1.

DENATURASI PROTEIN

Denaturasi dapat didefinisikan sebagai perubahan besar dalam struktur alami yang tidak melibatkan
perubahan dalam urutan asam amino. Protein yang terdenaturasi mengalami perubahan struktur kimia fisik dan
biologi (cantaron dan schepartz 1960). Menurut Winarno (2008), denaturasi diartikan suatu proses terpecahnya
ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam, dan terbukanya lipatan atau win molekul. Ada dua macam
denaturasi, yaitu pengembangan rantai peptida dan pemecahan protein menjadi unit yang lebih kecil tanpa
disertai pengembangan molekul ikatan. Ikatan yang dipengaruhi oleh proses denaturasi adalah ikatan hidrogen,
ikatan hidrofobik, ikatan ionik, dan ikatan intramolekuler. Protein hanya terdapat didalam jaringan hewan atau
tanaman, baik dalam sel atau cairan disebut protein alami. Besarnya molekul dapat menyebabkan cepatnya
terpecah yang dapat dikarenakan oleh”reagent” Dan kondisi protein itu sendiri sehingga struktur protein akan
berubah (Meyer, 1960). Selanjutnya diuraikan oleh feney dan hill (1960) bahwa perubahan struktur protein
menyebabkan terjadinya denaturasi protein. Denaturasi protein adalah suatu proses pemecahan protein dimana
dalam hal ini terjadi perubahan kimia fisik dan biologi dari pada protein yang dengan sendirinya dapat
mengubah sifat protein alaminya.

Namun, struktur asli sebagian besar merupakan produk dari protein lingkungan. Keadaan asli secara
termodinamika adalah keadaan paling stabil dengan kemungkinan bebas terendah energi. Setiap perubahan
dalam lingkungannya, seperti pH, kekuatan ionik, suhu, komposisi pelarut, dan sebagainya, akan memaksa
molekul untuk mengasumsikan struktur kesetimbangan baru. Denaturasi adalah fenomena di mana keadaan awal
yang terdefinisi dengan baik protein yang terbentuk di bawah kondisi fisiologis diubah menjadi keadaan akhir
yang tidak jelas di bawah kondisi nonfisiologis menggunakan agen denaturasi. Itu tidak melibatkan perubahan
kimia dalam protein. Dalam keadaan terdenaturasi, karena derajat gerakan rotasi sudut dihedral yang lebih besar
dari rantai polipeptida, protein dapat mengasumsikan beberapa keadaan konformasi yang berbeda hanya sedikit
dalam energi bebas. Hal ini ditunjukkan secara skematis pada Gambar 5.1.

Gambar 5.1.

Beberapa keadaan terdenaturasi memiliki lebih banyak struktur lipatan sisa dari yang lain. Perlu dicatat
bahwa bahkan dalam keadaan terdenaturasi penuh, tipikal protein globular, kecuali gelatin, tidak berperilaku
seperti kumparan acak yang sebenarnya. Hal ini karena fakta bahwa karakter ikatan rangkap parsial dari ikatan
amida dan pembatasan sterik lokal disebabkan oleh rantai samping yang besar tidak memungkinkan kebebasan
rotasi 360◦ untuk tulang punggung polipeptida. Viskositas intrinsik ([η]) dari protein terdenaturasi penuh adalah
fungsi dari jumlah amino residu asam. Seringkali, denaturasi berkonotasi negatif, karena menunjukkan
hilangnya beberapa sifat. Banyak protein biologis aktif kehilangan aktivitasnya pada denaturasi. Secara umum,
protein terdenaturasi sebagian lebih mudah dicerna daripada protein asli. Dalam minuman protein, di mana
kelarutan dan dispersibilitas protein yang tinggi diperlukan, bahkan sebagian Parkin denaturasi protein selama
pemrosesan dapat menyebabkan flokulasi dan pengendapan selama penyimpanan dan dengan demikian dapat
mempengaruhi atribut sensorik produk. Denaturasi termal juga prasyarat untuk gelasi protein makanan yang
diinduksi panas. Jadi, untuk mengembangkan pemrosesan yang tepat strategi, sangat penting untuk memiliki
pemahaman dasar tentang lingkungan dan faktor-faktor lain yang mempengaruhi stabilitas struktural protein
dalam sistem pangan.

2. TERMODINAMIKA DENATURASI

Denaturasi adalah fenomena yang melibatkan transformasi struktur lipatan yang terdefinisi dengan baik, protein
terbentuk dalam kondisi fisiologis ke keadaan tidak terlipat dalam kondisi nonfisiologis. Karena struktur
bukanlah parameter yang mudah diukur, pengukuran langsung dari fraksi protein asli dan terdenaturasi dalam
larutan tidak mungkin. Namun, perubahan konformasi protein selalu mempengaruhi beberapa sifat kimia dan
fisiknya, seperti serapan ultraviolet, fluoresensi, viskositas, koefisien sedimentasi, rotasi optik, dikroisme
melingkar, reaktivitas gugus sulfhidril, dan aktivitas enzim. Dengan demikian, denaturasi protein dapat
dipelajari dengan memantau perubahan sifat fisika dan kimia tersebut. Ketika perubahan sifat fisik atau kimia, y,
dipantau sebagai fungsi denaturant konsentrasi atau suhu, banyak protein globular monomer menunjukkan profil
denaturasi.

ditunjukkan pada Gambar 5.2. yN dan yD masing-masing adalah nilai y untuk keadaan asli dan terdenaturasi
dari protein.

Gambar 5.2.

Untuk sebagian besar protein, ketika konsentrasi denaturan (atau suhu) meningkat, nilai y tetap tidak
berubah pada awalnya, dan di atas titik kritis nilainya berubah secara tiba-tiba dari yN ke yD dalam kisaran
sempit konsentrasi denaturan atau suhu. Untuk sebagian besar protein globular, transisi ini sangat curam,
menunjukkan bahwa denaturasi protein adalah proses kooperatif. Itu adalah setelah molekul protein mulai
terbuka, atau setelah beberapa interaksi dalam protein rusak, seluruh molekul benar-benar terbuka dengan
sedikit peningkatan lebih lanjut dalam konsentrasi denaturan atau suhu.

3. AGEN DENATURASI

Agen Fisik

Suhu dan Denaturasi Panas adalah bahan denaturasi yang paling umum digunakan dalam pengolahan
dan pengawetan makanan. Protein mengalami berbagai tingkat denaturasi selama pemrosesan. Hal ini dapat
mempengaruhi sifat fungsionalnya dalam makanan dan oleh karena itu, penting untuk memahami faktor-faktor
yang mempengaruhi denaturasi protein. Ketika larutan protein dipanaskan secara bertahap di atas suhu kritis, ia
mengalami transisi yang tajam dari keadaan asli ke keadaan terdenaturasi. Suhu pada titik tengah transisi, di
mana rasio konsentrasi keadaan asli dan terdenaturasi adalah 1, dikenal sebagai suhu leleh Tm, atau suhu
denaturasi Td. Mekanisme denaturasi protein yang diinduksi suhu terutama melibatkan efek suhu pada stabilitas
interaksi nonkovalen. Dalam hal ini, ikatan hidrogen dan interaksi elektrostatik, yang bersifat eksotermik, tidak
stabil, dan interaksi hidrofobik, yang endotermik, distabilkan dengan meningkatnya suhu. Kekuatan interaksi
hidrofobik mencapai maksimum pada sekitar 70-80◦C [22]. Selain interaksi nonkovalen, ketergantungan suhu
dari entropi konformasi, T Sconf , juga memainkan peran utama dalam stabilitas protein. Entropi konformasi
rantai meningkat dengan meningkatnya suhu, yang mendukung keadaan tidak terlipat. Stabilitas bersih protein
pada suhu tertentu adalah jumlah total interaksi ini. Namun, analisis yang cermat tentang efek suhu pada
berbagai interaksi dalam protein mengungkapkan hal berikut: dalam protein globular, sebagian besar gugus
bermuatan ada di permukaan molekul protein, yang sepenuhnya terpapar pada media berair dielektrik tinggi.
Karena efek penyaringan dielektrik air, interaksi elektrostatik yang menarik dan menolak antara residu
bermuatan sangat berkurang. Selain itu, pada kekuatan ion fisiologis, penyaringan gugus bermuatan dalam
protein oleh ion lawan lebih lanjut mengurangi interaksi elektrostatik dalam protein. Karena fakta ini, pengaruh
interaksi elektrostatik dalam protein tidak signifikan.

Demikian pula, ikatan hidrogen tidak stabil dalam lingkungan berair, dan karena itu stabilitasnya dalam
protein bergantung pada interaksi hidrofobik yang menciptakan lingkungan dielektrik rendah lokal. Ini
menyiratkan bahwa selama lingkungan nonpolar dipertahankan, ikatan hidrogen dalam protein akan tetap utuh
ketika suhu dinaikkan. Fakta-fakta ini menunjukkan bahwa meskipun interaksi kutub dipengaruhi oleh suhu,
mereka umumnya tidak berkontribusi pada denaturasi protein yang disebabkan oleh panas. Atas dasar
pertimbangan ini, stabilitas keadaan asli protein dapat secara sederhana dianggap sebagai perbedaan energi
bebas bersih yang timbul dari interaksi hidrofobik yang cenderung mendukung keadaan terlipat dan entropi
konformasi rantai yang mendukung keadaan tidak terlipat. Itu adalah, Ketergantungan stabilitas protein pada
suhu pada tekanan konstan dapat dinyatakan sebagai Interaksi hidrofobik diperkuat pada suhu yang lebih tinggi;
oleh karena itu Entropi konformasi meningkat saat protein dibuka; oleh karena itu Saat suhu dinaikkan, interaksi
antara kekuatan yang berlawanan ini mencapai titik di mana GN→D/∂T 0. Suhu di mana ini terjadi menandakan
suhu denaturasi (Td) dari protein. Kontribusi relatif dari gaya utama untuk stabilitas molekul protein sebagai
fungsi suhu digambarkan pada Gambar 5.3.

Gambar 5.3.

Perhatikan bahwa stabilitas ikatan hidrogen dalam protein tidak dipengaruhi secara signifikan oleh suhu.
4. Geser dan Denaturasi

Banyak protein mengalami denaturasi dan mengendap ketika diagitasi dengan kuat. Dalam keadaan ini,
denaturasi terjadi karena penggabungan gelembung udara dan adsorpsi molekul protein ke antarmuka udara-
cair. Karena energi antarmuka udara-cair lebih besar daripada energi fase curah, protein mengalami perubahan
konformasi pada antarmuka. Tingkat perubahan konformasi tergantung pada fleksibilitas protein. Protein yang
sangat fleksibel terdenaturasi lebih mudah pada antarmuka udara-cair daripada protein kaku. Beberapa proses
pengolahan makanan melibatkan tekanan tinggi, geser, dan suhu tinggi, misalnya, ekstrusi, pencampuran
kecepatan tinggi, dan homogenisasi. Ketika bilah yang berputar menghasilkan laju geser yang tinggi, pulsa
subsonik dibuat dan kavitasi juga terjadi pada ujung bilah. Kedua peristiwa ini berkontribusi pada denaturasi
protein. Semakin besar laju geser, semakin besar derajat denaturasi. Kombinasi suhu tinggi dan gaya geser
tinggi menyebabkan ireversibel denaturasi protein.

5. Perantara Kimia

pH dan Denaturasi

Protein lebih stabil terhadap denaturasi pada titik isoelektriknya dibandingkan pada pH lainnya. Pada
pH netral, sebagian besar protein bermuatan negatif dan beberapa bermuatan positif. Karena energi tolakan
elektrostatik bersih kecil dibandingkan dengan interaksi menguntungkan lainnya, sebagian besar protein stabil di
sekitar pH netral. Namun, tolakan elektrostatik intramolekul yang kuat yang disebabkan oleh muatan bersih
yang tinggi pada nilai pH yang ekstrim menghasilkan pembengkakan dan pembukaan molekul protein. Derajat
pembukaan lebih besar pada nilai pH basa ekstrim daripada pada nilai pH asam ekstrim. Perilaku sebelumnya
dikaitkan dengan ionisasi sebagian karboksil, fenolik, dan kelompok sulfhidril yang terkubur yang
menyebabkan terurainya rantai polipeptida saat mereka mencoba untuk mengekspos diri mereka sendiri ke
lingkungan berair. Denaturasi yang diinduksi pH sebagian besar bersifat reversibel.

6. Pelarut Organik dan Denaturasi

Pelarut organik mempengaruhi stabilitas interaksi hidrofobik protein, ikatan hidrogen, dan interaksi
elektrostatik dengan cara yang berbeda. Karena rantai samping nonpolar lebih larut dalam pelarut organik
daripada dalam air, pelarut organik melemahkan interaksi hidrofobik. Di sisi lain, karena stabilitas dan
pembentukan ikatan hidrogen peptida ditingkatkan dalam lingkungan permitivitas rendah, pelarut organik
tertentu sebenarnya dapat memperkuat atau mendorong pembentukan ikatan hidrogen peptida. Misalnya, 2-
kloroetanol menyebabkan peningkatan kandungan α-heliks dalam protein globular. Tindakan pelarut organik
pada interaksi elektrostatik ada dua. Pada konsentrasi rendah, beberapa pelarut organik dapat menstabilkan
beberapa enzim terhadap denaturasi. Namun, pada konsentrasi tinggi, semua pelarut organik menyebabkan
denaturasi protein karena efek pelarutannya pada rantai samping nonpolar.

7. Denaturasi oleh Aditif Berat Molekul Kecil

Beberapa zat terlarut dengan berat molekul kecil, seperti urea, guanidin hidroklorida (GuHCl),
deterjen, gula, dan garam netral mempengaruhi stabilitas protein dalam larutan berair. Sementara urea, GuHCl,
dan deterjen mengacaukan konformasi asli protein, gula cenderung menstabilkan struktur asli. Dalam kasus
garam netral, sementara garam tertentu, seperti sulfat, fosfat, dan garam natrium fluorida, disebut kosmotrop,
menstabilkan struktur protein, garam lain, seperti bromida, iodida, perklorat, dan tiosianat, disebut sebagai
chaotrop, mendestabilisasi struktur protein. Efek stabilisasi atau destabilisasi aditif berat molekul kecil pada protein
diyakini mengikuti mekanisme universal. Hal ini terkait dengan interaksi preferensial mereka dengan fase air
dan permukaan protein. Aditif yang menstabilkan struktur protein mengikat sangat lemah ke permukaan protein
tetapi meningkatkan hidrasi preferensial dari permukaan protein. Aditif tersebut umumnya dikeluarkan dari
wilayah sekitar protein; yaitu, konsentrasi mereka di dekat protein lebih rendah daripada di larutan massal.
Gradien konsentrasi ini mungkin menciptakan gradien tekanan osmotik yang mengelilingi molekul protein,
cukup untuk meningkatkan suhu denaturasi termal protein. Dalam kasus aditif yang mengganggu kestabilan
struktur protein, hal yang sebaliknya tampaknya benar. Artinya, aditif yang menurunkan stabilitas protein lebih
disukai mengikat permukaan protein dan menyebabkan dehidrasi protein. Dalam kasus seperti itu, molekul air
dikeluarkan dari daerah yang mengelilingi protein dan konsentrasi aditif di daerah yang tidak mengandung air
ini lebih tinggi daripada dalam pelarut curah. Interaksi yang menguntungkan dari aditif tersebut dengan
permukaan protein, terutama permukaan nonpolar, mendorong pembukaan protein sehingga permukaan
nonpolar yang terkubur lebih terbuka untuk interaksi yang menguntungkan dengan aditif.

8. Deterjen dan Denaturasi

Deterjen, seperti sodium dodecyl sulfate (SDS), adalah agen denaturasi protein yang kuat. SDS pada
konsentrasi 3-8 mM mendenaturasi sebagian besar protein globular. Mekanismenya melibatkan pengikatan
preferensial deterjen ke molekul protein yang terdenaturasi. Hal ini menyebabkan pergeseran keseimbangan
antara keadaan asli dan terdenaturasi. Tidak seperti urea dan GuHCl, deterjen mengikat kuat pada protein
terdenaturasi dan ini adalah alasan untuk denaturasi lengkap pada konsentrasi deterjen yang relatif rendah 3-8
mM. Karena ikatan yang kuat ini, denaturasi yang diinduksi deterjen tidak dapat diubah. Protein globular yang
didenaturasi oleh SDS tidak ada dalam keadaan koil acak; sebagai gantinya, mereka mengasumsikan bentuk
batang -heliks dalam larutan SDS. Bentuk batang ini dianggap sebagai terdenaturasi.

9. Garam Chaotropic dan Denaturasi

Garam mempengaruhi stabilitas protein dalam dua cara berbeda. Pada konsentrasi rendah, ion
berinteraksi dengan proteinmelalui interaksi elektrostatik nonspesifik. Netralisasi elektrostatik muatan protein
ini biasanya menstabilkan struktur protein. Netralisasi muatan penuh oleh ion terjadi pada atau di bawah
kekuatan ion 0,2 M dan tidak bergantung pada sifat garam. Namun, pada konsentrasi yang lebih tinggi (>1 M),
garam memiliki efek spesifik ion yang mempengaruhi stabilitas struktural protein. Garam seperti Na2SO4 dan
NaF meningkatkan, sedangkan NaSCN dan NaClO4 melemahkannya. Struktur protein lebih dipengaruhi oleh
anion daripada kation. Mekanisme efek garam pada stabilitas struktural protein terkait dengan kemampuan
relatifnya untuk mengikat dan mengubah sifat hidrasi protein. Garam yang menstabilkan protein meningkatkan
hidrasi protein dan mengikat secara lemah, sedangkan garam yang menggoyahkan protein menurunkan hidrasi
protein dan mengikat kuat. Efek ini terutama merupakan konsekuensi dari gangguan energi pada antarmuka
protein-air. Pada tingkat yang lebih mendasar, stabilisasi atau denaturasi protein oleh garam terkait dengan
pengaruhnya terhadap struktur air curah. Garam yang menstabilkan struktur protein juga meningkatkan struktur
ikatan hidrogen air, dan garam yang mengubah sifat protein juga memecah struktur air curah dan
menjadikannya pelarut yang lebih baik untuk molekul apolar.

A. Asam Amino, Peptida, dan Protein

Komposisi asam amino mempengaruhi stabilitas termal protein. Protein dengan residu asam amino
yang lebih hidrofobik, terutama Val, Ile, Leu, dan Phe, cenderung lebih stabil daripada protein yang lebih
hidrofilik. Ada juga korelasi positif yang kuat antara stabilitas termal dan persentase residu asam amino tertentu.
Teorinya bahwa semakin rendah suhu, semakin tinggi stabilitas protein. Hal ini tidak selalu terjadi. Beberapa
protein akan terdenaturasi di bawah suhu. Stabilitas lisozim meningkat dengan penurunan suhu, sedangkan
mioglobin dan lisozim fag T4 mutan menunjukkan stabilitas maksimum masing-masing pada sekitar 30 dan
12,5 °C. Di bawah dan di atas suhu ini, mioglobin dan lisozim fag T4 tidak stabil.

Jika disimpan di bawah 0 ° C, kedua protein ini mengalami denaturasi yang diinduksi dingin. energi
bebas minimum selalu tergantung pada pengaruh relatif suhu terhadap stabilitas dan destabilisasi protein.
Protein yang biasanya distabilkan terutama oleh interaksi hidrofobik cenderung lebih stabil pada suhu
lingkungan dibandingkan pada suhu pendinginan. Ikatan disulfida intramolekul dalam protein cenderung
menstabilkan protein pada suhu rendah dan tinggi karena menentang entropi konformasi rantai protein.
Termostabilitas protein organisme termofilik dan hipertermofilik dapat menahan suhu yang sangat tinggi, juga
disebabkan oleh komposisi asam amino yang unik. Dibandingkan dengan protein dari organisme mesofilik,
protein ini mengandung kadar residu Asn dan Gln yang lebih rendah.
 Implikasinya di sini adalah karena Asn dan Gln sensitif terhadap deaminasi pada suhu tinggi, tingkat
residu yang lebih tinggi dalam protein termofilik sebagian dapat menyebabkan ketidakstabilan. Kandungan Cys,
Met dan Trp, yang mudah teroksidasi pada suhu tinggi, juga rendah protein metastabil.

Secara general, interaksi polar (baik jembatan garam dan ikatan hidrogen fraksional) dalam protein
nonpolar bertanggung jawab atas stabilnya termal protein dalam organisme termofilik dan termofilik.
Lingkungan tersebut difasilitasi oleh kandungan Ile yang tinggi. Ketika ingin meningkatkan stabilitas struktural
protein sekitar 20 kkal/mol jika setiap jembatan garam dalam protein, di mana konstanta dielektrik sekitar 4.
4.444 organisme juga terbukti mengandung jumlah pasangan ion protein yang jauh lebih tinggi dan jumlah
molekul air terkubur yang secara signifikan lebih tinggi yang berpartisipasi dalam jembatan ikatan hidrogen
intersegmental dibandingkan dengan organisme mesofilik. Secara keseluruhan, tampaknya interaksi kutub (baik
jembatan garam dan ikatan hidrogen antarmolekul) dalam protein nonpolar bertanggung jawab atas stabilitas
termal protein organisme termofilik dan termofilik. Panas dan lingkungan seperti itu difasilitasi oleh kandungan
Ile yang tinggi.

Jika keadaan kering, Protein memiliki struktur statis, yaitu fluiditas fragmen polipeptida terbatas. Saat
kadar air meningkat, hidrasi dan penetrasi sebagian air ke dalam rongga permukaan akan menyebabkan protein
membengkak. Keadaan pembengkakan ini, di mana protein dan air berubah dari keadaan amorf menjadi
keadaan seperti spons, mencapai maksimum jika kadar air 0,3-0,4 g air/g protein pada suhu kamar.
Pembengkakan protein meningkatkan fluiditas dan fleksibilitas rantai, dan molekul protein menyajikan struktur
cairan yang lebih dinamis. Jika dipanaskan, struktur fleksibel dinamis ini dapat memberikan lebih banyak air
untuk memasuki jembatan garam dan ikatan hidrogen peptida daripada dalam keadaan kering, menyebabkan
aditif seperti garam dan gula mempengaruhi stabilitas termal protein dalam larutan berair. Gula seperti sukrosa,
laktosa, glukosa dan gliserin dapat menstabilkan protein dan mencegah denaturasi panas

B. Tekanan Hidrostatik dan Denaturasi

Tekanan hidrostatik tinggi biasanya dipelajari sebagai alat pengolahan makanan, misalnya, untuk
inaktivasi mikroba atau gelasi. Karena tekanan hidrostatik yang tinggi secara ireversibel menghancurkan
membran sel dan menyebabkan organel-organel dalam mikroorganisme terdisosiasi, mikroorganisme nutrisi
menjadi tidak aktif. Tekanan gel putih telur, larutan protein kedelai 16% atau larutan aktomiosin 3% dapat
dicapai dengan menerapkan tekanan hidrostatik pada suhu 25°C selama 30 menit. Gel penginduksi tekanan ini
lebih lembut daripada gel piroelektrik. Paparan otot sapi terhadap tekanan hidrostatik dapat menyebabkan
kerusakan sebagian miofibril, yang dapat membantu melunakkan daging dan protein gel miofibrilar. Berbeda
dengan pengolahan panas, pengolahan tekanan tidak merusak asam amino esensial, warna dan rasa alami, dan
tidak menghasilkan senyawa beracun.

Salah satu variabel termodinamika yang mempengaruhi konformasi protein adalah tekanan hidrostatik.
Berbeda dengan denaturasi akibat suhu yang biasanya terjadi pada kisaran 40-80 °C di bawah satu atmosfer, jika
tekanannya cukup besar, denaturasi akibat tekanan dapat terjadi pada 25 °C. Sebagian besar protein mengalami
denaturasi di bawah tekanan dalam kisaran 1-12 kbar, sebagaimana dibuktikan oleh perubahan karakteristik
spektralnya. Titik tengah transisi yang diinduksi tekanan terjadi pada 4-8 kbar Denaturasi protein globular yang
diinduksi oleh tekanan biasanya disertai dengan pengurangan volume sekitar 30-100 mL/mol. Pengurangan
volume disebabkan oleh dua faktor: penghilangan ruang kosong saat protein terpapar dan hidrasi residu asam
amino non-polar yang terpapar selama proses pembukaan. Acara terakhir menyebabkan volume turun

DAFTAR PUSTAKA

- MEYER. L.h. 1960. Food Chemistry. Reinhold publishing corp.

New York. NY.

- FENEY R.E and R.M Hill. 1960. Protein chemistry. And Food Research. NEW YORK. N.y.10 : 25-
433.
- cantaron dan schepartz 1960. Biochemistry W.W. shoulder company.

philadelpia