Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

www.nature.com/scientificreports

membuka
diinduksi kemoterapi
peradangan saraf dikaitkan dengan
gangguan homeostasis kolon dan
bakteri pada tikus betina
BR Loman 1, KR Jordan2, B. Haynes2, M.t. Kebun istana1,2,4 & LM pyter2,3,5*

Pengobatan kemoterapi secara negatif mempengaruhi sistem saraf dan kekebalan tubuh dan
mengubah fungsi gastrointestinal dan komposisi mikroba. Di luar bidang kanker, perubahan
bakteri komensal dan fungsi kekebalan telah terlibat dalam defisit perilaku; namun, sejauh mana
perubahan usus terkait dengan komorbiditas perilaku terkait kemoterapi belum diketahui. Dengan
demikian, penelitian ini mengidentifikasi perubahan bersamaan dalam perilaku, aktivasi kekebalan
pusat dan perifer, histologi usus besar, dan struktur komunitas bakteri pada tikus yang diobati
dengan kemoterapi paclitaxel. Pada tikus yang diobati dengan paclitaxel, peningkatan kelelahan
dan penurunan kinerja kognitif terjadi secara paralel dengan penurunan imunoreaktivitas
mikroglia, peningkatan ekspresi kemokin yang bersirkulasi (CXCL1),Il-1β,Tnfα, Il-6, dan Cxcl1)
ekspresi gen di otak. Selanjutnya, tikus yang diobati dengan paclitaxel telah mengubah komposisi
komunitas bakteri kolon dan meningkatkan kedalaman ruang bawah tanah. Kelimpahan relatif
dari beberapa taksa bakteri dikaitkan dengan peningkatan massa usus besar, massa limpa, dan
aktivasi mikroglia yang diinduksi paclitaxel. Meskipun komposisi komunitas mikroba tidak secara
langsung terkait dengan ukuran otak atau perilaku yang tersedia, perbedaan struktural dalam
jaringan kolon sangat terkait dengan aktivasi mikroglia di dentate gyrus dan korteks prefrontal.
Data ini menunjukkan bahwa paclitaxel kemoterapi secara bersamaan mempengaruhi mikrobioma
usus, integritas jaringan kolon, aktivasi mikroglia, dan kelelahan pada tikus betina,

Meskipun kemajuan terbaru dalam obat anti-kanker, agen kemoterapi yang mengganggu proliferasi sel tetap menjadi
standar emas pengobatan untuk banyak jenis kanker. Namun, kombinasi pemberian kemoterapi sistemik dan kurangnya
spesifisitas seluler menghasilkan banyak efek samping yang merugikan, baik perilaku (misalnya, gangguan kognitif
"kemobrain", kelelahan)1-3 dan gastrointestinal (GI) (misalnya, diare, mual, muntah)4. Efek samping ini dapat melemahkan,
mahal, dan terkadang mengancam jiwa5-10, sebagian karena mereka mengurangi kepatuhan terhadap pengobatan
kanker7,11. Efek langsung kemoterapi pada jaringan otak (misalnya, toksisitas sel otak atau mielin, stres oksidatif,
peradangan, kerusakan neurovaskular) sering dihipotesiskan untuk mendasari efeknya pada otak dan perilaku. Namun,
penetrasi otak dari berbagai kemoterapi, termasuk paclitaxel (kemoterapi taxane)12,13, terbatas14,15 menunjukkan bahwa
mekanisme tidak langsung berkontribusi pada defisit perilaku yang diinduksi kemoterapi. Sayangnya, pemahaman
komprehensif tentang faktor-faktor yang menyebabkan efek samping perilaku ini kurang dipahami dan oleh karena itu,
sebagian besar tetap tidak diobati16,17.
Mikrobioma usus, ekosistem kompleks bakteri, jamur, archaea, dan virus yang diinangi oleh saluran GI, mungkin merupakan
mediator penting dari mekanisme ini. Secara khusus, bakterioma usus mengirimkan sinyal biologis (baik secara langsung maupun
tidak langsung) ke otak, sehingga mempengaruhi homeostasis SSP, perilaku, dan suasana hati.18,19. Sementara perubahan
suasana hati atau fungsi kognitif belum dikaitkan dengan mikrobioma usus pada pasien kanker yang diobati dengan kemoterapi
atau model hewan, penelitian yang ada mendukung kemungkinannya. Pada hewan pengerat,

1Pusat Patogenesis Mikroba, Lembaga Penelitian di Rumah Sakit Anak Nasional, Columbus, Ohio, AS. 2Institut

Penelitian Kedokteran Perilaku, Universitas Negeri Ohio, Columbus, Ohio, AS. 3Departemen Psikiatri dan
Kesehatan Perilaku, Ohio State University, Columbus, Ohio, AS. 4Departemen Pediatri, Universitas Negeri Ohio,
Columbus, Ohio, AS. 5Departemen Ilmu Saraf, Universitas Negeri Ohio, Columbus, Ohio, AS.
* surel: leah.pyter@osumc.edu

Laporan Ilmiah | (2019) 9:16490 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-52893-0 1

www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports

Gambar 1. Garis waktu eksperimental dan efek kemoterapi pada hasil penyakit. (A) Urutan temporal perawatan
kemoterapi, pengujian perilaku, dan pengumpulan jaringan. (B) Berarti±SEM % perubahan massa tubuh relatif terhadap
baseline, (C) Berarti±SEM % perubahan asupan makanan relatif terhadap baseline. Panah menunjukkan hari suntikan.
n=20/kelompok; *p<0,05 antara kemoterapi dan kelompok kontrol.

gangguan mikrobiota usus menyebabkan gangguan kognitif dan perilaku seperti kecemasan20-23. Sebaliknya,
memanipulasi mikroba usus mereka melemahkan perilaku ini23-26. Selain itu, studi translasi menunjukkan bahwa
kemoterapi mengubah komunitas bakteri tinja27,28, yang dikuatkan oleh studi klinis manusia29-33.
Kontributor penting lainnya untuk efek samping perilaku yang diinduksi kemoterapi adalah interaksi dua arah yang
luas antara usus, mikrobiota residen, dan sistem kekebalan inang.34,35. Memang, pergeseran komposisi mikroba GI terkait
dengan peradangan sistemik36 dan perubahan fungsi neuroimun37. Relevan dengan penelitian ini, peningkatan sitokin
sirkulasi dan peradangan saraf dikaitkan dengan gangguan kognitif, kelelahan, dan gangguan mood pada pasien kanker.
38,39 dan kausal dalam model kanker hewan pengerat40. Jadi, di sini kami berhipotesis bahwa mikrobiota usus

berkontribusi pada peradangan saraf yang diinduksi kemoterapi dan perubahan perilaku. Kami memeriksa perubahan
bersamaan dalam penyakit, kognitif, dan perilaku seperti kecemasan, aktivasi kekebalan pusat dan perifer, histologi
kolon, dan struktur komunitas bakteri pada tikus yang diobati dengan kemoterapi paclitaxel. Meskipun paclitaxel
digunakan untuk mengobati berbagai jenis kanker di seluruh tubuh41, itu secara istimewa terakumulasi di usus bahkan di
atas xenographs tumor pada tikus42. Data kami menunjukkan bahwa meskipun paclitaxel mengarah pada perubahan
mikrobiota usus distal, yang merupakan prediksi perubahan histologi kolon, perubahan histologis jaringan kolon lebih
prediktif terhadap respons perilaku dan otak terhadap kemoterapi daripada perubahan pada mikrobioma usus.

Hasil
Kemoterapi menginduksi perilaku sakit dan meningkatkan tanda inflamasi yang bersirkulasi.
er. Tikus BALB / c betina dewasa disuntikkan sesuai dengan paradigma pengobatan kemoterapi multisiklus (atau kendaraan) yang
relevan secara klinis (Gbr. 4b). 1A dan lihat “Kemoterapi” di Metode). Perawatan kemoterapi menghambat pertumbuhan massa
tubuh dari waktu ke waktu (Gbr. 2).1B; F6, 117 = 3.112, p< 0.01). Secara khusus, sementara tikus yang dirawat dengan kendaraan
bertambah berat badan selama pengobatan, tikus yang diobati dengan kemoterapi tidak. Interaksi ini dari waktu ke waktu
didorong, sebagian, oleh perbedaan yang signifikan antara kelompok pada hari ke-6th injeksi (Hari 11). Kemoterapi secara
bersamaan mengurangi asupan makanan (sebagai persentase dari asupan makanan dasar) dari waktu ke waktu (Gbr. 1).1C; F6,10
=36,5, p<0,0001). Interaksi ini dari waktu ke waktu didorong oleh pengukuran yang dilakukan pada hari-hari pertamaNS, 3rd, dan 5th
suntikan (Hari 1, 5, dan 9, masing-masing). Perawatan kemoterapi meningkatkan sirkulasi IL-1β (Gbr.2A; T5 =3,8, p<0,05) dan TNFα
(Gbr. 2B; T18 =4,0, p<0,0001) konsentrasi 6 jam setelah injeksi akhir relatif terhadap kontrol yang dirawat dengan kendaraan,
dengan kecenderungan yang sama untuk IL-6 dan kemokin CXCL1 (Gbr. 2b). 2C, D; p = 0,1 untuk keduanya). Peradangan sirkulasi
yang diinduksi kemoterapi ini sebagian besar mereda 3 hari setelah injeksi kemoterapi terakhir; hanya CXCL1 yang secara
signifikan lebih tinggi pada tikus yang diobati dengan kemoterapi relatif terhadap kontrol saat ini (Gbr. 2b).2D; T17 =3,493, p<0,005).

Penanda neuroinflamasi yang diinduksi kemoterapi dalam waktu dan spesifik wilayah otak
tata krama. Perawatan kemoterapi meningkatkan ekspresi mRNA dari penanda inflamasi tertentu dengan cara yang
bergantung pada wilayah otak. Di dalam hipotalamus, kemoterapi meningkatIl-1β (Ara. 3A; T15 =3.2, p<0.01) dan Cxcl1 (
Ara. 3J; T15 =2.2, p<0.05) mRNA 6 jam setelah pengobatan kemoterapi terakhir, dengan kecenderungan yang sama untuk
Tnf (p=0,08). Peningkatan ekspresi gen ini tidak bertahan 72 jam setelah pengobatan kemoterapi terakhir. Di
hipokampus, kemoterapi meningkatIl-1β (T17 =5.9, p<0.05) dan Il-6 (T16 =4,4, p<0,05) mRNA 6 jam mengikuti paradigma
kemoterapi (Gbr. 3C,F,I), dengan kecenderungan yang sama untuk Cxcl1 (Ara. 3L; p=0.1). Perawatan kemoterapi juga
cenderung meningkatkan hipokampusCxcl1 ekspresi mRNA pada 72 jam perawatan pasca-final (Gbr. 2b). 3L; U=19,
p=0,08). Tidak ada perbedaan signifikan yang diamati pada korteks frontal, meskipun kemoterapi cenderung
meningkatkan ekspresi genIl-1β (Ara. 3B; U=28, p=0,09) 72 jam setelah perawatan.
Imunoreaktivitas Iba-1, penanda aktivasi / jumlah mikroglial, menurun secara signifikan pada nukleus
paraventrikular (PVN) hipotalamus (Gbr. 4b). 4A,C; T10 =2,771, p<0,05) dan dentate gyrus (DG) dari hipokampus
(Gbr. 4A,C; T12 = 2,337, p <0,05) pada tikus yang diobati dengan kemoterapi 3 hari setelah pengobatan. Tidak ada
perbedaan dalam jumlah Iba-1+ sel diamati di wilayah ini (Gbr. 4E, p>0,05), menunjukkan bahwa penurunan
persentase area imunoreaktif Iba-1 bukan karena penurunan jumlah mikroglia. Sebagai sekunder

Laporan Ilmiah | (2019) 9:16490 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-52893-0 2

www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports

Gambar 2. Efek kemoterapi pada penanda inflamasi yang bersirkulasi. Berarti±plasma SEM (A) IL-1β, (B) TNFα, (C) IL-6,
dan (D) Konsentrasi CXCL1 (pg/ml) 6 atau 72 jam pasca-akhir kemoterapi atau pengobatan kendaraan. n=10/kelompok (6
jam); n=20/grup (72 jam); *p<0,05, **p<0,01 antara kelompok kemoterapi dan kontrol.

Gambar 3. Efek kemoterapi pada ekspresi gen penanda inflamasi otak. Lipat-perubahan dari (A-C) Il-1β, (D-F) Tnf
, (G–I) Il-6, dan (J-L) Cxcl1 ekspresi gen di hipotalamus, korteks frontal, dan hippocampus 6 atau 72 jam setelah
kemoterapi akhir atau perawatan kendaraan relatif terhadap kontrol kendaraan (dan dinormalisasi keGapdh).
n=9–10/kelompok; *p<0,05, **p<0,01 antara kelompok kemoterapi dan kontrol.

Laporan Ilmiah | (2019) 9:16490 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-52893-0 3

www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports

Gambar 4. Efek kemoterapi pada mikroglia dan imunohistokimia astrosit. (A) Gambar representatif
imunohistokimia Iba-1 di PVN dan DG, (B) Kuantifikasi pewarnaan Iba-1 di daerah PVN (kotak putus-
putus), PFC, DG, dan CA3, (C) Gambar representatif imunohistokimia P2ry12 di PFC, DG, dan CA3, (D)
Kuantifikasi pewarnaan P2ry12 di wilayah PVN, PFC, DG, dan CA3, (E) Kuantifikasi pewarnaan GFAP di
daerah PVN, DG, dan CA3. n=8–9/kelompok; *p<0,05 antara kemoterapi dan kelompok kontrol.

analisis status mikroglial, perawatan kemoterapi mengurangi pewarnaan P2ry12 di korteks prefrontal (PFC) (Gbr. 3d). 4B,
D; U= 11, p<0,05), DG (Gbr.4B, D; U= 7, p<0,05), dan CA3 dari hipokampus (Gbr.4B, D; U= 12, p<0,05) daerah otak.
Pewarnaan P2ry12 tidak berbeda nyata pada PVN hewan yang diberi kemoterapi (p>0,05). Pewarnaan GFAP pada astrosit
juga cenderung meningkat pada PVN (Gbr. 2b).4F; T14 =1,903 p= 0,08) dari hewan yang diobati dengan kemoterapi, tetapi
tidak ada perbedaan yang diamati di daerah DG atau CA3 dari hippocampus.

Kemoterapi menyebabkan kelelahan dan gangguan kognitif. Perawatan kemoterapi berinteraksi

dengan waktu untuk mempengaruhi penggerak dalam uji lapangan terbuka (Gbr. 5A; F11, 198 =2,205, p<0,05). Sementara gerakan menurun
dari waktu ke waktu pada semua tikus, tikus yang diobati dengan kemoterapi mengurangi gerakan jauh lebih awal daripada tikus yang
diobati dengan kendaraan. Tidak ada perbedaan dalam perilaku seperti kecemasan (yaitu, tendensi sentral) yang diamati antara kelompok
yang diobati dengan kemoterapi dan kelompok kontrol (Gbr. 2).5A; p > 0,05). Dalam penilaian pengkondisian rasa takut dari memori
kontekstual, kemoterapi secara konsisten merusak persen waktu pembekuan selama periode pengujian 5 menit (Gbr. 4b).5B; F1,56 = 5,9,
p<0,05) dan total persen waktu pembekuan (Gbr. 5B; T14 =2.4, p<0.05). Ketika pengkondisian isyarat dinilai, tidak ada perbedaan keseluruhan
dalam persen waktu pembekuan yang diamati di antara kelompok (Gbr. 4b).5C; p> 0,05), namun demikian, pembekuan sebagai respons
terhadap presentasi isyarat pertama dikurangi dengan kemoterapi (Gbr. 2).5C; T17 =2.1, p<0.05). Kemoterapi tidak mengubah jumlah kelereng
yang terkubur dalam tugas mengubur marmer untuk perilaku seperti kecemasan obsesif-kompulsif (p> 0,05) atau preferensi untuk zona
terang atau gelap, jumlah lintasan antar zona, kecepatan, atau jarak yang ditempuh dalam cahaya -tes eksplorasi gelap (data tidak
ditampilkan; p>0,05 dalam semua kasus).

Laporan Ilmiah | (2019) 9:16490 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-52893-0 4

www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports

Gambar 5. Efek kemoterapi pada kelelahan, perilaku seperti kecemasan, dan memori. (A) Berarti±Kecenderungan sentral SEM
dan perilaku penggerak di lapangan terbuka 6 jam setelah kemoterapi akhir atau perawatan kendaraan, (B) Berarti±SEM persen
waktu pembekuan dalam wadah 1 menit (dari uji 5 menit) dan total persen pembekuan sebagai respons terhadap stimulus
kontekstual yang dikondisikan 2 hari setelah kemoterapi akhir atau perawatan kendaraan, (C) Berarti±SEM persen waktu
pembekuan selama masing-masing lima 30-s presentasi stimulus isyarat terkondisi (cahaya) dan total persen pembekuan 2 jam
setelah pengujian kontekstual. n=10/kelompok; *p<0,05 antara kemoterapi dan kelompok kontrol.

Kemoterapi meningkatkan penanda peradangan perifer dan kedalaman ruang bawah tanah kolon distal.
Kemoterapi meningkatkan massa limpa (Gbr. 6A; T36 = 4,803, p <0,001, panjang usus besar per massa tubuh (Gbr. 6B; T16 = 2,252, p
<0,05), dan massa usus besar relatif per panjang (Gbr. 6C; T16 = 2,192, p < 0,05). Panjang usus besar mentah secara numerik lebih
tinggi pada kelompok yang diobati dengan kemoterapi, tetapi tidak mencapai signifikansi statistik (p = 0,14). Kemoterapi juga
meningkatkan konsentrasi protein pengikat lipopolisakarida (LBP) yang bersirkulasi, penanda endotoksin dalam aliran darah
(yaitu, peningkatan permeabilitas usus), relatif terhadap kontrol yang diobati dengan kendaraan (Gbr. 1).6D; T18 = 5,4, p < 0,0001).
Secara morfologis, kedalaman ruang bawah tanah tidak berubah di kolon proksimal (Gbr. 2b).6E,F), tetapi meningkat dengan
kemoterapi di kolon distal (Gbr. 6G, H; T16 =2,586, p<0,05).

Kemoterapi mengubah ekspresi penanda inflamasi terbatas di usus besar. Meskipun

ekspresi beberapa penanda klasik peradangan usus disurvei di segmen kolon, mayoritas (Il-1β, Il-2,
Il-6, Cxcl1) tidak diubah oleh kemoterapi (Tabel 1). Namun, ekspresiMmp9 meningkat di kolon
proksimal (Tabel 1; p<0,01), sedangkan ekspresiTnf menurun di kolon distal (p<0,05).

Kemoterapi menurunkan keragaman bakteri tinja selama pengobatan. Kemoterapi

penurunan keragaman alfa bakteri tinja seperti yang ditunjukkan oleh indeks Shannon (ukuran kemerataan taksonomi;
Gambar. 7A; p <0,05), dan peningkatan kelimpahan relatifLactobacillus (Ara. 7B; p<0,05). Dalam kedua kasus,pasca-hoctes
menunjukkan bahwa nilai hewan yang diobati dengan kemoterapi diubah dari awal (keduanya p<0,05), yang tidak benar
untuk kontrol yang diobati dengan kendaraan. Selanjutnya, indeks Shannon dan kelimpahan relatifLactobacillussangat
berbanding terbalik (Gambar. 7C; r = 0,84, p<0,05). Tidak ada perbedaan dalam keragaman alfa seperti yang ditunjukkan
oleh total fitur yang diamati (jumlah total urutan berbeda yang diamati dalam kumpulan data, ukuran kekayaan
taksonomi).
Kemoterapi juga mengubah keragaman beta bakteri tinja seperti yang ditunjukkan oleh jarak UniFrac tertimbang
(ukuran tentang bagaimana seluruh populasi bakteri berbeda di antara individu di antara setiap perawatan,
memperhitungkan jarak taksonomi dan kelimpahan relatif) (Gbr. 1a). 7D; p<0,05). Secara khusus, setelah injeksi akhir
kemoterapi, populasi bakteri berbeda dibandingkan dengan populasi awal dan populasi injeksi kedua dari kedua
kelompok perlakuan. Pada kelompok yang diobati dengan kemoterapi, titik-titik yang mewakili populasi bakteri setelah
semua 6 suntikan secara visual berkerumun lebih dekat ke biplot untukLactobacillus (Ara. 7F), yang tidak terjadi pada
kelompok yang dirawat dengan kendaraan (Gbr. 7E).

Kemoterapi mengubah populasi bakteri kolon proksimal dan distal. Di kolon proksimal,
kemoterapi menurunkan keragaman alfa bakteri seperti yang ditunjukkan oleh indeks Shannon (Gbr. 2). 8A, p <0,05), tetapi tidak
total fitur yang diamati. Selain itu, kemoterapi mengubah keragaman beta seperti yang ditunjukkan oleh jarak UniFrac yang tidak
berbobot (Gbr. 4b).8B, p <0,05), tetapi tidak tertimbang jarak UniFrac. Di kolon distal, kemoterapi menurunkan keragaman alfa
seperti yang ditunjukkan oleh total fitur yang diamati (Gbr. 2b).8D, p<0,05), tetapi bukan indeks Shannon. Lebih-lebih lagi,

Laporan Ilmiah | (2019) 9:16490 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-52893-0 5

www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports

Gambar 6. Kemoterapi mengubah morfologi limpa dan kolon. Berarti±SEM (A) massa limpa, (B) panjang titik dua, (C) massa
usus besar, dan (D) protein pengikat lipopolisakarida yang bersirkulasi meningkat dengan kemoterapi. Sementara kedalaman
ruang bawah tanah tidak terpengaruh di kolon proksimal(E, F), kemoterapi meningkatkan kedalaman ruang bawah tanah di
usus distal (G, H). n=8–10/kelompok; *p<0,05 antara kemoterapi dan kelompok kontrol.

Waktu Pasca Final

gen Perlakuan Perlakuan Kolon Proksimal Kolon Distal
KENDARAAN 1.32±0.18 1.00±0,07
IL-1β 72 jam
KEMOTERAPI 1.33±0.2 1.07±0,08
KENDARAAN 0,23±0,08 0,59±0.14
Il-2 72 jam
KEMOTERAPI 0.17±0,09 0,47±0.16
KENDARAAN 1.32±0.18 1.00±0,07
Il-6 72 jam
KEMOTERAPI 1.33±0.2 1.07±0,08
KENDARAAN 1.13±0.11 0,96±0,07
Tnf 72 jam
KEMOTERAPI 1.18±0.12 0,74±0,08 *
KENDARAAN 0,59±0,25 0,45±0,06
Cxcl1 72 jam
KEMOTERAPI 0,64±0,28 0,51±0,07
KENDARAAN 0,80±0.13 0,57±0,04
Mmp9 72 jam
KEMOTERAPI 1.39±0.13# 0,53±0,04

Tabel 1. Ekspresi gen kolon dari penanda inflamasi ±SEM (satuan arbitrer, kurva standar relatif
dinormalisasi ke Eef2). n=8–10/kelompok; *p<0,05;#p<0,01.

kemoterapi mengubah keragaman beta seperti yang ditunjukkan oleh jarak UniFrac yang tertimbang (Gbr. 2b). 8E, p <0,05), tetapi bukan
jarak UniFrac yang tidak berbobot.
Pada tingkat fitur, kemoterapi meningkatkan beberapa taksa, dan menurunkan banyak taksa di kedua segmen usus besar
(Gbr. 2). 8C, F; semua p<0,05 setelah koreksi FDR). Menariknya, kedua segmen menunjukkan peningkatan kelimpahan relatif
mucispirillum. Kemoterapi memiliki berbagai efek padaLachnospiraceae keluarga, sebagai kelimpahan relatif dari

Laporan Ilmiah | (2019) 9:16490 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-52893-0 6

www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports

Gambar 7. Kemoterapi mengubah bakteriom tinja dari waktu ke waktu. (A) Keragaman alfa yang diukur dengan Indeks
Shannon menurun sebagai efek waktu, dan menurun antara awal dan pasca-6 suntikan pada kelompok kemoterapi
tetapi tidak pada kelompok kendaraan. (B) Penurunan ini dikaitkan dengan peningkatanLactobacillus sebagai efek waktu
dan meningkat antara injeksi awal dan pasca-6 pada kelompok kemoterapi tetapi tidak pada kelompok kendaraan dan (
C) berkorelasi negatif dengan keragaman alfa. (D) Jarak UniFrac tertimbang (keragaman beta) dibedakan antara
kemoterapi dan kelompok kendaraan, dan (E, F) biplot untukLactobacillus (panah hitam) menunjukkan bahwa
kelimpahan relatif dari genus ini mendorong perbedaan sepanjang waktu, terutama pada kelompok kemoterapi. n=6–
10/kelompok; *p<0,05 pengukuran berulang ANOVA untuk waktu;#p<0,05 vs dasar.

beberapa fitur meningkat dan menurun. Khususnya, kelimpahan relatif bakteri penghasil butirat yang diketahui
menurun dengan kemoterapi, termasukRoseburia, Eubacterium, dan Erysipelotrichaceae.

Penanda kemoterapi di usus besar dan otak saling terkait. Semua data diubah oleh kemoterapi
(kelimpahan relatif bakteri, ukuran kolon, massa limpa, dan IHC otak) diuji untuk asosiasi; hasilnya ditampilkan pada
Gambar.9 (semua p<0,05 setelah koreksi FDR, besarnya semua r > 0,50). Kelimpahan relatif fitur bakteri sangat saling
berhubungan di dalam daerah usus besar. dikurangiLachnospiraceae dikaitkan dengan peningkatan massa usus besar,
tetapi penanda aktivasi mikroglia di otak terutama terkait dengan perubahan biologi usus besar (misalnya, peningkatan
massa usus besar dan kedalaman ruang bawah tanah, penurunan Tnf ekspresi) dan peradangan perifer (massa limpa),
tidak langsung ke kelimpahan relatif bakteri.

Diskusi
Penelitian ini mengevaluasi perubahan perilaku, inflamasi, morfologi kolon, dan struktur komunitas bakteri yang
diinduksi oleh paradigma multisiklus kemoterapi paclitaxel pada mencit betina dewasa. Secara keseluruhan, kemoterapi
menginduksi perilaku sakit sedang (anoreksia, kelelahan, pertumbuhan terhambat), gangguan kinerja kognitif,
peningkatan peradangan sentral dan perifer akut, bukti pelepasan endotoksin ke dalam sirkulasi, perubahan morfologi
membran kolon, serta penurunan kolon dan feses. keragaman komunitas bakteri. Yang penting, penelitian ini
menetapkan hubungan, untuk pertama kalinya, antara neurobiologi yang diinduksi kemoterapi dan perubahan
gastrointestinal dan mikroba.
Dalam penelitian ini, paradigma kemoterapi 6 dosis menginduksi perilaku seperti penyakit sedang, seperti yang ditunjukkan
oleh penurunan berat badan, asupan makanan, dan penggerak dalam uji lapangan terbuka. Tikus pada rentang usia ini (7-10
minggu) masih dalam fase pertumbuhan linier dewasa, dan dengan demikian diperkirakan akan terus bertambah massanya.
Anoreksia dan penurunan berat badan adalah efek samping yang umum dari paclitaxel43 dan kemoterapi lainnya pada pasien
kanker, terkadang cukup parah untuk mengganti atau mengakhiri perawatan, dan secara positif terkait dengan kematian9,10.
Pengurangan gerak mungkin merupakan indikasi kelelahan pada tikus, efek samping umum lain dari kemoterapi, meskipun
analisis lebih lanjut untuk menilai kelelahan diperlukan. Masing-masing perilaku penyakit ini dikaitkan dengan peradangan perifer
pada pasien kemoterapi44,45 dan model hewan pengerat lainnya46. Memang, dalam penelitian ini, tikus yang diobati dengan
paclitaxel menunjukkan bukti peradangan perifer termasuk peningkatan massa limpa dalam hubungannya dengan peningkatan
konsentrasi transien LBP, IL-1β, TNFα, dan CXCL1 yang bersirkulasi. Studi lain pada tikus gagal mendeteksi penanda inflamasi yang
bersirkulasi 2 jam atau 1 minggu pasca perawatan, meskipun setelah dosis paclitaxel yang lebih rendah.

Laporan Ilmiah | (2019) 9:16490 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-52893-0 7

www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports

Angka 8. Kemoterapi mengubah bakterioma kolon proksimal dan distal. (A) Keragaman alfa menurun di kolon
proksimal (A, Indeks Shannon) dan kolon distal (D, Total OTU) dari kemoterapi. (B) Sementara jarak UniFrac yang tidak
tertimbang membedakan kemoterapi dan kelompok kendaraan di kolon proksimal, (E)jarak UniFrac tertimbang
membedakan mereka di usus distal. (C, F) Perbedaan keragaman ini dikaitkan dengan perbedaan pada tingkat fitur. Bar
mewakili Mean±SEM masing-masing kelompok perlakuan. n=6–10/ kelompok; *p<0,05 antara kemoterapi dan kelompok
kontrol. Intensitas warna peta panas dinormalisasi menjadi 1 dalam setiap fitur di seluruh subjek; p<0,05 antara
kemoterapi dan kelompok kendaraan untuk semua fitur yang disajikan.

(10 mg/kg)43. Pada pasien kanker yang diobati dengan paclitaxel, peningkatan sementara dalam sirkulasi IL-6,
IL-8, dan IL-10 relatif terhadap kontrol yang sehat juga diamati.47. Dalam penelitian ini, peningkatan dan ekspresi
transien mRNA sitokin pro-inflamasi di otak (hipotalamus, hipokampus) 6 jam setelah injeksi terakhir menguatkan
respons akut dalam sirkulasi.
Kongruen dengan hipotesis kami, peradangan sistemik yang diinduksi kemoterapi sederhana yang diamati dikaitkan
dengan peradangan saraf, meskipun sementara. Peradangan sistemik dapat ditransduksi ke dalam sistem saraf pusat,
menghasilkan aktivasi mikroglia dan astrosit dan peningkatan ekspresi sitokin pro-inflamasi di otak.48. Dalam penelitian
ini, kemoterapi secara sementara meningkatkan ekspresi sitokin pro-inflamasi (Il-1β, Il-6, dan Tnf) dan kemokin, Cxcl1, di
hipotalamus dan/atau hipokampus (6 jam tetapi tidak 72 jam pasca injeksi akhir), tanpa mempengaruhi penanda ini di
korteks frontal. Dalam wilayah otak yang sama (misalnya nukleus periventrikular, dentate gyrus, dan CA3), tetapi ~3 hari
kemudian, dua penanda imunohistokimia dari aktivasi mikroglial (Iba-1, P2ry12) menurun. Secara keseluruhan, ini
menunjukkan bahwa mikroglia atau sel penghasil sitokin lainnya di otak (endotel, neuron, astroglia) dapat diaktifkan
dalam 6 jam kemoterapi dan menginduksi transkripsi inflamasi, tetapi setelah beberapa hari mengakibatkan potensi
kompensasi deaktivasi mikroglia. Sebagai catatan, pengurangan pewarnaan Iba-1 tidak terkait dengan penurunan sel
mikroglia, menunjukkan bahwa kematian sel tidak memperhitungkan pengurangan pewarnaan pada titik waktu ini.
Dengan demikian, respons neuroinflamasi awal ini mungkin didorong oleh stres oksidatif karena kemoterapi, daripada
pola molekul terkait kerusakan (DAMPs) dari kematian sel lokal. Studi sebelumnya tentang ini dan kemoterapi lainnya
melaporkan hasil yang beragam dalam hal peradangan saraf berikutnya dan aktivasi mikroglial49-52. Tentu saja, temuan
campuran ini mungkin mencerminkan variasi waktu penilaian dari respons yang tampaknya dinamis di otak ini. Variasi
tambahan diperkenalkan karena beberapa paradigma model termasuk perawatan kemoterapi dosis tunggal dan
mungkin juga menggabungkan tumor38. Perubahan neuroinflamasi yang diinduksi paclitaxel di sumsum tulang belakang
dan induksi nyeri neuropatik lebih dipahami secara menyeluruh. Ekspresi sitokin sumsum tulang belakang dalam model
ini dikaitkan dengan peningkatan aktivasi mikroglial dan astrosit53,54. Perubahan nyata di GFAP+ astrosit tidak diamati
pada tikus yang diobati dengan kemoterapi, meskipun analisis yang lebih komprehensif mungkin diperlukan.

Laporan Ilmiah | (2019) 9:16490 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-52893-0 8

www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports

Gambar 9. Perubahan yang diinduksi kemoterapi pada bakterioma, usus besar, dan otak terkait. Korelasi yang bertahan
dari koreksi nilai-p tingkat penemuan palsu disajikan; besarnya semua konstanta korelasi >0,5. Garis solid=hubungan
positif, garis putus-putus=hubungan negatif, kotak putih=lebih tinggi pada kelompok kendaraan, kotak abu-abu=lebih
tinggi pada kelompok kemoterapi, *= ciri bakteri identik antara kolon proksimal dan distal.

Peradangan dan aktivasi mikroglial memodulasi fungsi otak tingkat tinggi, termasuk kinerja kognitif, selain perilaku sakit yang
dibahas sebelumnya55. Memang, bertepatan dengan peradangan hippocampal, tikus dalam penelitian ini menunjukkan gangguan
yang signifikan dalam pengkondisian ketakutan kontekstual yang bergantung pada hippocampal tanpa adanya pengkondisian
isyarat yang tidak bergantung pada hippocampal. Selanjutnya, nyeri neuropatik yang berpotensi disebabkan oleh paradigma
paclitaxel ini diharapkan dapat meningkatkan pembelajaran asosiatif kejutan kaki ini, bukan mengganggu pembelajaran, seperti
yang diamati. Dengan demikian, gangguan dalam memori kontekstual ini tampaknya tidak dikacaukan oleh perbedaan alodinia,
dan jika ada, dapat diremehkan. Demikian pula, kemoterapi siklofosfamid dan doksorubisin mengurangi pengkondisian ketakutan
kontekstual, meskipun gangguan kognitif ini ditandai dengan aktivasi mikroglial (walaupun, ~ 1,5 minggu kemudian) pada tikus.56,
57. Dalam studi kognisi lain, kemoterapi yang berbeda menginduksi hasil yang bertentangan untuk berbagai fungsi kognitif57,58
meskipun tugas-tugas di mana kognisi dipengaruhi secara negatif oleh kemoterapi secara konsisten bergantung pada
hipokampus57,59 sejalan dengan yang diamati dalam penelitian ini. Sebagai catatan, sebagian besar penelitian sebelumnya
dilakukan pada tikus dan hanya satu dari mereka yang menggunakan kemoterapi paclitaxel59.

Untuk mendukung hipotesis kami lebih lanjut, perubahan histologi kolon secara signifikan terkait dengan hubungan
mikroba-otak. Mengingat bahwa usus besar memiliki kepadatan dan kolonisasi mikroba tertinggi di dalam tubuh, kami
fokus pada situs ini untuk penyelidikan kami tentang sumbu mikroba-usus-otak. Tikus yang diobati dengan kemoterapi
mengalami peningkatan kedalaman ruang bawah tanah kolon dan ekspresiMmp9, massa usus besar dan limpa, dan
penanda sirkulasi gangguan penghalang usus (LBP). Perubahan ini mirip dengan yang ditemukan pada model hewan
pengerat penyakit usus menular60-62. Tidak seperti model infeksi ini, bagaimanapun, panjang usus besar tidak berkurang
dan ekspresi pro-inflamasiTnf dan Il-6 tidak meningkat. Faktanya, panjang usus besar bertambah, danTnf ekspresi

Laporan Ilmiah | (2019) 9:16490 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-52893-0 9

www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports

menurun pada kolon distal tikus yang diobati dengan paclitaxel. Memang, peningkatan kedalaman ruang bawah tanah yang
diinduksi kemoterapi ini mungkin terkait dengan perubahan bakteri komensal, seperti hiperplasia ruang bawah tanah yang
dilaporkan dalam usus kecil tikus yang dibesarkan secara konvensional yang diobati dengan kemoterapi doxorubicin.63 tidak ada
pada tikus bebas kuman yang menjalani perawatan yang sama64. Dalam model kolitis yang diinduksi secara kimia, merusak sel T
regulator (Treg) fungsi meningkatkan panjang dan massa usus besar65, dan pemulihan Treg populasi menormalkan peningkatan
yang diperburuk dalam massa kolon66. Akhirnya, peningkatan LBP yang bersirkulasi 4-5 kali lipat dapat menunjukkan bahwa defisit
pada penghalang usus dapat memicu peradangan sistemik (dan selanjutnya, otak) yang diamati, mirip dengan yang diamati
dengan kemoterapi doksorubisin.67. Selanjutnya, pada pasien kanker yang diobati dengan kemoterapi kombinasi paclitaxel dan
platinum, permeabilitas gastrointestinal meningkat relatif terhadap baseline68.
Efek kemoterapi pada komposisi mikroba usus pada pasien kanker belum dipelajari secara ekstensif, tetapi beberapa
studi dalam literatur yang ada menunjukkan bahwa kemoterapi akut mengurangi keragaman bakteri tinja atau jumlah
bakteri yang dapat dibiakkan dari tinja.29-32. Dalam kohort kecil pasien kanker yang menerima berbagai kemoterapi, rata-
rata tinjaLactobacillus dinilai melalui qPCR sangat bervariasi, tetapi secara numerik (tidak signifikan) meningkat selama 5
hari setelah kemoterapi dosis tunggal30. Ini dikaitkan dengan peningkatan bersamaan dalam MMP3 dan MMP9 yang
bersirkulasi pada 2 dan 5 hari setelah pengobatan. Dalam penelitian kami, urutan DNA 16 s dipetakan keLactobacillus
menunjukkan kelimpahan relatif tinggi dalam sampel tinja, yang berhubungan negatif dengan keragaman masyarakat
secara keseluruhan. Menariknya, kami mengamati peningkatan fesesLactobacillus kelimpahan relatif segera setelah
dosis akhir kemoterapi, dan peningkatan ekspresi Mmp9 mRNA di kolon proksimal 72 jam setelah pengobatan
kemoterapi terakhir. Sedangkan hubungan antaraLactobacillus dan MMP belum jelas, data ini menunjukkan bahwa usus
besar mungkin merupakan sumber penting dari peningkatan MMP yang bersirkulasi yang diamati pada manusia.

Dalam penelitian ini, paclitaxel menurunkan kelimpahan relatif beberapa taksa bakteri yang penting untuk kesehatan
kolon. Sementara kemoterapi menginduksi fluktuasi dalam kelimpahan relatif anggotaLachnospiraceae keluarga (yaitu,
kelimpahan relatif keduanya lebih rendah dan lebih tinggi berdasarkan taksa), the Lachnospiraceaeanggota keluarga
yang memiliki representasi lebih rendah setelah kemoterapi sangat terkait dengan mikroba penghasil butirat yang
diketahui. Secara khusus,Roseburia, (yang mampu menghasilkan butirat69; lebih rendah pada usus besar tikus yang
diobati dengan paclitaxel. Butirat adalah sumber energi utama epitel kolon, dan pusat kesehatan usus70, dan penurunan
bakteri penghasil butirat dikaitkan dengan komorbiditas perilaku pada manusia dan hewan pengerat34. Sementara
beberapa anggotaLachnospiraceae mampu memproduksi butirat60, beberapa anggota Lachnospiraceae keluarga juga
dikenal karena kemampuan mereka untuk memulai degradasi serat untuk fermentasi oleh produsen butirat lainnya71.
Dengan demikian, tidak mengherankan bahwa penguranganLachnospiraceae berkorelasi dengan pengurangan bakteri
penghasil butirat lainnya, seperti Eubacterium dan Erysipelotrichaceae. Interaksi fungsional antara bakteri ini dan
ketergantungan padaLachnospiraceae (selama kemoterapi) memerlukan penyelidikan lebih lanjut.

Selain mikroba penghasil butirat yang lebih rendah, kelimpahan relatif yang lebih tinggi dari mucispirillum juga
terkenal karena kemampuannya untuk menjajah lapisan lendir usus, mengais spesies oksigen reaktif, dan memodifikasi
ekspresi gen mukosa inang.72. Perubahan lapisan lendir kolon dan stres oksidatif sering terjadi selama peradangan kolon
73,74, sehingga ada kemungkinan bahwa peradangan usus yang diinduksi kemoterapi berkontribusi pada perubahan

mikrobioma usus melalui perubahan lendir dan stres oksidatif. Meskipun,mucispirillum tidak berkorelasi dengan
perbedaan bakteri, usus besar, atau sel otak yang diinduksi kemoterapi lainnya di sini.
Dalam studi pasien kanker, peran mikroba usus dalam komorbiditas perilaku belum diperiksa. Memang, hanya satu penelitian
yang mencoba membahas hubungan dengan suasana hati menggunakan penilaian kualitas hidup yang dilaporkan sendiri secara
umum75. Dalam penelitian kami, perubahan yang diinduksi kemoterapi pada bakteri kolon sangat saling terkait, tetapi hanya ada
satu hubungan antara taksa individu dan imunoreaktivitas mikroglia di otak.Ruminiclostridium, yang lebih tinggi pada tikus yang
diobati dengan paclitaxel, secara signifikan dikaitkan dengan peningkatan pewarnaan mikroglia di PVN. Ruminiclostridium sp.
adalah anaerob ketat yang paling dikenal karena aktivitas selulitiknya. Meskipun efeknya pada fisiologi inang belum dipelajari
secara luas, penelitian kami menunjukkan bahwa mereka mungkin memiliki peran dalam sumbu usus-otak. Jaringan mikroba di
usus distal secara signifikan berkorelasi dengan massa usus besar, yang pada gilirannya berbanding terbalik dengan pewarnaan
mikroglia di PFC. Demikian pula, kedalaman ruang bawah tanah di kolon distal berbanding terbalik dengan pewarnaan mikroglia
di DG. Sampai saat ini, tidak ada penelitian yang menilai apakah histopatologi kolon terkait dengan perubahan otak atau perilaku.
Namun, semakin banyak bukti menunjukkan bahwa peningkatan permeabilitas usus berkontribusi terhadap kecemasan dan
depresi76,77. Ketika dipertimbangkan dengan peningkatan LBP yang diamati dalam darah, yang merupakan indikasi peningkatan
permeabilitas usus, penelitian kami menunjukkan bahwa integritas penghalang kolon merupakan faktor mediasi penting dalam
sumbu otak-usus-mikrobiota.
Kemoterapi memiliki banyak efek samping yang melemahkan, termasuk efek gastrointestinal dan perilaku. Namun,
karena dasar biologis dari efek samping perilaku tidak dipahami dengan baik, sebagian besar tidak diobati dan
mengakibatkan penurunan kepatuhan pengobatan.7,11. Studi ini menunjukkan bahwa kemoterapi paclitaxel menginduksi
perilaku sakit yang berhubungan dengan perubahan integritas jaringan kolon; perubahan integritas jaringan kolon, pada
gilirannya, terkait dengan perubahan mikrobioma usus. Temuan ini menunjukkan bahwa strategi terapi yang
menargetkan mikrobiota usus, (misalnya, intervensi diet, prebiotik dan/atau probiotik) yang dapat melemahkan efek
buruk kemoterapi pada integritas usus.78-80, juga dapat membantu untuk mengurangi efek samping perilaku kemoterapi.

Bahan dan metode

Ikhtisar desain eksperimental. Tikus BALB / c betina dewasa disuntikkan sesuai dengan paradigma pengobatan kemoterapi
multisiklus (atau kendaraan) yang relevan secara klinis (Gbr. 4b). 1 dan lihat “Kemoterapi” di bawah). Dalam satu kelompok tikus,
sampel tinja dikumpulkan tiga kali: sehari sebelum injeksi pertama, dan hari-hari setelah injeksi kedua.dan
dan terakhir (6th) suntikan. Pengujian perilaku untuk kelesuan dan perilaku seperti afektif dilakukan
selama tiga hari berikutnya; perilaku sakit (anoreksia, cachexia) diukur selama percobaan. Tikus adalah

Laporan Ilmiah | (2019) 9:16490 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-52893-0 10

www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports

kemudian di-eutanasia (Hari 14) dan usus besar dikumpulkan untuk analisis ekspresi mikroba, histologis, dan gen, otak
dikumpulkan untuk imunohistokimia terkait peradangan, dan darah dikumpulkan untuk konsentrasi sitokin/kemokin
yang bersirkulasi. Dalam kohort kedua, darah diambil sampelnya sehari setelah injeksi terakhir untuk menilai konsentrasi
protein pengikat lipopolisakarida yang bersirkulasi dan pengkondisian ketakutan kognitif dinilai selama periode perilaku
(Gbr. 4b).1). Dalam kelompok ketiga, darah dan jaringan otak dikumpulkan 6 jam setelah injeksi terakhir untuk analisis
ekspresi sitokin sebelumnya.

Hewan. Tikus BALB/c betina, berumur 7-8 minggu (Charles River, Wilmington, MA, USA) dari tandu campuran ditempatkan di
kandang tunggal dan diaklimatisasi dengan siklus terang:gelap 14:10 (mati pada 1500 jam) dalam suhu- vivarium terkontrol (22±
1°C) selama 1 minggu. Semua mencit juga diaklimatisasi 3 kali penanganan sebelum dilakukan prosedur percobaan. Chow hewan
pengerat standar dan air tersediaad libitum sepanjang masa studi. Semua percobaan hewan telah disetujui oleh Komite Perawatan
dan Penggunaan Hewan Institusional Universitas Negeri Ohio dan dilakukan sesuai dengan Panduan Kesehatan Institut Nasional
untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium81. Semua upaya dilakukan untuk meminimalkan penderitaan hewan dan
mengurangi jumlah tikus yang digunakan.

Kemoterapi dan perilaku sakit. Paclitaxel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), agen kemoterapi penstabil
mikrotubulus taxane yang biasa digunakan untuk mengobati kanker payudara, dilarutkan dalam Cremophor-EL (1:1
EtOH) dan kemudian diencerkan 1:1 dengan PBS steril . Setiap injeksi terdiri dari 100 l kemoterapi (30mg/kg; ip) atau
kendaraan, mewakili ~80% dari dosis iv pada pasien (FDA 2005) dan berdasarkan percobaan respons dosis sebelumnya
yang menilai penambahan berat badan dan asupan makanan (data tidak ditampilkan). Tikus menerima total 6 dosis yang
diberikan setiap hari selama fase cahaya, dimodelkan setelah 4-8 dosis kemoterapi yang biasanya diberikan setiap 1-3
minggu untuk pasien kanker payudara. Durasi antara perawatan kemoterapi ini diperkecil menurut perhitungan umur
tikus (misalnya, 10 tahun manusia≈ 2 bulan tikus). Meskipun dilaporkan gagal melewati sawar darah-otak12,82, paclitaxel
telah dikaitkan dengan komorbiditas perilaku pasien kanker83-85. Massa tubuh dan asupan makanan 48 jam dicatat secara
individual mulai dua hari sebelum injeksi (dasar) dan setiap hari injeksi sesudahnya untuk menilai cachexia dan anoreksia.
Massa tubuh dan asupan makanan dianalisis sebagai persentase perubahan dari baseline (n=20/kelompok).

Tes perilaku. Semua pengujian untuk perilaku seperti kecemasan, kognitif, dan kelelahan terjadi selama fase gelap awal
(1800-2100 jam) di bawah lampu merah redup kecuali ditentukan lain. Ketika beberapa tes dijalankan, setiap tes dipisahkan oleh
24 jam dimulai dengan lapangan terbuka, kemudian kotak terang/gelap, kemudian penguburan marmer (n=10/kelompok).

Lapangan terbuka. Tikus ditempatkan di tengah 16 × 16 di arena dengan lapisan tipis tempat tidur tongkol jagung dan
dibiarkan menjelajah selama 1 jam untuk mengukur perilaku seperti kecemasan (kecenderungan sentral) dan penggerak
umum seperti yang dijelaskan sebelumnya86. Kelelahan secara operasional didefinisikan sebagai penurunan penggerak
untuk penelitian ini. Tendensi sentral dihitung sebagai persen pergerakan di pusat 4× 4 di zona arena versus total
pergerakan arena. Semua perilaku dianalisis dalam interval 5 menit. Aparat dibersihkan dengan 70% etanol antara tikus.

Kotak terang/gelap. Kotak Plexiglas hitam (16 × 8 in) dipasang di dalam setengah dari arena lapangan terbuka untuk
menciptakan zona 'gelap' dan pencahayaan latar belakang digunakan untuk membuat zona 'terang' di sisi lain. Bukaan
kecil di kotak hitam (10× 7,7 cm, jam × w) memungkinkan pergerakan antara dua zona. Tikus ditempatkan di tengah sisi
terang dan dibiarkan menjelajah selama 15 menit. Total pergerakan horizontal, waktu, kecepatan, dan jumlah lintasan
antara dua zona dilacak menggunakan sistem 16-photobeam untuk menilai gerak dan perilaku seperti kecemasan.

Tes mengubur marmer. Mirip dengan yang dijelaskan sebelumnya86, kandang tikus standar diisi dengan bedding tongkol jagung
hingga kedalaman 1 in. Sembilan kelereng dibersihkan dengan 70% EtOH dan ditempatkan secara merata di seluruh permukaan
bedding. Tikus kemudian ditempatkan di tengah kandang selama 10 menit. Setelah itu, tikus dikeluarkan dan jumlah kelereng
yang terkubur, terkubur sebagian, dan tidak terkubur dicatat untuk menilai perilaku seperti kecemasan obsesif-kompulsif.87.

Pengkondisian ketakutan. Peralatan otomatis digunakan untuk menilai memori berbasis amigdala (perilaku membeku) di ruang uji
dengan 16 × 16 array photobeam dan lantai kotak kejut terletak di dalam kabinet peredam suara yang lebih besar (San Diego
Instruments, San Diego, CA, USA). Ruang uji persegi (25,4× 25,4 cm) termasuk dinding kaca plexiglass transparan dan bola lampu
di atas kepala yang terpasang pada tutup ruang. Pengkondisian ketakutan dijalankan selama 2 hari. Pada hari 1, tikus diangkut ke
ruang uji di kandang baru dan setelah 3 menit aklimatisasi, tikus terkena 5 pasangan isyarat cahaya 30 detik dengan kejutan kaki
(0,4 mA) dengan interval 1 menit antara setiap cahaya / pasangan kejutan. Ruang uji dibersihkan dengan etanol di antara masing-
masing tikus. Dua puluh empat jam kemudian tikus menyelesaikan kontekstual, diikuti dengan isyarat, pengujian memori. Untuk
pengujian kontekstual, tikus diangkut dalam kandang baru dan ditempatkan di ruang uji yang sama di mana mereka telah
menerima pasangan cahaya/guncangan hari sebelumnya. Pembekuan (dihitung sebagai> 0,5 s tanpa jeda sinar) diukur tanpa
kejutan atau isyarat cahaya selama 5 menit. Dua jam setelah mengukur memori kontekstual, tikus menyelesaikan pengujian
isyarat yang mereka diangkut ke ruang oktagonal hitam baru melalui tangan bersarung cuka yang disemprotkan. Tikus
diaklimatisasi ke ruang baru selama 3 menit dan kemudian disajikan dengan isyarat cahaya yang digunakan sebelumnya 5 kali.
Pembekuan selama setiap presentasi isyarat cahaya 30 detik diukur. Kamar itu disemprot dengan cuka 50% untuk membersihkan
sela-sela tikus.

Konsentrasi protein pengikat lipopolisakarida plasma. Darah diambil 24 jam setelah

pengobatan kemoterapi akhir (n=10/kelompok). Tikus dibius menggunakan isofluran dan tabung kapiler berlapis heparin
digunakan untuk mengumpulkan 100-200 l darah dari vena retro-orbital. Seluruh darah disentrifugasi selama 20 menit
pada 2.500 rpm pada 4 ° C dan plasma dikumpulkan dan disimpan pada -80 ° C. Sampel plasma diencerkan

Laporan Ilmiah | (2019) 9:16490 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-52893-0 11

www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports

1:500 dengan buffer pengenceran dan dijalankan dalam rangkap dua dalam ELISA sesuai dengan instruksi pabrik
(Hycult Biotech, Wayne, PA, USA). Semua sampel melebihi batas deteksi minimum (0,8 ng/ml) dan variasi intra-
assay <10%.

Koleksi tisu. Semua jaringan dikumpulkan selama fase gelap (1600-2100 jam). Untuk analisis histologis, tikus di-eutanasia
dengan CO2, darah dikumpulkan secara transkardial, kemudian tikus diperfusi dengan 30ml PBS diikuti oleh 30 ml
paraformaldehida (PFA) 4% setelah mengeluarkan saluran pencernaan. Darah dikumpulkan dalam jarum suntik berlapis heparin
dan disimpan di atas es. Seluruh darah kemudian disentrifugasi selama 20 menit pada 2.500 rpm pada suhu 4 ° C dan plasma
dikumpulkan dan disimpan pada suhu -80 ° C untuk analisis sitokin. Otak dikeluarkan dan disimpan pada suhu 4 ° C dalam PFA 4%
selama 24 jam sebelum dicuci tiga kali dengan PBS dan kemudian dipindahkan ke larutan sukrosa 30% selama 24 jam, atau sampai
otak tenggelam. Otak kemudian dibekukan dalam isopentana dan disimpan pada suhu -80 °C. Panjang dan massa usus besar
diukur sebelum mengeluarkan bagian sekitar 1 cm dari segmen proksimal dan distal. Setengah dari bagian ini dipotong
memanjang, difiksasi dalam metakarn selama 24 jam, dan kemudian disematkan dalam parafin untuk analisis morfologi. Isi kolon
dihilangkan dengan alat yang disterilkan. Isi kolon dan separuh segmen usus besar lainnya dibekukan di atas es kering dan
disimpan pada suhu -80 ° C sebelum isolasi DNA dan RNA (n = 8-10 / kelompok).
Untuk analisis qRT-PCR inflamasi otak (n = 9-10/kelompok), tikus di-eutanasia melalui pemenggalan kepala yang cepat
baik 6 jam atau 3 hari setelah injeksi terakhir. Otak dikeluarkan dan hipotalamus dibedah dan flash dibekukan. Sisa otak
dibelah dua secara sagital dan diawetkan dalam RNA Kemudian pada suhu 4 ° C sampai hippocampus dan korteks frontal
dibedah (1–3 hari kemudian). Semua sampel otak yang dibedah disimpan pada suhu -80 ° C sampai RNA diekstraksi.

Konsentrasi plasma sitokin/kemokin. Konsentrasi sitokin dan kemokin yang bersirkulasi (IL-1β, IL-6, TNFα,
CXCL1 [KC/GRO]) diukur menggunakan 4-plex fluorescent immunoassays (Meso Scale Discovery, Rockville, MD,
USA) yang dipilih berdasarkan hubungannya dengan kemoterapi dan komorbiditas perilaku dan dijalankan
sesuai dengan instruksi pabrik. Sampel plasma (n=10-20/kelompok) diencerkan dua kali lipat, dijalankan dalam
rangkap dua, dan dianalisis menggunakan instrumen QuickPlex SQ (Meso Scale Discovery). Nilai di bawah batas
deteksi dilaporkan sebagai konsentrasi 0 pg/ml (IL-1β: n=3/20 kendaraan, n=4/19 kemo; IL-6: n = 4/20 kendaraan,
n = 5/19 kemo ). Variasi intra-assay adalah <10% untuk Il-1β, IL-2, Il-6, dan CXCL1 dan <15% untuk TNFα.

Rt-pcR kuantitatif. Total RNA diekstraksi dari hipotalamus, korteks frontal, dan hipokampus (n=9-10/kelompok)
menggunakan kit mini Qiagen RNaeasy (Qiagen, Germantown, MD, USA) dan ditranskripsi terbalik seperti yang
dilaporkan sebelumnya86. Ekspresi sitokin/kemokin pro-inflamasi (Il-1β, Il-6, Tnf, Il-2, dan Cxcl1) di otak dinilai
berdasarkan penelitian sebelumnya (Pyter dkk., 2017) dan hasil sitokin yang beredar. Ekspresi gen relatif dinormalisasi
menjadiGapdh dan lipat-perubahan dihitung relatif terhadap masing-masing kontrol yang dirawat dengan kendaraan
menggunakan metode CT komparatif (2-ΔΔCT). Untuk segmen kolon, RNA total diekstraksi dengan TRIzol ™
reagen (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) seperti yang dijelaskan oleh pabrikan. Ekspresi gen dariIl-1β,
Il-6, Tnf, Il-2, Cxcl1, dan matriks metaloproteinase 9 (Mmp9), yang terkenal karena perannya dalam remodeling jaringan,
dinormalisasi menggunakan metode kurva standar relatif dan dinormalisasi menjadi faktor elongasi translasi eukariotik 2
(Eef2)88.

Imunohistokimia. Otak dipotong pada 25 m menggunakan cryostat dan disimpan dalam cryoprotectant di
20 °C sampai pewarnaan. Bagian mengambang bebas diblokir dengan serum keledai normal 0,5% selama 1 jam pada
suhu kamar dan diwarnai dengan kelinci anti-Iba-1 (1:1000; Wako Chemicals, Richmond, VA, USA), kelinci anti-P2ry12
(1:1000 ; AnaSpec Inc., Fremont, CA, USA), atau anti-GFAP kambing (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) semalaman
pada suhu 4 °C. Penanda mikroglial P2ry12 dinilai sebagai ukuran yang menguatkan hasil Iba-1 dan GFAP digunakan
untuk memberi label astroglia. Bagian dicuci dan diinkubasi dengan antibodi sekunder Alexa Fluor 488 atau Alexa Fluor
594, dipasang, dan ditutup dengan menggunakan media pemasangan yang larut dalam air. Gambar korteks prefrontal,
nukleus paraventrikular, dentate gyrus, dan CA3 dari hippocampus, daerah otak yang mengatur kognisi dan penyakit
serta perilaku seperti kecemasan, diperoleh menggunakan mikroskop EVOS 2 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
USA) dan perangkat lunak pada perbesaran 20X. ImageJ digunakan untuk menentukan persen area pewarnaan dengan
ambang batas yang menutupi badan sel dan proses sambil mengecualikan pewarnaan latar belakang. Jumlah mikroglia/
mm2 ditentukan dengan menghitung dan rata-rata Iba-1+ sel dari 2 bagian/tikus (n= 8–9 tikus/kelompok) di setiap wilayah
oleh 3 peneliti buta.
Sekitar 1 cm jaringan kolon dikumpulkan dari bagian proksimal dan distal, dipotong secara proksimal ke distal, dan
dibersihkan dari digesta. Jaringan yang dihasilkan difiksasi dalam metakarn, tertanam dalam parafin, dan dipotong menjadi bagian
4 m sebelum pewarnaan hemotoxylin dan eosin pada slide mikroskop kaca bermuatan positif. Slide dicitrakan secara digital pada
platform Aperio AT Turbo, dan diukur menggunakan perangkat lunak Aperio ImageScope (Leica Biosystems Imaging, Vista, CA,
USA) oleh seorang peneliti yang buta terhadap kelompok perlakuan. Kedalaman ruang bawah tanah dari 10 ruang bawah tanah
yang berorientasi baik (satu garis inti epitel kontinu terlihat dari dasar [sisi muskularis mukosa] ke ujung [sisi luminal]) diukur
dengan menggambar garis melalui inti dalam 3-9 bagian dan dirata-ratakan dalam subjek untuk perbandingan statistik.

Urutan dan analisis gen bakteri 16S rRNA. Total DNA diekstraksi dari tinja dan kolon
isi (sampel mikrobiotal yang paling mudah diakses secara klinis) menggunakan QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit dengan
sedikit modifikasi pada instruksi pabrik (Qiagen, Germantown, MD, USA). Sampel diinkubasi selama 45 menit pada suhu
37 °C dalam buffer lisozim (22 mg/ml lisozim, 20 mM TrisHCl, 2 mM EDTA, 1,2% Triton-x, pH 8,0), ditambahkan butiran
zirkonia 0,1 mm, kemudian dihomogenkan selama 150 detik . Sampel diinkubasi pada suhu 95 °C selama 5 menit dengan
Buffer InhibitEX, kemudian diinkubasi pada suhu 70 °C selama 10 menit dengan Proteinase K dan Buffer AL. Penutup,
protokol isolasi QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit dilanjutkan pada tahap etanol. DNA diukur dengan Qubit

Laporan Ilmiah | (2019) 9:16490 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-52893-0 12

www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports

2.0 Fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, CA) menggunakan dsDNA Broad Range Assay Kit. Sampel diencerkan
hingga 5 ng/μl dan dikirim ke Molecular and Cellular Imaging Center (MCIC) di Wooster, OH untuk persiapan
perpustakaan. Urutan akhir berpasangan (250 nt maju dan mundur) dari wilayah hipervariabel V4-V5 16 S rRNA dihasilkan
pada Illumina MiSeq. Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) 2.0 digunakan untuk pemrosesan amplikon,
kontrol kualitas dengan DADA2, dan penetapan taksonomi hilir menggunakan database SILVAv13289. Urutan dalam
sampel dijernihkan untuk menyeimbangkan penyertaan sampel sebanyak mungkin tanpa mengorbankan kedalaman
baca (setelah pemeriksaan visual kurva penghalusan alfa, sampel dengan kurang dari sepertiga jumlah rata-rata
pembacaan dalam situs tersebut dikeluarkan). Sampel tinja dijernihkan hingga 2.000 pembacaan (3 sampel kemoterapi
dijatuhkan), sampel kolon proksimal dijernihkan menjadi 5.250 pembacaan (tidak ada sampel yang dijatuhkan), dan
sampel usus distal dijernihkan hingga 5.000 pembacaan (4 sampel kendaraan dijatuhkan). Perbedaan taksonomi tingkat
fitur ditentukan dengan menggunakan tes Wilcoxon, dan hubungan metadata melalui korelasi Spearman dalam
perangkat lunak statistik JMP v13.0.0 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Pengujian hipotesis berganda FDR dikoreksi di R
(R Foundation for Statistical Computing, Wina, Austria).90.

Analisis statistik. Analisis statistik massa organ, konsentrasi protein, ekspresi gen, dan perilaku dianalisis
menggunakan Student's T-tes ketika varians adalah normal; jika tidak, tes Mann-Whitney nonparametrik digunakan.
Tindakan berulang ANOVA digunakan untuk menganalisis perubahan massa tubuh dan asupan makanan, serta
penggerak di lapangan terbuka dan pembekuan dari waktu ke waktu untuk pengkondisian rasa takut. Signifikansi
statistik dilaporkan ketikaP ≤ 0,05. Perangkat lunak Statview versi 5.0.1 (Scientific Computing, Cary, NC, USA) digunakan
untuk semua statistik kecuali untuk analisis pengurutan yang disebutkan di atas.

Diterima: 28 Juni 2019; Diterima: 24 Oktober 2019;

Diterbitkan: xx xx xxxx

Referensi
1. Massie, MJ Prevalensi depresi pada pasien kanker. J Natl Cancer Inst Monogr, 57–71, https://doi.org/10.1093/
jncimonographs/lgh014 (2004).
2. Mehnert, A. dkk. Prevalensi empat minggu gangguan mental pada pasien dengan kanker di seluruh entitas tumor utama.J Clin Oncol 32,
3540–3546, https://doi.org/10.1200/jco.2014.56.0086 (2014).
3. Lawrence, DP, Kupelnick, B., Miller, K., Devine, D. & Lau, J. Bukti laporan terjadinya, penilaian, dan pengobatan kelelahan pada
pasien kanker. J Natl Cancer Inst Monogr, 40–50, https://doi.org/10.1093/jncimonographs/lgh027 (2004).
4. Benson, AB 3rd dkk. Pedoman yang direkomendasikan untuk pengobatan diare akibat pengobatan kanker.J Clin Oncol 22,
2918–2926, https://doi.org/10.1200/jco.2004.04.132 (2004).
5. Gripp, S. dkk. Prediksi kelangsungan hidup pada pasien kanker yang sakit parah dengan perkiraan klinis, tes laboratorium, dan kecemasan dan depresi
yang dinilai sendiri.J.klin. Onkol.25, 3313–3320, https://doi.org/10.1200/JCO.2006.10.5411 (2007).
6. Onitilo, AA, Nietert, PJ & Egede, LE Pengaruh depresi pada semua penyebab kematian pada orang dewasa dengan kanker dan efek diferensial oleh
situs kanker. Jenderal Hosp. Psikiatri28, 396–402, https://doi.org/10.1016/j.genhosppsych.2006.05.006 (2006).
7. Raison, CL & Miller, AH Depresi pada kanker: perkembangan baru mengenai diagnosis dan pengobatan. Psikiatri Biol 54, 283–
294 (2003).
8. Spiegel, D. & Giese-Davis, J. Depresi dan kanker: mekanisme dan perkembangan penyakit. Biol. Psikiatri54, 269–282 (2003).
9. O'Brien, BJ dkk. Dampak mual dan muntah terkait kemoterapi pada status fungsional pasien dan biaya: survei lima
pusat Kanada.Cmajo 149, 296–302 (1993).
10. Osoba, D. dkk. Pengaruh mual dan muntah pascakemoterapi pada kualitas hidup yang berhubungan dengan kesehatan. Komite Kontrol Kualitas
Hidup dan Gejala dari National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group.Dukung Perawatan Kanker 5, 307–313 (1997).
11. Mustian, KM dkk. Pengobatan Mual dan Muntah Selama Kemoterapi.Hematol Oncol AS 7, 91–97 (2011).
12. Eiseman, JL dkk. Farmakokinetik plasma dan distribusi jaringan paclitaxel pada tikus CD2F1.Farmakoterapi Kemoterapi Kanker 34, 465–471
(1994).
13. Fellner, S. dkk. Transportasi paclitaxel (Taxol) melintasi sawar darah-otakin vitro dan in vivo. J Clin Invest 110, 1309–1318,https://
doi.org/10.1172/jci15451 (2002).
14. Bigotte, L. & Olsson, Y. Efek sitotoksik adriamycin pada sistem saraf pusat tikus-sitofluoresensi dan pengamatan
elektronmikroskopik setelah berbagai mode pemberian. Acta Neurol Scand Suppl 100, 55–67 (1984).
15. Tangpong, J. dkk. Toksisitas sistem saraf pusat yang diinduksi oleh adriamycin, TNF-alpha.Neurobiol Dis 23, 127–139, https://
doi.org/10.1016/j.nbd.2006.02.013 (2006).
16. Kesler, SR Jaringan mode default sebagai biomarker potensial cedera otak terkait kemoterapi. Neurobiol. penuaan35(Lampiran 2), S11–19,
https://doi.org/10.1016/j.neurobiolaging.2014.03.036 (2014).
17. Nelson, CJ, Nandy, N. & Roth, AJ Kemoterapi dan defisit kognitif: mekanisme, temuan, dan intervensi potensial.Perawatan
paliatif & suportif 5, 273–280 (2007).
18. Collins, SM, Surette, M. & Bercik, P. Interaksi antara mikrobiota usus dan otak. Nat Rev Microbiol 10, 735–742,https://
doi.org/10.1038/nrmicro2876 (2012).
19. Dinan, TG & Cryan, JF Mikroba, Imunitas, dan Perilaku: Psikoneuroimunologi Memenuhi Mikrobioma.
Neuropsikofarmakologi 42, 178–192, https://doi.org/10.1038/npp.2016.103 (2017).
20. Bercik, P. dkk. Mikrobiota usus memengaruhi tingkat pusat faktor dan perilaku neurotropik yang diturunkan dari otak pada tikus.
Gastroenterologi 141, 599–609, 609 e591–593, https://doi.org/10.1053/j.gastro.2011.04.052 (2011).
21. Desbonnet, L. dkk. Penipisan mikrobiota usus dari masa remaja awal pada tikus: Implikasi untuk otak dan perilaku.Otak. Perilaku
kekebalan., https://doi.org/10.1016/j.bbi.2015.04.004 (2015).
22. Frohlich, EE dkk. Gangguan kognitif oleh dysbiosis usus yang diinduksi antibiotik: Analisis komunikasi mikrobiota-otak usus.Otak. Perilaku
kekebalan., https://doi.org/10.1016/j.bbi.2016.02.020 (2016).
23. Gareau, MG dkk. Infeksi bakteri menyebabkan disfungsi memori yang diinduksi stres pada tikus.Usus 60, 307–317, https://doi.org/10.1136/
gut.2009.202515 (2011).
24. Diaz Heijtz, R. dkk. Mikrobiota usus normal memodulasi perkembangan dan perilaku otak.Prok. Natal akad. Sci. Amerika Serikat108, 3047–3052,https://
doi.org/10.1073/pnas.1010529108 (2011).
25. Neufeld, KA, Kang, N., Bienenstock, J. & Foster, JA Pengaruh mikrobiota usus pada perilaku seperti kecemasan. Biologi komunikatif &
integratif 4, 492–494, https://doi.org/10.4161/cib.4.4.15702 (2011).
26. Zheng, P. dkk. Remodeling mikrobioma usus menginduksi perilaku seperti depresi melalui jalur yang dimediasi oleh metabolisme inang.
mol. Psikiatri21, 786–796, https://doi.org/10.1038/mp.2016.44 (2016).
27. Stringer, AM dkk. Mucositis yang diinduksi irinotecan yang bermanifestasi sebagai diare berhubungan dengan perubahan flora usus dan
profil musin.Int. J. Eks. Patol.90, 489–499, https://doi.org/10.1111/j.1365-2613.2009.00671.x (2009).

Laporan Ilmiah | (2019) 9:16490 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-52893-0 13

www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports

28. Von Bultzingslowen, I., Adlerberth, I., Wold, AE, Dahlen, G. & Jontell, M. Mikroflora oral dan usus pada tikus yang diobati dengan 5-
fluorouracil, translokasi ke kelenjar getah bening serviks dan mesenterika dan efek bakteri probiotik. Mikrobiol oral. kekebalan.18, 278–
284 (2003).
29. Montassier, E. dkk. Pirosequencing gen 16S rRNA mengungkapkan pergeseran mikrobiota feses pasien selama kemoterapi dosis tinggi
sebagai rejimen pengkondisian untuk transplantasi sumsum tulang.Mikrob. Ekol.67, 690–699, https://doi.org/10.1007/s00248-013-0355-4
(2014).
30. Stringer, AM dkk. Biomarker diare yang diinduksi kemoterapi: studi klinis perubahan mikrobioma usus, peradangan dan
matriks metaloproteinase yang bersirkulasi.Dukung Perawatan Kanker 21, 1843–1852, https://doi.org/10.1007/s00520-013-
1741-7 (2013).
31. van Vliet, MJ dkk. Pengobatan kemoterapi pada pasien anak dengan leukemia myeloid akut yang menerima profilaksis antimikroba
mengarah pada peningkatan relatif kolonisasi dengan bakteri yang berpotensi patogen di usus.klinik Menulari. Dis.49, 262–270, https://
doi. org/10.1086/599346(2009).
32. Zwielehner, J. dkk. Perubahan mikrobiota tinja manusia akibat kemoterapi dianalisis dengan TaqMan-PCR, 454 sekuensing dan sidik jari
PCR-DGGE.PloS satu 6, e28654, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0028654 (2011).
33. Montassier, E. dkk. Disbiosis yang digerakkan oleh kemoterapi dalam mikrobioma usus.Aliment Pharmacol Ada 42, 515–528, https://doi.
org/10.1111/apt.13302(2015).
34. Jordan, KR, Loman, BR, Bailey, MT & Pyter, LM Interaksi mikrobiota-imun-otak usus dalam komorbiditas perilaku
terkait kemoterapi. Kanker 124, 3990–3999, https://doi.org/10.1002/cncr.31584 (2018).
35. Bajic, JE, Johnston, IN, Howarth, GS & Hutchinson, MR Dari Bawah-Up: Kemoterapi dan Disregulasi Sumbu Usus-Otak.
Neurosci Perilaku Depan 12, 104, https://doi.org/10.3389/fnbeh.2018.00104 (2018).
36. Blumberg, R. & Powrie, F. Mikrobiota, penyakit, dan kembali ke kesehatan: perjalanan metastabil. Sci Transl Med 4, 137rv137, https://doi.
org/10.1126/scitranslmed.3004184(2012).
37. Rea, K., Dinan, TG & Cryan, JF Mikrobioma: Pengatur utama stres dan peradangan saraf. Stres Neurobiol 4, 23–33,https://
doi.org/10.1016/j.ynstr.2016.03.001 (2016).
38. Santos, JC & Pyter, LM Neuroimmunology dari Komorbiditas Perilaku Terkait Dengan Kanker dan Perawatan Kanker. Imunol
Depan 9, 1195, https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.01195 (2018).
39. Vichaya, EG dkk. Mekanisme toksisitas perilaku yang diinduksi kemoterapi.Neurosci depan 9, 131, https://doi.org/10.3389/
fnins.2015.00131 (2015).
40. Norden, DM dkk. Ibuprofen memperbaiki perilaku seperti kelelahan dan depresi pada tikus pembawa tumor.Ilmu Kehidupan 143, 65–70, https://
doi.org/10.1016/j.lfs.2015.10.020 (2015).
41. Rowinsky, EK & Donehower, RC Farmakologi klinis paclitaxel (Taxol). Semin Oncol 20, 16–25 (1993).
42. Gangloff, A. dkk. Estimasi biodistribusi dan penyerapan paclitaxel dalam xenograft yang diturunkan dari manusiain vivo dengan 18F-fluoropaclitaxel.
Jurnal Kedokteran Nuklir 46, 1866–1871 (2005).
43. Ray, MA, Trammell, RA, Verhulst, S., Ran, S. & Toth, LA Pengembangan model tikus untuk menilai kelelahan selama kemoterapi.
Comp Med 61, 119-130 (2011).
44. Bower, JE Peran interaksi neuro-imun dalam kelelahan terkait kanker: Faktor dan mekanisme risiko biobehavioral. Kanker125,
353–364, https://doi.org/10.1002/cncr.31790 (2019).
45. MacDonald, N. Kanker cachexia dan menargetkan peradangan kronis: pendekatan terpadu untuk pengobatan kanker dan perawatan
paliatif / suportif. J Support Oncol 5, 157-162; diskusi 164-156, 183 (2007).
46. Morris, G., Berk, M., Maes, M. & Walder, K. Central jalur menyebabkan kelelahan pada penyakit neuro-inflamasi dan autoimun.
Obat BMC 13, https://doi.org/10.1186/s12916-014-0259-2 (2015).
47. Pusztai, L. dkk. Perubahan kadar plasma sitokin inflamasi sebagai respons terhadap kemoterapi paclitaxel.Sitokin 25, 94-102
(2004).
48. Quan, N. Percakapan mendalam: spektrum dan kinetika jalur aferen neuroimun. Kekebalan Perilaku Otak 40, 1–8, https://doi. org/
10.1016/j.bbi.2014.02.006(2014).
49. Yang, M. dkk. Kemungkinan keterlibatan galektin-3 dalam aktivasi mikroglial di hipokampus dengan pengobatan trimetiltin.Neurochem
Int 61, 955–962, https://doi.org/10.1016/j.neuint.2012.09.015 (2012).
50. Paquet, C. dkk. Pengaruh obat anti-kanker pada mikroglia pada model tikus xenografted kanker payudara yang diturunkan dari pasien.Neuropatologi
37, 91–93, https://doi.org/10.1111/neup.12323 (2017).
51. Seiger, R. dkk. Methotrexate menurunkan proliferasi sel hipokampus dan menginduksi defisit memori pada tikus.Perilaku Otak Res 201,
279–284, https://doi.org/10.1016/j.bbr.2009.02.025 (2009).
52. Seiger, R. dkk. Perubahan neurobiologis oleh agen sitotoksik pada tikus.Perilaku Otak Res 299, 19–26, https://doi.org/10.1016/j.
bbr.2015.10.057(2016).
53. Zhang, H., Yoon, SY & Dougherty, PM Bukti bahwa astrosit tulang belakang tetapi tidak mikroglia berkontribusi pada patogenesis
neuropati nyeri yang diinduksi Paclitaxel. J Sakit 13, 293–303, https://doi.org/10.1016/j.jpain.2011.12.002 (2012).
54. Ruiz-Medina, J., Baulies, A., Bura, SA & Valverde, O. Paclitaxel-induced nyeri neuropatik bergantung pada usia dan bergantung pada
respon glial. Eur J Pain 17, 75–85, https://doi.org/10.1002/j.1532-2149.2012.00172.x (2013).
55. Tchessalova, D., Posillico, CK & Tronson, NC Aktivasi Neuroimun Mendorong Beberapa Keadaan Otak. Front Syst Neurosci 12, 39,https://
doi.org/10.3389/fnsys.2018.00039 (2018).
56. Christie, LA dkk. Gangguan fungsi kognitif dan neurogenesis hipokampus setelah kemoterapi kanker.Clin Kanker Res 18, 1954–
1965, https://doi.org/10.1158/1078-0432.ccr-11-2000 (2012).
57. Salas-Ramirez, KY dkk. Doksorubisin dan siklofosfamid menginduksi disfungsi kognitif dan mengaktifkan jalur pensinyalan ERK
dan AKT.Perilaku Otak Res 292, 133–141, https://doi.org/10.1016/j.bbr.2015.06.028 (2015).
58. Yang, M. dkk. Pengobatan akut dengan metotreksat menginduksi disfungsi hippocampal pada model tikus kanker payudara.Brain Res Bull
89, 50–56, https://doi.org/10.1016/j.brainresbull.2012.07.003 (2012).
59. Huehnchen, P., Boehmerle, W., Springer, A., Freyer, D. & Endres, M. Terapi pencegahan baru untuk defisit kognitif yang diinduksi
paclitaxel: bukti praklinis dari tikus C57BL/6. Psikiatri Terjemahan 7, e1185, https://doi.org/10.1038/tp.2017.149 (2017).
60. Meehan, CJ & Beiko, RG Pandangan filogenomik spesialisasi ekologi di lachnospiraceae, keluarga bakteri terkait saluran
pencernaan. Biologi dan Evolusi Genom 6, 703–713, https://doi.org/10.1093/gbe/evu050 (2014).
61. Mackos, AR dkk. Keparahan stres sosial yang ditingkatkan dari kolitis yang diinduksi Citrobacter rodentium bergantung pada CCL2 dan dilemahkan
oleh probiotik Lactobacillus reuteri.mukosa. Imunologi 9, 515–526, https://doi.org/10.1038/mi.2015.81 (2016).
62. Fierer, J., Swancutt, MA, Heumann, D. & Golenbock, D. Peran protein pengikat lipopolisakarida dalam resistensi terhadap infeksi
Salmonella pada tikus. Jurnal Imunologi (Baltimore, Md.: 1950) 168, (6396–6403 (2002).
63. Dekaney, CM, Gulati, AS, Garrison, AP, Helmrath, MA & Henning, SJ Regenerasi sel induk/progenitor usus setelah
pengobatan doxorubicin pada tikus. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 297, G461–470, https://doi.org/10.1152/
ajpgi.90446.2008 (2009).
64. Rigby, RJ dkk. Bakteri usus diperlukan untuk kerusakan usus yang diinduksi doksorubisin tetapi tidak untuk apoptosis yang diinduksi
doksorubisin.Mikroba usus 7, 414–423, https://doi.org/10.1080/19490976.2016.1215806 (2016).
65. Sarmento, OF dkk. Peran Baru untuk Kruppel-like Factor 14 (KLF14) dalam Diferensiasi Sel T-Regulatory.Gastroenterologi dan Hepatologi
Seluler dan Molekuler 1, 188–202.e184, https://doi.org/10.1016/j.jcmgh.2014.12.007 (2015).

Laporan Ilmiah | (2019) 9:16490 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-52893-0 14

www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports

66. Boschetti, G. dkk. Peradangan usus pada tikus memicu proliferasi dan fungsi sel T regulator Foxp3+ mukosa tetapi
mengganggu konversinya dari sel T CD4+.Jurnal Crohn dan Kolitis 11, 105–117, https://doi.org/10.1093/ecco-jcc/jjw125 (2017).
67. Wang, L. dkk. Peradangan Sistemik yang Diinduksi Doksorubisin Didorong oleh Peningkatan Regulasi Reseptor Seperti TLR4 dan Kebocoran
Endotoksin.Res Kanker 76, 6631–6642, https://doi.org/10.1158/0008-5472.can-15-3034 (2016).
68. Melichar, B. dkk. Permeabilitas gastrointestinal pada pasien kanker ovarium dan kanker payudara yang diobati dengan paclitaxel dan platinum.kanker
BMC 7, 155, https://doi.org/10.1186/1471-2407-7-155 (2007).
69. Louis, P. & Flint, HJ Pembentukan propionat dan butirat oleh mikrobiota kolon manusia. Mikrobiol Lingkungan 19, 29–41, https://doi.org/
10.1111/1462-2920.13589 (2017).
70. Canani, RB dkk. Potensi efek menguntungkan dari butirat pada penyakit usus dan ekstraintestinal.Jurnal Gastroenterologi Dunia17, 1519–
1528, https://doi.org/10.3748/wjg.v17.i12.1519 (2011).
71. Flint, HJ, Scott, KP, Duncan, SH, Louis, P. & Forano, E. Degradasi mikroba karbohidrat kompleks dalam usus. Mikroba
usus 3, 289–306 (2012).
72. Loy, A. dkk. Gaya hidup dan evolusi yang dimediasi transfer gen horizontal dari Mucispirillum schaedleri, anggota inti mikrobiota usus
murine.mSistem 2, https://doi.org/10.1128/mSystems.00171-16 (2017).
73. Chichlowski, M. & Hale, LP Interaksi bakteri-mukosa pada penyakit radang usus: aliansi menjadi buruk. Jurnal Fisiologi Amerika.
Fisiologi Gastrointestinal Dan Hati295, G1139–G1149, https://doi.org/10.1152/ajpgi.90516.2008 (2008).
74. Tian, T., Wang, Z. & Zhang, J. Patomekanisme Stres Oksidatif pada Penyakit Radang Usus dan Terapi Antioksidan Potensial.
Obat Oksidatif Dan Umur Panjang Seluler 2017, 4535194–4535194, https://doi.org/10.1155/2017/4535194 (2017).
75. Lee, JY dkk. Efek suplementasi probiotik 12 minggu pada kualitas hidup penderita kanker kolorektal: uji coba double-
blind, acak, terkontrol plasebo.Penyakit pencernaan dan hati: jurnal resmi Perhimpunan Gastroenterologi Italia dan
Asosiasi Italia untuk Studi Hati 46, 1126–1132, https://doi.org/10.1016/j.dld.2014.09.004 (2014).
76. Kiecolt-Glaser, JK dkk. Tekanan perkawinan, depresi, dan usus bocor: Translokasi endotoksin bakteri sebagai jalur menuju
peradangan.Psikoneuroendokrinologi 98, 52–60, https://doi.org/10.1016/j.psyneuen.2018.08.007 (2018).
77. Ohlsson, L. dkk. Biomarker usus bocor dalam depresi dan perilaku bunuh diri.Acta Psychiatr Scand 139, 185–193, https://doi.
org/10.1111/acps.12978(2019).
78. Jiang, C. dkk. Uji coba probiotik acak, double-blind, terkontrol plasebo untuk mengurangi keparahan mukositis oral yang disebabkan oleh
kemoradioterapi untuk pasien dengan karsinoma nasofaring.Kanker 125, 1081–1090, https://doi.org/10.1002/cncr.31907(2019).

79. Wang, H., Geier, MS & Howarth, GS Prebiotik: Strategi Perawatan Potensial untuk Usus yang Rusak Kemoterapi? Crit Rev Food
Sci Nutr 56, 946–956, https://doi.org/10.1080/10408398.2012.741082 (2016).
80. Trindade, LM dkk. Pemberian oral Simbioflora(R) (sinbiotik) melemahkan kerusakan usus pada model tikus dengan mukositis yang
diinduksi 5-fluorouracil.Manfaat Mikroba 9, 477–486, https://doi.org/10.3920/bm2017.0082 (2018).
81. NRC. (ed. Dewan Riset Nasional) (The National Academies Press, Washington DC, 2011).
82. Heimans, JJ dkk. Paclitaxel (Taxol) konsentrasi dalam jaringan tumor otak.Ann. Onkol.5, 951–953 (1994).
83. Collins, B., MacKenzie, J., Tasca, GA, Scherling, C. & Smith, A. Efek kognitif kemoterapi pada pasien kanker payudara: studi
dosisrespons. Psikoonkologi. 22, 1517–1527, https://doi.org/10.1002/pon.3163 (2013).
84. Kesler, SR dkk. Konektivitas jaringan mode default membedakan penyintas kanker payudara yang diobati dengan kemoterapi dari kontrol.Prok. Natal
akad. Sci. Amerika Serikat110, 11600–11605, https://doi.org/10.1073/pnas.1214551110 (2013).
85. Pomykala, KL dkk. Hubungan antara sitokin pro-inflamasi, metabolisme otak regional, dan keluhan kognitif setelah kemoterapi
ajuvan untuk kanker payudara.Perilaku Pencitraan Otak 7, 511–523, https://doi.org/10.1007/s11682-013-9243-2(2013).

86. Pyter, LM dkk. Model hewan pengerat baru dari kelangsungan hidup kanker payudara dengan perilaku dan peradangan seperti kecemasan yang terus-menerus.
Perilaku Otak Res 330, 108–117, https://doi.org/10.1016/j.bbr.2017.05.011 (2017).
87. Takeuchi, H., Yatsugi, S. & Yamaguchi, T. Pengaruh YM992, Antidepresan Novel Dengan Penghambat Serotonin Re-uptake Selektif dan
Aktivitas Antagonis Reseptor 5-HT(2A), pada Uji Perilaku Penguburan Marmer sebagai Model Gangguan Obsesif-Kompulsif. Jpn J
Pharmacol 90, 197–200 (2002).
88. Eissa, N., Kermarrec, L., Ghia, JE, Hussein, H. & Bernstein, CN Kesesuaian gen referensi untuk menormalkan messenger RNA pada tikus
2,4-dinitrobenzene sulfonat acid (DNBS)-induced colitis menggunakan real kuantitatif waktu PCR. Laporan Ilmiah 7,https://doi.org/
10.1038/srep42427 (2017).
89. Quast, C. dkk. Proyek basis data gen RNA ribosom SILVA: Peningkatan pemrosesan data dan alat berbasis web.Penelitian Asam Nukleat 41
, D590–D596, https://doi.org/10.1093/nar/gks1219 (2013).
90. Shannon, P. dkk. Cytoscape: lingkungan perangkat lunak untuk model terintegrasi dari jaringan interaksi biomolekuler.Penelitian Genom
13, 2498–2504 (2003).

Ucapan Terima Kasih

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Drs. Jessica Dos Santos dan Robert Wesolowski, Kyle Sullivan, Selina Vickery,
Savannah Bever, Ashley Lahoud, dan Jasskiran Kaur untuk bantuan teknis. Pekerjaan ini didukung oleh Pusat Medis
Universitas Negeri Ohio dan hibah NIH CA216290 (LP, MB) dan persekutuan NIH T32, DE014320 (BL).

Kontribusi penulis
Semua penulis memenuhi kriteria kepengarangan, telah menyetujui artikel akhir dan semua yang berhak atas
kepengarangan terdaftar sebagai penulis. Peran masing-masing penulis diuraikan sebagai berikut: (1) konsepsi dan
desain penelitian, atau perolehan data, atau analisis dan interpretasi data: BL; KJ; BH; MB; LP, (2) menyusun artikel atau
merevisinya secara kritis untuk konten intelektual yang penting: BL; KJ; BH; MB; LP, (3) persetujuan akhir atas versi BL
yang akan diajukan; KJ; BH; MB; LP

Kepentingan bersaing
Para penulis menyatakan tidak ada kepentingan yang bersaing.

Informasi tambahan
Korespondensi dan permintaan bahan harus ditujukan ke LMPCetak
ulang dan informasi izin tersedia di www.nature.com/reprints.
Catatan penerbit Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi dalam peta yang diterbitkan dan
afiliasi institusional.

Laporan Ilmiah | (2019) 9:16490 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-52893-0 15

www.nature.com/scientificreports/ www.nature.com/scientificreports

Akses terbuka Artikel ini dilisensikan di bawah Lisensi Internasional Creative Commons Attribution 4.0,
yang mengizinkan penggunaan, berbagi, adaptasi, distribusi, dan reproduksi dalam media atau
format, selama Anda memberikan kredit yang sesuai kepada penulis asli dan sumbernya, berikan tautan ke lisensi
Creative Commons, dan tunjukkan jika ada perubahan. Gambar atau materi pihak ketiga lainnya dalam artikel ini
termasuk dalam lisensi Creative Commons artikel, kecuali dinyatakan lain dalam batas kredit untuk materi tersebut. Jika
materi tidak termasuk dalam lisensi Creative Commons artikel dan penggunaan yang Anda maksudkan tidak diizinkan
oleh peraturan perundang-undangan atau melebihi penggunaan yang diizinkan, Anda harus mendapatkan izin langsung
dari pemegang hak cipta. Untuk melihat salinan lisensi ini, kunjungihttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

© Penulis 2019

Laporan Ilmiah | (2019) 9:16490 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-52893-0 16