa
sehingga satu disk dengan disk yang lainnya berjauhan.
5. Selanjutnya semua media Nutrien Agar diinkubasi pada suhu 37ºC selama
24 jam.
6. Pengujian senyawa antibakteri dilakukan dengan pengamatan yang
dilakukan setiap 24 jam dengan melihat adanya zona (area) jernih disekitar
Disk kertas saring. Zona (area) hambatan yang terbentuk diukur dengan
penggaris dalam satuan millimeter (mm).
7. Dilakukan replikasi sebanyak tiga kali.