Maria Fransisca Sumual

6. ANALISIS KADAR PROTEIN

Pengantar

 Protein: Polimer asam amino

 Jumlah dan jenis asam amino
 Protein penting sebagai:

 Sumber asam amino esensial (lysin, tryptophan,

metionin, leusin, isoleusin dan valin)
 Struktur utama komponen makanan -- tekstur
 Sumber energ
 Isolat protein  sifat fungsional pada makanan
(tekstur, stabilitas emulsi dll) digunakan dalam
pembentukan gel, emulsifier, pembentukan busa
dan pengental
 Protein sebagai enzim  menyebabkan reaksi
yang diinginkan maupun yg tidak diinginkan

Food analyst tertarik untuk mengetahui konsentrasi

total, jenis, struktur molekul dan sifat fungsional
protein dalam makanan
METODE KJELDAHL

 Dikembangkan oleh Johann Kjeldahl pada tahun

1883
 Prinsip: makanan yang dihancurkan dengan asam
kuat akan menghasilkan Nitrogen  titrasi
 Kadar protein dihitung dari konsentrasi nitrogen
dalam makanan
 Faktor konversi 6.25 (setara dgn 0.16 g nitrogen per
gram protein)
 Faktor konversi berbeda untuk protein yang berbeda
komposisi as. Amino
 3 tahap utama: destruksi, distilasi, titrasi (DDT)
Prinsip analisis:
1. Destruksi
 Sampel ditimbang dalam tabung destruksi
 Asam sulfat pekat sebagai agen pengoksidasi
 Natrium sulfat (anhydrous) untuk
meningkatkan titik didih  percepat reaksi
 Cu, Se, Titanium, atau Hg sebagai katalis 
percepat reaksi
 Nitrogen diubah menjadi gas amonia
 Bahan organik lain diubah menjadi CO2 dan
H2O
 Gas amonia tinggal dalam larutan asam dlm
bentuk ion amonium (NH4+) yang terikat pada
ion sulfat (SO42-)
N(makanan)  (NH4)2SO4 (1)
Prinsip analisis:
2. Distilasi
 Hasil destruksi dinetralkan dengan
menambahkan NaOH (basa)
 Amonium sulfat  gas amonia
(NH4)2SO4 + 2 NaOH 2NH3 + 2H2O + Na2SO4 (2)
 Gas amonia ditangkap oleh larutan asam borat
(konsentrasi berlebih, pH rendah)  ion
amonium dan ion borat
NH3 + H3BO3  NH4+ + H2BO3- (3)
gas amonia + as. Borat  ion amonium + ion borat
Prinsip analisis: 3. Titrasi

 Titrasi amonium borat dengan standard as.

Sulfat atau as. Hidroklorat (H2SO4 atau HCl)
dengan indikator untuk menentukan titik
akhir reaksi
H2BO3- + H+  H3BO3 (4)
 Konsentrasi ion H (mol) yg dibutuhkan untuk
mencapai titik akhir reaksi = konsentrasi N yg
terdapat dalam sampel (persamaan 3)
Perhitungan: m mg sampel
dititrasi dgn x N HCl
% N = (A – B) x N HCl x 14,007 x 100
m mg sampel
Ket. :
A = vol (ml) HCL sampel
B = vol (ml)HCl blanko

% Protein = % N x faktor konversi

 Sample kosong (blanko) dikerjakan bersama
untuk mengeliminasi residu N yg mungkin
terdapat dalam reagen
 Kadar protein dihitung sbb:
%Protein = F x %N
Keuntungan dan Kerugian

 Keuntungan.
 Metode Kjeldahl merupakan metode standar dengan
tingkat ketepatan tinggi dan dapat diulang  sebagai
metode utama untuk estimasi protein dalam
makanan.
 Kerugian.
 Tidak mengukur protein yg sebenarnya (hanya
mengukur N yg tidak semuanya berasal dari protein)
 butuh faktor konversi berbeda untuk protein
berbeda.
 As. Sulfat pekat pada suhu tinggi dan katalis sangat
berbahaya.
 Teknik analisis membutuhkan waktu panjang
METODE DUMAS

 Sampel dipanaskan pada suhu 900 oC dalam

keadaan beroksigen  CO2, H2O and N2.
 CO2 dan H2O (gas) ditangkap oleh kolom khusus
 Kadar nitrogen diukur dgn menggunakan kolom
dengan detektor konduksi panas pada ujungnya
(Kolom memisahkan N dari CO2 dan H2).
 Perlu dikalibrasi menggunakan bahan dengan
konsentrasi N yg diketahui , contoh EDTA (=
9.59%N).
 Faktor konversi digunakan seperti pada metode
Kjeldahl.
Keuntungan dan Kerugian

 Keuntungan:
 Lebih cepat daripada metode Kjeldahl (< 4 menit : 1 – 2
jam).
 Tidak menggunakan bahan kimia atau katalis berbahaya.
 Banyak sampel dapat dianalisis secara otomatis.
 Mudah dilakukan
 Kerugian:
 Biaya awal tinggi
 Tidak mengukur protein sebenarnya
 Membutuhkan faktor konversi yg berbeda
 Sampel yg digunakan terlalu sedikit  tidak representatif.
Metode UV-visible spectroscopy

 Perlu kurva standar untuk kalibrasi absorbansi

(atau turbiditas) vs konsentrasi protein
menggunakan larutan protein pada konsentrasi
seri yang berbeda, diukur pada panjang
gelombang yg sama.
 Konsentrasi protein ditentukan menggunakan
kurva standar
 Perbedaan disebabkan oleh gugus kimia yg
menyebabkan absorpsi atau pembiasan radiasi
(ikatan peptida, gugus samping aromatik, gugus
dasar, dan agregat protein).
Pengukuran langsung
λ = 280 nm
 Kadar triptofan dan tirosin berbagai jenis
protein konstan
 Keuntungan: sederhana, non destruktif, tidak
butuh reagen khusus
 Kerugian: asam nukleat juga terukur pada
panjang gelombang yang sama
 Modifikasi: menggunakan 2 panjang
gelombang berbeda sebagai koreksi
Metode Biuret

 Prinsip: Warna ungu terbentuk jika ion Cupri (Cu2+)

berinterkasi dengan ikatan peptida dalam kondisi
basa
 Reagen Biuret dicampur dengan larutan protein,
didiamkan selama 15-30 menit, kemudian
absorbansi dibaca pada λ = 540 nm.
 Keuntungan:
 tidak ada gangguan dari bahan lain yg terabsorbsi pada
panjang gelombang lebih rendah
 Absorbsi karena reaksi pada ikatan peptida  tidak perlu
faktor konversi
• Kerugian: Sensitivitas rendah dibandingkan
metode UV-visible yang lain.
Metode Lowry

 Menggunakan reagen Biuret dan reagen Folin-

Ciocalteau phenol yg bereaksi dengan tyrosin
dan tryptophan pada protein.
 Menghasilkan warna kebiruan
 Dibaca antara λ= 500 - 750 nm  500 nm utk
menentukan konsentrasi protein yg tinggi (peak
kecil); 750 nm utk menentukan konsentrasi
protein rendah (peak tinggi).
 Lebih sensitif pada makanan dengan
konsentrasi protein rendah (dibandingkan met.
Biuret)
Metode Pengecatan (Dye binding)

 Pewarna anionik (bermuatan negatif)

dicampurkan pada larutan protein yg bermuatan
positif (<titik isoelektrik)
 Terbentuk endapan berwarna karena adanya
daya elektrostatik antara molekul
 Pewarna yang tidak diikat tetap dalam larutan
 Pewarna anionik diikat pada gugus kation residu
asam amino basa (histidin, arginin dan lisin) dan
pada gugus amino terminal yg bebas
 Jumlah pewarna yg sisa setelah sentrifugasi
ditentukan dengan mengukur absorbansi
 Jumlah protein dalam larutan protein = jumlah
pewarna yang terikat
dyeterikat = dyeawal - dyebebas
Keuntungan dan Kerugian

 Keuntungan:
 Cukup cepat dan mudah dilakukan
 Sensitif terhadap konsentrasi protein yg rendah
 Kerugian:
 Membutuhkan pengenceran
 Membutuhkan preparasi sampel seperti homogenasi,
ekstraksi, sentrifugasi, filtrasi  waktu panjang
 Kadang sulit untuk menghitung jumlah protein yg
diekstraksi dari makanan tertentu (terutama makanan
yang diproses)
 Absorbansi tergantung pada jenis protein yg diuji
karena protein yg berbeda mempunyai sekuens asam
amino yang beda