Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

DASAR
KROMATOGRAFI

Tri Rini Nuringtyas

Laboratorium Biokimia
[Biologi
 pon dari
Asal Biologis
Menggunakan:

● Suhu ekstrem
● pH ekstrim
● Pelarut organik – untuk protein
● Oksidator / pereduksi
harus dihindari

Kondisi fisik yang ekstrim dapat:

● Mengubah struktur molekul secara ireversibel
● Menghancurkan biologis apa pun aktivitas
Kromatografi
Teknik ini memanfaatkan perbedaan
sifat fisik dasar:
●Massa
●Ukuran
●Membentuk
●Mengenakan biaya
●Efek adsorpsi
 Definisi
teknik pemisahan berdasarkan perbedaan
interaksi senyawa dengan dua fase, a
fase gerak dan fase diam, sebagai
senyawa berjalan melalui pendukung
sedang.
 komponen
• fase gerak: pelarut yang mengalir melalui
media pendukung

• fase diam: lapisan atau pelapis pada

media pendukung yang berinteraksi
dengan analit

• media pendukung: permukaan padat di

mana fase diam terikat atau dilapisi
Macam-Macam Kromatografi

●Filtrasi Gel
●Kromatografi Adsorpsi
●Kromatografi Pertukaran Ion
●Kromatografi Partisi
●Kromatografi Kertas
●Kromatografi Lapis Tipis
●Kromatografi Gas
●Kromatografi gas-cair
●Kromatografi gas-padat
Filtrasi Gel
Filtrasi Gel (lanjutan)
Kromatografi Afinitas

metode pemisahan berdasarkan makromolekul yang sangat

spesifikinteraksi pengikatan antara biomolekul dan zat lain

Jenis spesifik dari interaksi pengikatan tergantung pada

biomolekul yang diinginkan. Contoh:
• antigen dan antibodi,
• enzim dan substrat,
• reseptor dan ligan,
ligan melekat pada matriks
padat yang tidak larut:
• agarosa atau
• poliakrilamida

dimodifikasi secara kimia menjadi

memperkenalkan reaktif
gugus fungsi dengan
dimana ligan dapat bereaksi,
membentuk stabil
ikatan kovalen
Kromatografi Afinitas
Kromatografi Adsorpsi

• adsorpsi benar-benar berbeda dari

penyerapan.
• Di sini molekul teradsorpsi ke permukaan
namun molekul tidak akan menjadi bagian dari
bagian ini.
• Kromatografi adsorpsi didasarkan pada
interaksi antara molekul zat terlarut dan
situs aktif pada fase diam.
Kromatografi Adsorpsi

• berdasarkan interaksi antara molekul terlarut dan situs

aktif pada fase diam.
• Keterikatan atau interaksi ini tergantung pada polaritas zat
terlarut.
• Teknik ini membuktikan pernyataan bahwa “kutub seperti
kutub”
Kromatografi Adsorpsi
(lanjutan)

Reservoir pelarut

Disk kertas saring

penyerap

Resin atau fase diam:

Benang halus dari kaca
▪ Alumina
▪ silika gel
Mengumpulkan tabung
Kromatografi Adsorpsi
(lanjutan)

kolom prepack
kromatografi
Kromatografi kolom skala laboratorium
Kromatografi Pertukaran Ion

Pertukaran ion reversibel dalam larutan dengan ion yang terikat

secara elektrostatik ke matriks yang tidak larut atau fase diam

memisahkan ion dan molekul polar berdasarkan afinitas mereka terhadap

itu ion penukar.

skala laboratorium kolom komersial Pertukaran ion modern

kromatografi
Kromatografi Pertukaran Ion

– +

– + – – +
+ + –
+ – – +
+ –
+ – +
– – +

Penukar ANION Penukar KASI

dengan dapat ditukar dengan dapat ditukar
melawan ion melawan ion
Kromatografi Pertukaran Ion

+
Terikat menjadi puncak Ion dapat dielusi oleh dua
+ –– +
–+ cara:
– –
+ +

sebuah. Ganti ion yang menarik dengan muatan yang lebih kuat /
lebih tinggi - sehingga ion yang menarik akan terelusi

B. Ubah pH pelarut / fase gerak sehingga molekul

yang diinginkan menjadi netral→ dielusi

Resin: polisteren, selulosa

Kromatografi Pertukaran Ion (lanjutan)
Kromatografi Partisi
Dua macam Kromatografi Partisi:
● Kromatografi Kertas
● Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi Partisi → untuk senyawa yang

larut dalam air dan pelarut organik

Kromatografi Adsorpsi → untuk senyawa yang mudah

larut dalam cairan organik tetapi sedikit larut dalam
air

Kromatografi Pertukaran Ion → untuk senyawa larut air

yang dapat terionisasi
Kromatografi Kertas
Berdasarkan arah aliran pelarut:
● Kromatografi Naik
● Kromatografi Turun
● Kromatografi Melingkar

Jarak migrasi X
RF =
Jarak yang dipindahkan oleh pelarut
Kromatografi Naik
Kromatografi Turun
Kromatografi Melingkar
Kromatografi lapis ini
● Metode ini sangat cepat (banyak pemisahan dapat diselesaikan dalam
waktu kurang dari satu jam)

● Bintik-bintiknya sangat padat (sehingga dimungkinkan untuk

mendeteksi senyawa pada konsentrasi rendah)

● Pemisahan senyawa jauh lebih baik daripada

kromatografi kertas
● Senyawa yang terpisah dapat dideteksi
menggunakan semprotan korosif pada suhu tinggi
Kromatografi lapis ini
(lanjutan)
Kromatografi lapis ini
(lanjutan)
Alkaloid menggunakan
Triterpen & steroid
dragendorf

Fenolik + FeCl3
Kromatografi lapis tipis
 pemisahan 2D
Pemisahan 1D-TLC senyawa
Thymi Oleum. Fase gerak:
toluena dan etil asetat
(97,5 : 2,5 v/v). Tidak
menggunakan
vanillin dalam etanol.
Kromatografi Gas
Kromatografi Gas (lanjutan)
● Metode ini pertama kali dijelaskan oleh James dan Martein
(1952), dan telah berkembang sangat pesat

● Ini adalah metode terbaik untuk pemisahan

senyawa biologis

● Kelebihan GC:
● Pemisahan yang sangat baik
● Waktu (analisis singkat)
● Sampel kecil diperlukan (pikogram)
● Sistem deteksi yang baik
● Dianalisa secara kuantitatif
Prinsip

(gas)

FASE SELULER

Sampel Sampel
di keluar

FASE STASIUN
(padat atau cairan berat dilapisi ke sistem padat atau pendukung)
Kromatografi Gas (lanjutan)
Kromatografi gas (GC) adalah metode yang disukai, hanya
berlaku untuk zat yang mudah menguap

Di GC → fase gerak adalah gas, fase diam dapat

berupa:
Padat → Gas Solid Chomatography (GSC)
Cairan → Gas Liquid Chomatography (GLC) Dalam

GLC, dukungan padat dilapisi cairan

Kromatografi Gas (lanjutan)

Kromatografi gas (GC) pada dasarnya terdiri dari

suplai gas, kolom dan detektor
 Waktu Retensi/Indeks
• Waktu retensi (RT) adalah waktu yang dibutuhkan
oleh analit untuk melewati kolom
• RT dipengaruhi oleh senyawa, kolom (dimensi dan
fase diam), laju aliran, tekanan, pembawa, suhu.

• Membandingkan RT dari sampel standar dengan yang tidak

diketahui memungkinkan ID senyawa
Kromatografi Gas (lanjutan)
●Pasokan gas terdiri dari:
●Silinder gas kemurnian tinggi di bawah tekanan tinggi
●Gas bisa berupa nitrogen, helium, dll.
●Perangkat pengatur tekanan
●Perangkat pengatur aliran
●Alat pengukur aliran

●Kolom:
●Kaca/baja tahan karat
●Mengandung dukungan solid (GSC)
●Dukungan padat dilapisi cairan (GLC)
Kromatografi Gas (lanjutan)

●Detektor adalah beberapa perangkat yang

menghasilkan perubahan sinyal listrik sebagai respons
terhadap zat terlarut saat keluar dari kolom

●Kebanyakan detektor membutuhkan penguatan

sinyal elektronik (elektrometer)
●Jenis detektor:
●Detektor ionisasi api (FID)
●Detektor fosfor nitrogen (NPD)
●Detektor penangkapan elektron (ECD)
●Detektor fotometrik api (FPD)
Kromatografi Gas
Peralatan
●Port injeksi → contoh pengantar
●Manual - Injeksi Langsung
●Otomatis - Autosampler
Peralatan (lanjutan)
●Oven → Pengatur suhu
●isotermal
●gradien

240

200

160

Suhu (derajat C)
120

80

40

0
0 10 20 30 40 50 60
Waktu (menit)
Peralatan (lanjutan)
●Kolom

Penuh sesak

Kapiler
Kromatografi Gas
GC-Kolom

polisiloksan
Peralatan (lanjutan)
●Detektor
●Destruktif
●Spektral Massa (CI/EI)
●Ionisasi Api (FID)
●Nitrogen-Fosfor (NPD)
●Fotometri Api (FPD)
●Konduktivitas Elektrolit (Aula/ELCD)

●Tidak merusak
●Konduktivitas Termal (TCD)
●Penangkapan Elektron (ECD)
●Foto Ionisasi (PID)
Penerapan GC dan TLC
Penerapan GC dan TLC
(lanjutan)
 Keuntungan LC dibandingkan dengan GC:

1.) LC dapat diterapkan untuk pemisahan senyawa

apa pun yang larut dalam fase cair.
LC lebih berguna dalam pemisahan senyawa
biologis, polimer sintetik atau alami, dan
senyawa anorganik

2.) Fase gerak cair memungkinkan LC digunakan pada suhu yang lebih
rendah daripada yang dibutuhkan oleh GC
LC lebih cocok daripada GC untuk memisahkan senyawa yang
mungkin labil secara termal
3.) Retensi zat terlarut dalam LC bergantung
pada interaksinya dengan fase gerak dan
fase diam.
•Retensi GC berdasarkan volatilitas
dan interaksi dengan fase diam
•LC lebih fleksibel dalam mengoptimalkan pemisahan
→ mengubah fase diam atau fase
gerak
4.) Sebagian besar detektor LC tidak merusak
•kebanyakan detektor GC bersifat merusak
•LC lebih cocok untuk pemisahan preparatif
atau skala proses

Kekurangan LC dibandingkan dengan GC:

1.) LC tunduk pada puncak atau pelebaran pita yang

lebih besar.

koefisien difusi zat terlarut yang jauh lebih besar

dalam gas vs. cairan
 Kromatografi cair
Klasifikasi Jenis
• Klasifikasi berdasarkan tekanan:
– Tekanan rendah (berbasis gravitasi, preparatif)
– Tekanan sedang (tekanan dari gas terkompresi dalam "kromatografi
flash" atau dari pompa bertekanan rendah, juga terutama
preparatif)
– Tekanan tinggi (kinerja tinggi atau HPLC)
– Tekanan ultra-tinggi (UPLC)

• Klasifikasi berdasarkan mekanisme pemisahan:

– Fase normal (fase diam polar, fase gerak kurang polar)
– Fase terbalik (fase diam non-polar, fase gerak lebih polar)

– Kromatografi eksklusi ukuran (pemisahan molekul berdasarkan

ukuran)
• Istilah “Kromatografi Fasa Terbalik” digunakan
karena RP adalah bentuk kromatografi partisi di
mana fase ikatan kimia bersifat hidrofobik atau
non-polar (misalnya gugus oktadesil), dan fase
gerak awal (misalnya air) harus lebih polar
daripada fase diam. .

• Ini “berbalik” dari kromatografi fase normal di

mana fase diam adalah polar atau hidrofilik dan
fase gerak awal lebih non-polar atau hidrofobik
daripada fase diam, maka istilah “Kromatografi
Fase Terbalik””.
… Terima kasih …