Kepada Yth : Tutorial Kimia Klinik

Rencana Baca :
Tempat :

TES HbA1c DENGAN

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
Sri Anita, Suci Aprianti, Ruland DN Pakasi
Departemen Ilmu Patologi Klinik FK UH-RSUP dr.Wahidin Sudirohusodo, Makassar

I. PENDAHULUAN
Diabetes melitus (DM) merupakan penyakit metabolik dengan karakteristik
hiperglikemia. Hiperglikemia kronik pada DM menimbulkan komplikasi pada mata, ginjal,
saraf, jantung, otak dan pembuluh darah. Pemantauan status glikemik jangka panjang pasien
DM sangat penting untuk mengontrol kadar glukosa darah dalam kisaran normal dan
mencegah terjadinya komplikasi. Untuk mencapai target pengendalian glukosa darah
diperlukan pemeriksaan laboratorium, tes HbA1c merupakan pemeriksaan yang sangat akurat
dibanding pemeriksaan lain untuk menilai status glikemik jangka panjang.1,2,3
Hemoglobin (Hb) pada manusia terdiri dari HbA (α2β2), HbA2 (α2δ2), dan HbF (α2γ2).
Hemoglobin Adult (HbA) menyusun 90-98 %, dari jumlah hemoglobin total. HbA terdiri dari
HbA1a, HbA1b, dan HbA1c. Penempelan molekul glukosa pada gugus amino terminal valin
NH2 rantai β dari Hb orang dewasa normal, proses ini disebut glikosilasi atau hemoglobin
terglikosilasi atau hemoglobin A1c (gambar 1).3,4,5

Gambar 1. Ikatan hemoglobin dengan glukosa membentuk Glycohemoglobin

(Sumber: www.labkesehatan.com) 6

Proses pembentukan Hemoglobin Adult 1c (HbA1c) berlangsung secara non

enzimatik melalui dua tahap (gambar 2), yaitu: 1,2,7

Tutorial Kimia Klinik/HbA1c dengan HPLC/ 2015 1

 1. Tahap pertama: reaksi glikosilasi Hb berlangsung cepat dan reversible, menghasilkan
produk aldimin yang labil atau schiff base (Labile HbA1c).
2. Tahap kedua: terjadi selama eritrosit bersirkulasi sejumlah HbA1c labil/preHbA1c
mengalami penyusunan ulang secara Amadori dan terkonversi menjadi ketamin stabil
atau dikenal sebagai HbA1c.

Gambar 2. Pembentukan
HbA1c, melalui basa Schiff diikuti reaksi Amadori
(Sumber: www. Dyazyme.com)7
Kadar HbA1c menunjukkan kontrol glukosa jangka panjang yang menggambarkan
kondisi 8-12 minggu sebelumnya, karena waktu paruh eritrosit 120 hari (mencerminkan
keadaan glikemik selama 2-3 bulan), maka tes HbA1c dianjurkan dilakukan setiap 3 bulan
secara berkala terutama pada pasien Diabetes Melitus.1,2,4
HbA1c dapat diperiksa secara imunoasay, elektroforesis dan HPLC (High
Performance Liquid Chromatography). HPLC merupakan metode yang direkomendasikan
oleh IFFC (International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine)
sebagai metode rujukan untuk menilai kadar HbA1c.1,2
Beberapa keuntungan HPLC dibandingkan metode yang lain, adalah :
1. Menggunakan alat automatik dan waktu deteksi yang lebih singkat serta dapat
memproses banyak sampel.
2. Sampel yang dibutuhkan sangat sedikit (5 µl)
3. Memiliki nilai presisi yang tinggi.

Tutorial Kimia Klinik/HbA1c dengan HPLC/ 2015 2

 Kekurangan teknik ini adalah spesifitas yang rendah karena dipengaruhi oleh adanya
Hb varian. Selain itu pula, tidak praktis bila dilakukan untuk jumlah pemeriksaan yang
sedikit, sehingga biasanya alat ini hanya digunakan di laboratorium rujukan. 1,8

II. TUJUAN
Tutorial ini membahas tes HbA1c metode HPLC menggunakan The D-10 DualTM
Hemoglobin A1c. Program dari Bio-Rad. 1,8,9
III.METODE
A. Pra analitik
1. Persiapan pasien 1
Tidak ada persiapan khusus.
2. Persiapan sampel 1
Darah EDTA sebanyak 5 µl, dapat disimpan 1 minggu pada suhu 2-8 0C atau 4 hari
pada suhu 15-300C. Hindari sampel yang ikterik, lisis dan lipemia.
3. Alat dan bahan. 1
3.1. Alat:
a. Alat The D-10 DualTM dari Bio-Rad (Gambar 4).
b. Auto dilutor: secara otomatis menghisap 5 µl darah dan diencerkan dengan 1 ml
larutan pelisis.
c. Analytical cartridge: disimpan pada suhu 15-300C.
d. Sample vials: berisi 100 vial ukukan 1,5 ml.
e. ROM card: disket program
f. Kertas printer termal.
g. Mikropipet 5 µl
h. Air suling
i. Disposable gloves.
j. Dilakukan saat pertama kali instalasi, Ganti/tambahan catridges analitik baru dan
setelah maintenance atau perbaikan.

Tutorial Kimia Klinik/HbA1c dengan HPLC/ 2015 3

 Gambar 4. Kit D-10TMHemoglobin A1c Program
(Sumber: http://www.bio-rad.com)1

III.2. Bahan:
a. Darah EDTA sebanyak 5 µl.
b. Elution buffer 1: Bis-Tris/Phosphate buffer 2000 mL (pH 6,0), mengandung
natrium azide <0.05% sebagai pengawet.
c. Elution buffer 2: Bis-Tris/Phosphate buffer 1000 mL (pH 6,7), mengandung
natrium azide <0.05% sebagai pengawet.
d. Larutan pencuci (Wash/Diluent Solution) berisi 1600 deionized water,
mengandung natrium azide <0.05% sebagai pengawet.
e. Kalibrator: terdiri dari tiga vial Calibrator Level 1, tiga vial Calibrator Level 2,
dan satu vial Calibrator Diluent. Tiap vial dilarutkan dengan 7 ml larutan
pengencer. Campuran ini stabil 10 hari pada suhu 2-80C.
f. Whole Blood Primer: terdiri dari 4 vial hemolisat lyophilized yang mengandung
gentamycin, tobramycin dan EDTA sebagai pengawet. Tiap vial dilarutkan dengan
1 ml air suling.
B. Analitik
1. Prinsip tes 1,8,9,10
HPLC adalah suatu metode dalam memisahkan dan mengukur komponen dalam
suatu bahan campuran berdasarkan perbedaan pola pergerakan. Pada cara ini fase cair
atau fase gerak (buffer) dipompakan melalui kolom fase padat (fase diam). Hemolisat
yang mengandung berbagai jenis Hb yang berbeda akan diabsorbsi pada fase padat yang

Tutorial Kimia Klinik/HbA1c dengan HPLC/ 2015 4

 bermuatan positif. Kekuatan ion yang ditambahkan melalui aliran buffer menyebabkan
fraksi Hb melemah ikatannya dan akhirnya terlepas. Molekul yang memiliki ikatan yang
kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang
berikatan lemah. (Gambar 4).

Gambar 6. Prinsip HPLC

(Sumber: Courtesy of Agilent Technologies, Inc.: www.gmu.edu)10

Sepasang pompa piston telah diprogram untuk mengatur campuran Elution Buffer
1 dan 2 secara gradient untuk melewati cation exchange analytica cartridge bersama-
sama dengan hemolisat. Kekuatan ion campuran buffer meningkat dengan bertambahnya
aliran buffer 2. Perubahan kekuatan ion antara buffer dan cation exchange analytical
cartridge, serta afinitas bahan pemeriksaan terhadap keduanya menyebabkan pemisahan
fraksi hemoglobin yang dapat diidentifikasi dengan pola waktu retensi tertentu untuk tiap
fraksi hemoglobin. Fraksi yang terpisah keluar dari analytical cartridge sesuai waktu dan
diukur oleh detektor pada panjang gelombang 415 nm. Total waktu analisis adalah, 6,5
menit untuk tiap sampel pemeriksaan (Gambar 5) .

Tutorial Kimia Klinik/HbA1c dengan HPLC/ 2015 5

 HPLC Column

Stationary phase

injektor

komputer

Mobile phase
sampel

pompa detektor

waste
Gambar 5. Skema alur pemeriksaan dengan HPLC
(Sumber : Endang, Pemeriksaan HbA1c secara Ion-Exchange HPLC, FK UNS, Surakarta)11

2. Cara Kerja 7,10

a. Periksa larutan buffer 1 dan 2, larutan pencuci, apakah masih terisi cukup. Periksa
penampung buangan agar tidak penuh, sensor berada pada tempatnya dan jangan
menutup terlalu rapat. Perhatikan kestabilan tekanan. Periksa kertas printer masih
cukup atau tidak.
b. Lakukan pencucian alat setiap pertama kali memulai pemeriksaan dan setiap
selesai pemeriksaan pada hari yang sama dengan cara sebagai berikut:
1). Isi 10 ml air suling dalam semprit dan masukkan piston.
2). Buka tempat pencucian berlawanan arah jarum jam.
3). Dorong air dalam semprit perlahan-lahan sampai habis.
4). Putar searah jarum jam lalu lepaskan semprit yang kosong.
c. Campurkan 5 µl darah EDTA dengan 1,5 ml reagen hemolisis ke dalam sampel
vial dengan menggunakan auto dilutor atau cara manual. Tempatkan darah yang
telah diencerkan pada sampel tray.
d. Tekan START. Pilih metode HbA1c.
e. Pipetkan 1 mL Hb primer, kalibrator yang telah dilarutkan maupun hemolisat
pasien dalam sampel vial. Tempatkan pada sampel tray sesuai urutan.

Tutorial Kimia Klinik/HbA1c dengan HPLC/ 2015 6

 f. Alat akan memulai dengan Column Priming. Setelah selesai, alat akan
menyatakan Analysis. Pemeriksaan bahan dapat dimulai. Waktu analisis untuk
tiap bahan pemeriksaan adalah 6,5 menit.
g. Setelah selesai tiap seri pemeriksaan, alat otomatis akan mencuci selama 5 menit.
h. Setelah 65 menit, alat akan kembali pada keadaan Stand By.
C. Pasca analitik
1. Hasil analitik dalam bentuk gelombang kurva,dengan range 3,8-18,5 % .1
2. Interpretasi 1,9
Diagnosis DM menurut (American Diabetes Assosiation) ADA dan (World Health
Organization) WHO, bila HbA1c ≥ 6,5 %. Sedangkan Provan (2010) membagi DM
menjadi kontrol baik, sedang dan buruk.

Kadar HbA1c
Diabetik
Kontrol baik <6,5 %
Kontrol sedang 6,5-8 %
Kontrol buruk >8 %
3. Keterbatasan tes HbA1c yaitu :1,2
o Ketidakmampuan untuk mendeteksi fluktuasi darah dalam waktu singkat.
o Tidak dapat digunakan untuk mengamati kontrol yang cepat karena kadarnya baru
akan turun setelah 4 minggu. Untuk keperluan itu dapat dipakai parameter
glycosylated albumin yang menggambarkan kontrol 1-2 minggu sebelumnya.
4. Faktor yang mempengaruhi hasil HbA1c :1,2
a. Kadar HbA1c yang tinggi dapat dijumpai pada:
 Lifespan eritrosit yang memanjang
 Splenektomi dimana umur eritrosit memanjang
 HbF
b. Kadar HbA1c yang rendah dapat dijumpai pada:
 Lifespan eritrosit yang menurun
 Anemia (hemolitik, defisiensi besi, penyakit ginjal)
 HbC, HbS

Tutorial Kimia Klinik/HbA1c dengan HPLC/ 2015 7

IV. KESIMPULAN
1. HbA1c merupakan komponen HbA yang mengalami glikosilasi dan memberikan
gambaran kadar glikemik seseorang 3 bulan yang lalu, sehingga dapat mengontrol diabetes
seseorang.
2. HPLC merupakan metode yang direkomendasikan IFCC untuk menilai kadar HbA1c.
Prinsipnya adalah memisahkan Hb berdasarkan muatan listrik yang terdapat pada
permukaan molekul Hb rantai globin yang berikatan secara ionik dengan muatan material.
3. Keuntungan HPLC adalah nilai presisi yang tinggi, sedangkan kerugiannya adalah
sfesifitas yang rendah karena dipengaruhi oleh Hb varian.

Tutorial Kimia Klinik/HbA1c dengan HPLC/ 2015 8

 Normal

Tutorial Kimia Klinik/HbA1c dengan HPLC/ 2015 9

 Diabetik Dengan Peningkatan HbA1c

Tutorial Kimia Klinik/HbA1c dengan HPLC/ 2015 10

 DAFTAR PUSTAKA

1. Anonymou.s, Manual Kit D-10TMHemoglobin A1c Program Instruction Manual, United

States, Bio Rad Laboratories Inc, 2010, available at: http://www.bio.rad.com.
2. Suhadi B.F.X., Glikohemoglobin dalam Program Pustaka Prodia, Seri Diabetes 01, 1984:1-
16.
3. Gustaviani R., Diagnosis dan Klasifikasi Diabetes Melitus, dalam Buku Ajar Ilmu Penyakit
Dalam, Edisi keempat, Jilid III, Jakarta, 2006: 1857-59.
4. Cox M.E, Edelman D., Test for Screening and Diagnosis of Type 2 Diabetes in Clinical
Diabetes, Volume 27, Number 4, 2009:132-8
5. WHO 2011. Use of Glycated Haemoglobin (HbA1c) in the Diagnosis of Diabetes Mellitus.
Avalaible from : http://www.WHO.2011.com. Geneva, 2011.
6. Anonymous. Available at: http:// www.labkesehatan.com.
7. How many HbA1c testing methods are available to Clinical Laboratory 2007, Available
from: http//www.Dyazyme.com. Accessed on Januari 25th2012.
8. Harahap AR., Analisis Hemoglobin dengan High Performance Liquid Chromatography:
Peran dalam Diagnosis Hemoglobinopati, Keunggulan dan Keterbatasannya dalam
Pendidikan Berkesinambungan Patologi Klinik, FK UI, Jakarta, 2004: 82-8.
9. Wirawan R., Elektroforesis Hemoglobin dengan High Performance Liquid Chromatography
(HPLC) dalam Pemeriksaan Laboratorium Hematologi, FK UI, Jakarta, 2011: 175-86.
10. Anonymous, HPLC Basics, Available from: www.gmu.edu. Courtesy of Agilent
Technologies, Inc.
11. Endang., Pemeriksaan HbA1c secara Ion-Exchange HPLC, FK UNS, Surakarta, 2012.

Tutorial Kimia Klinik/HbA1c dengan HPLC/ 2015 11