Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Jurnal Patologi
J Pathol 2019; 247: 381–391 KERTAS ASLI
Diterbitkan online 25 Januari 2019 di Perpustakaan Online Wiley
(wileyonlinelibrary.com) DOI: 10.1002/jalur.5197

Identifikasi dan validasi DOCK4 sebagai biomarker potensial untuk

risiko perkembangan metastasis tulang pada pasien dengan kanker
payudara dini
Jules A Westbrook1,2, Steven L Wood1,2, David A Cairns2,3, Kathryn McMahon4, Renu Gahlaut4, Helene
Thygesen4, Mike Shires4, Stephanie Roberts2, Helen Marshall3, Maria R Oliva1, Mark J Dunning5, Andrew M
Hanby4, Peter J Selby2,4, Valerie Speirs4,6 , Georgia Mavria4, Robert E Coleman1
dan Janet E Brown1,2*
1 Departemen Onkologi dan Metabolisme, Unit Akademik Onkologi Klinis, Universitas Sheffield, Sheffield, Grup
2 Proteomik Klinis dan Biomedis Inggris, Institut Kanker dan Patologi Leeds, Universitas Leeds, Leeds, Unit Penelitian
3 Uji Klinis Inggris, Institut Penelitian Uji Klinis Leeds , Universitas Leeds, Leeds, Inggris
4 Institut Kanker dan Patologi Leeds, Universitas Leeds, Leeds, Inggris Institut Ilmu
5 Saraf Terjemahan Sheffield, Universitas Sheffield, Sheffield, Institut Ilmu Kedokteran
6 Inggris, Universitas Aberdeen, Aberdeen, Inggris

* Korespondensi dengan: JE Brown, Departemen Onkologi dan Metabolisme, Unit Akademik Onkologi Klinis, Universitas Sheffield, Rumah Sakit Weston Park,
Whitham Road, Sheffield S10 2SJ, Inggris. Email: jebrown@sheffield.ac.uk

Abstrak
Metastasis ke tulang terjadi pada sekitar 75% kanker payudara stadium lanjut, dengan penyakit yang tidak dapat disembuhkan setelah
sel kanker menyebar ke tulang, tetapi masih ada kebutuhan yang belum terpenuhi untuk biomarker untuk mengidentifikasi pasien
dengan risiko tinggi kekambuhan tulang. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi biomarker tersebut dan menilai kegunaannya
dalam memprediksi respons terhadap asam zoledronat ajuvan (zoledronate). Kami menggunakan proteomik kuantitatif (pelabelan
isotop stabil oleh asam amino dalam spektrometri massa kultur sel; SILAC-MS) untuk membandingkan ekspresi protein dalam varian
bone-homing (BM1) dari lini sel kanker payudara manusia MDA-MB-231 dengan non parental -bone-homing cell untuk mengidentifikasi
biomarker baru untuk risiko metastasis tulang berikutnya pada kanker payudara dini. SILAC-MS menunjukkan bahwa dedikator protein
sitokinesis 4 (DOCK4) diregulasi dalam sel BM1 pembentuk tulang, dikonfirmasi oleh western blotting. Sel BM1 juga memiliki kemampuan
invasif yang ditingkatkan dibandingkan dengan sel induk, yang dapat dikurangi dengan DOCK4-shRNA. Dalam microarray jaringan
pelatihan (TMA) yang terdiri dari 345 pasien dengan kanker payudara dini, imunohistokimia diikuti oleh regresi Cox mengungkapkan
bahwa ekspresi DOCK4 yang tinggi berkorelasi dengan tingkat histologis (P = 0,004 tetapi bukan status reseptor estrogen (P = 0,19) atau
keterlibatan kelenjar getah bening (P = 0,15). Validasi klinis TMA menggunakan sampel jaringan dan database klinis dari studi ajuvan
AZURE besar (n = 689). Analisis regresi Cox yang disesuaikan menunjukkan bahwa ekspresi DOCK4 yang tinggi pada kelompok kontrol
(tanpa zoledronate) secara signifikan prognostik untuk kekambuhan pertama di tulang (HR 2.13, 95%CI 1.06–4.30,P = 0,034). Tidak ada
hubungan yang sesuai ditemukan pada pasien yang menerima zoledronate (HR 0,812, 95% CI 0,176-3,76,P = 0,790), menunjukkan bahwa
pengobatan dengan zoledronate dapat melawan risiko yang lebih tinggi untuk kekambuhan tulang dari tumor yang mengekspresikan
DOCK4 tinggi. Ekspresi DOCK4 yang tinggi tidak terkait dengan metastasis ke situs non-skeletal ketika ini dinilai secara kolektif.
Kesimpulannya, DOCK4 yang tinggi pada kanker payudara dini secara signifikan terkait dengan penyakit agresif dan dengan metastasis
tulang di masa depan dan merupakan biomarker yang berpotensi berguna untuk risiko metastasis tulang selanjutnya.

© 2018 Penulis. Jurnal Patologi diterbitkan oleh John Wiley & Sons Ltd atas nama Pathological Society of Great Britain and
Ireland.

Kata kunci: DOCK4; metastasis tulang; kanker payudara; penanda biologis; proteomik

Diterima 29 April 2018; Direvisi 4 Oktober 2018; Diterima 30 Oktober 2018

Pernyataan konflik kepentingan: Janet Brown menerima bayaran dari Novartis dan Amgen untuk dewan penasihat dan biro pembicara; Rob Coleman
menerima biaya konsultasi dari Amgen, Astellas dan Boehringer Ingelheim, dan biaya kuliah dari Amgen. Semua penulis lain menyatakan tidak ada konflik.

Baris hak cipta untuk artikel ini diubah pada 9 Juli 2019 setelah publikasi online asli.

pengantar dari dormansi tumor. Agen yang menargetkan tulang, seperti

Meskipun kemajuan substansial dalam deteksi dini dan
pengobatan, kanker payudara masih menyumbang 15% dari
kematian terkait kanker wanita, dengan metastasis tulang terjadi
di lebih dari 70% pasien dengan penyakit lanjut [1]. Kekambuhan
pada tulang biasanya terjadi bertahun-tahun setelah pengobatan
kanker payudara dini yang tampaknya berhasil dan suatu periode
bifosfonat [2] dan denosumab [3], secara luas digunakan
untuk mengobati komplikasi tulang dari metastasis tulang
yang sudah ada, tetapi juga baru-baru ini menjadi fokus dari
beberapa penelitian ajuvan besar pada kanker payudara dini
untuk menilai potensinya. untuk mengurangi frekuensi
kekambuhan pada tulang dan kematian akibat kanker
payudara. Uji coba AZURE fase III (BIG01/04-ISRCTN79831382)

© 2018 Penulis. Jurnal Patologi diterbitkan oleh John Wiley & Sons Ltd atas nama Pathological Society of Great Britain and Ireland. Ini adalah artikel akses
terbuka di bawah persyaratan Lisensi Atribusi Creative Commons, yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi dalam media apa pun, asalkan
karya aslinya dikutip dengan benar.
382
merekrut 3360 pasien dengan kanker payudara stadium II/III
yang diacak (1:1) hingga 5 tahun terapi ajuvan standar saja
(kontrol) atau terapi standar dengan asam zoledronat
(zoledronate) [4]. Meskipun tidak ada perbedaan yang signifikan
dalam kelangsungan hidup bebas penyakit invasif (DFS) pada
populasi secara keseluruhan, zoledronate meningkatkan hasil
penyakit untuk wanita yang>5 tahun pascamenopause saat
diagnosis dan meta-analisis dari 26 percobaan acak (n = 18 766)
menunjukkan bahwa kekambuhan tulang (HR = 0,72; 95%CI 0,60,
0,86, 2P = 0,0002) dan kematian akibat kanker payudara (HR 0,82;
95%CI 0,73, 0,93, 2P = 0,002) dikurangi dengan bifosfonat ajuvan
pada wanita pascamenopause [5]. Praktik kanker payudara telah
berubah sebagai hasil dari penelitian ini, tetapi mereka juga
menyoroti kebutuhan yang tidak terpenuhi untuk biomarker
untuk mengidentifikasi pasien dengan kanker payudara dini yang
paling berisiko mengembangkan kekambuhan tulang, sehingga
memungkinkan penyesuaian pengobatan untuk pasien yang
mungkin akan mendapat manfaat dan menyelamatkan pasien
yang tidak akan mendapat manfaat dari komplikasi potensial [6].
Studi proteomik menghasilkan informasi kunci tentang
metastasis kanker payudara ke tulang [7-9] dan, dalam studi
berbasis proteomik baru-baru ini, divalidasi pada 571 pasien, kami
menunjukkan bahwa protein CAPG dan GIPC1 memiliki potensi
prognostik dan prediktif sebagai biomarker tulang. metastasis
[10]. Dalam penelitian saat ini, kami berhipotesis bahwa protein,
yang diidentifikasi oleh proteomik dan diregulasi dalam sel kanker
payudara yang memiliki kecenderungan untuk menjadi rumah
bagi tulang, akan menjadi biomarker potensial untuk metastasis
dan dapat memainkan peran mekanistik kunci dalam proses
penyebaran metastasis ke tulang.
Bahan dan metode
Studi proteomik
(Lihat materi pelengkap, materi dan metode pelengkap
dan Gambar S1 untuk lebih jelasnya).
Kultur sel dan pelabelan isotop stabil oleh asam amino
dalam kultur sel (SILAC)
Garis sel kanker payudara manusia MDA-MB-231 (sel
kontrol orang tua [PCC] diperoleh awalnya dari ATCC,
Teddington, Middlesex, Inggris) dan varian tulang-
homing (BM1, sel metastasis tulang) [11] (disediakan
oleh Profesor Joan Massagué, Sloan-Kettering Institute,
New York, NY, USA) digunakan dalam percobaan SILAC
'klasik' [12,13]. Sel PCC dan BM1 dikultur dalam
medium SILAC 'berat' dan medium 'ringan' selama
kurang lebih 10 kali lipat untuk memastikan>95%
penggabungan label isotop (media berat); semua sel
digunakan dalam 10 kali lipat. Media SILAC 'berat'
terdiri dari DMEM yang mengandungL-arginin (13C6, 15n
4) dan L-lisin (13C6, 15n2) (R10K8, DMEM-15, Dundee Cell
Products, Dundee, UK) dilengkapi dengan FBS (D-
FBS100, Dundee Cell Products) yang didialisis (10 kDa
batas berat molekul). Media 'ringan' adalah DMEM
tetapi tanpa isotop berat (R0K0) dan dengan 10%
dialisa (10 kDa MWCO) FBS.
© 2018 Penulis. Jurnal Patologi diterbitkan oleh John Wiley & Sons Ltd atas
nama Pathological Society of Great Britain and Ireland. www.pathsoc.org
JA Westbrook dkk
LC–MS/MS
Jumlah protein yang sama (40 g) dari sampel berlabel
ringan dan berat digabungkan, direduksi, dialkilasi dan
dipisahkan pada gel SDS-PAGE 1D. Kromatografi cair
spektrometri massa tandem (LC-MS/MS) dilakukan oleh
Dundee Cell Products. Sepuluh iris protein gel-resolved
dipotong dan protein dicerna menjadi peptida
menggunakan tripsin. Peptida triptik dipisahkan
menggunakan nanoflow LC-System yang digabungkan
ke spektrometer massa LTQ-Orbitrap (ThermoFisher
Scientific, Warrington, UK).
Kuantisasi dan analisis bioinformatika
Kuantisasi dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Max
Quant (http://www.maxquant.org/downloads.htm), dengan rasio
peptida dihitung untuk setiap peptida yang mengandung arginin
dan/atau lisin sebagai area puncak arginin/lisin berlabel dibagi
dengan area puncak arginin/lisin yang tidak berlabel untuk setiap
spektrum massa pemindaian tunggal. Rasio peptida untuk semua
peptida yang mengandung arginin dan lisin yang diurutkan untuk
setiap protein dirata-ratakan. Keluaran data dari Max Quant
dianalisis lebih lanjut menggunakan Excel dan R (v. 3.2, http://
www.r-project.org/) untuk memilih protein yang diekspresikan
secara berbeda.
noda barat
Ekspresi diferensial dari dedicator protein sitokinesis 4
(DOCK4), dan konfirmasi knockdown DOCK4, dinilai dalam
lisat sel menggunakan western blotting dan sistem
imunodeteksi inframerah (IR) (LI-COR Biosciences, Lincoln,
NE, USA), serta seperti oleh ECL (Promega, Southampton,
Inggris). Antibodi utama yang digunakan adalah: DOCK4
(Abcam, Cambridge, UK; ab56743, monoklonal tikus, 0,1 g/
ml); beta-tubulin (Abcam; ab6046, poliklonal kelinci,
pengenceran 1:5000). Antibodi sekunder adalah:
#925-68070 IRDye 680RD kambing anti-tikus IgG (H + L),
LI-COR Biosciences, pengenceran 1:5000, untuk
mendeteksi DOCK4 di saluran 700 nm (merah);
#925-32211 IRDye 800CW kambing anti-kelinci IgG (H + L),
LI-COR Biosciences, pengenceran 1:5000, untuk
mendeteksi beta-tubulin di saluran 800 nm (hijau). Untuk
ECL, antibodi sekunder adalah kambing anti-tikus-HRP
(Abcam; ab6789) dan kambing anti-kelinci-HRP (Abcam;
ab6721), keduanya 1:2500. Data densitometrik yang
dinormalisasi dari enam pengulangan sampel
imunoprobe antibodi fluoresen (dan tiga noda dari sampel
yang divisualisasikan ECL), diuji signifikansinya
menggunakan Student'sT-tes.
Generasi garis sel dengan knockdown
DOCK4 yang stabil dan uji invasi 3D
Ekspresi DOCK4 dirobohkan dalam garis sel BM1 dan PCC
dengan pengiriman lentiviral dari shRNA yang divalidasi
yang menargetkan DOCK4, dengan menggunakan vektor
kosong (vektor kontrol) sebagai kontrol [14]. Sel tipe liar
juga dipelajari sebagai kontrol. Penyertaan GFP
J Pathol 2019; 247: 381–391
www.thejournalofpathology.com
DOCK4 dalam metastasis tulang kanker payudara
protein penanda dalam vektor lentiviral memungkinkan
pemisahan penyortiran sel teraktivasi Fluoresensi (FACS)
dari klon pembawa vektor dan kultur selanjutnya dari
populasi sel murni. Sel yang terinfeksi dipilih dengan FACS
menyortir 48 jam setelah infeksi lentiviral. Konfirmasi
knockdown ekspresi protein DOCK4 dilakukan dengan
western blotting seperti dijelaskan di atas. Kuantifikasi
noda dilakukan dengan pemindaian densitometrik.
Untuk mempelajari efek penurunan ekspresi protein
DOCK4 di PCC dan BM1, uji invasi dilakukan
menggunakan platform IncuCyte® (Essen BioScience,
Welwyn Garden City, UK) mengikuti instruksi pabrik
untuk prosedur 'luka gores'. Singkatnya, sumur
rangkap tiga dari pelat ImageLock 96-sumur (Essen
BioScience 4379) dilapisi dengan Matrigel tipis di mana
sel vektor kontrol tipe liar, atau sel PCC yang
diperlakukan dengan shRNA (50.000 sel/sumur) dan
garis sel BM1 ( 100.000 sel/sumur) diunggulkan dan
goresan homogen dibuat menggunakan alat
Incucyte® WoundMaker saat monolayer sel menyatu.
Sistem ini memungkinkan penilaian invasi sel dan
kemampuan migrasi dalam satu pengujian. Invasi /
migrasi sel dinilai dengan mengukur penutupan
goresan yang diperkenalkan pada monolayer sel
konfluen. Eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga
menggunakan kultur sel independen. Data dianalisis
menggunakan software IncuCyte® dan Excel.
Pasien, sampel dan imunohistokimia
Semua analisis pada sampel pasien dilakukan dengan
persetujuan etika (set pelatihan Leeds, 06/Q1206/180;
set validasi AZURE 55/03/182).
Studi awal ekspresi DOCK4 dilakukan menggunakan
microarray jaringan pelatihan (TMA) yang terdiri dari 345
spesimen dengan tipe tumor yang ditentukan, tingkat,
reseptor estrogen (ER), kelenjar getah bening dan data
kelangsungan hidup secara keseluruhan, dari tumor
payudara yang didiagnosis di Leeds Teaching Hospitals
NHS Trust ( 1987–2005). Sampel diwarnai menggunakan
antibodi DOCK4 poliklonal kelinci (1:100, Bethyl
Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA; A302-263A) dan
dikuatkan dalam kelompok yang lebih kecil dengan
antibodi monoklonal tikus (1:50, Abcam; ab56743). Rincian
tambahan disediakan dalam materi pelengkap, materi
pelengkap dan metode.
Analisis utama untuk korelasi dengan risiko metastasis
tulang dilakukan pada TMA yang dibuat dari tumor primer
dari subset pasien dalam keseluruhan uji coba AZURE (n =
689). Karena prevalensi hasil metastatik tulang yang relatif
tinggi dan tindak lanjut yang lama (median 84 bulan
[kisaran interkuartil 66–93]), TMA ini menyediakan sumber
yang sangat baik untuk validasi biomarker protein yang
muncul dari studi proteomik kami. Ekspresi protein dinilai
menggunakan antibodi Bethyl DOCK4 (A302-263A).
Spesifisitas DOCK4 untuk antibodi ini dikonfirmasi oleh
imunohistokimia menggunakan parafin tertanam formalin
© 2018 Penulis. Jurnal Patologi diterbitkan oleh John Wiley & Sons Ltd atas
nama Pathological Society of Great Britain and Ireland. www.pathsoc.org
383
(FFPE) pelet sel dari sel BM1 dengan dan tanpa knockdown
DOCK4 (lihat bahan tambahan, Gambar S2). Gambar gel
penuh untuk antibodi menggunakan ECL sebagai metode
visualisasi dengan menggunakan garis sel kontrol positif
dan negatif disertakan dalam bahan tambahan, Gambar
S3.
Gambar digital dari inti TMA yang diimunisasi dibuat
menggunakan pemindai digital (Aperio Scan Scope XT,
Milton Keynes, UK). Penilaian pewarnaan sitoplasma di
margin invasif tumor payudara primer dilakukan
secara independen oleh dua operator terlatih, yang
tidak mengetahui data hasil, di bawah pengawasan
ahli histopatologi payudara (AMH) berpengalaman
yang juga memutuskan skor yang tidak sesuai. Tingkat
kesesuaian kedua skor diukur dengan menggunakan
koefisien kappa Cohen. Semua skor didasarkan pada
intensitas pewarnaan dan bukan jumlah sel positif.
Intensitas pewarnaan diberi peringkat berdasarkan
sistem kategoris ordinal tiga tingkat yang digunakan
untuk menentukan peringkat tumor berdasarkan
intensitas pewarnaan sitoplasma [15,16], di mana 1 =
pewarnaan lemah; 2 = pewarnaan sedang, mudah
dirasakan; 3 = pewarnaan kuat/intens, mis
Analisis statistik
Semua analisis imunohistokimia mengikuti pedoman REMARK
[17]. Analisis statistik mengevaluasi hubungan antara ekspresi
protein dan variabel klinis dan patologis yang relevan
(misalnya status ER/PR/HER2) menggunakan uji eksak Fisher
(variabel kategoris) dan uji Kruskal-Wallis (variabel kontinu),
sebelum menilai hubungan prognostik dan prediktif dengan
waktu data -ke-peristiwa (waktu untuk kekambuhan jauh
pertama, waktu untuk kekambuhan tulang pertama, waktu
untuk kekambuhan non-skeletal pertama) menggunakan
regresi bahaya proporsional Cox, perkiraan Kaplan-Meier dari
fungsi kelangsungan hidup dan uji log-rank. Waktu untuk
kekambuhan jauh pertama didefinisikan sebagai waktu dari
tanggal pengacakan hingga tanggal kekambuhan jauh. Dalam
analisis, jenis acara lain disensor, mis jika kekambuhan lokal
terjadi sebelum kekambuhan jauh, pasien akan disensor pada
tanggal kekambuhan lokal. Waktu untuk kekambuhan tulang
pertama dan kekambuhan non-skeletal pertama didefinisikan
sama. Waktu untuk kekambuhan tulang pertama terlepas dari
semua kekambuhan sebelumnya juga diselidiki. Analisis
waktu ke peristiwa pertama kali dilakukan dalam kelompok
pengobatan untuk mengidentifikasi hubungan prognostik
dengan biomarker. Heterogenitas efek prediktif antara
kelompok pengobatan untuk waktu hingga kejadian yang
jauh dinilai dalam analisis multivariabel dengan memasukkan
istilah interaksi dalam regresi bahaya proporsional Cox untuk
kelompok pengobatan dan biomarker (sambil menyesuaikan
untuk rencana terapi sistemik, status ER dan keterlibatan
kelenjar getah bening). Semua uji signifikansi dilakukan dua
sisi dan dinyatakan signifikan pada tingkat 5%.
J Pathol 2019; 247: 381–391
www.thejournalofpathology.com
384
Hasil
Identifikasi protein protein yang secara khusus
terkait dengan metastasis tulang kanker payudara
Protein yang diidentifikasi dalam eksperimen pelabelan 'maju'
dan 'timbal balik' (lihat bahan tambahan, Gambar S1)
disejajarkan dan data yang paling kuat dan berkualitas tinggi
diekstraksi untuk analisis menggunakan kriteria seleksi ketat
berikut: protein yang diidentifikasi di kedua set data; ≥2 yang
disebut pisau cukur+peptida unik yang ditugaskan untuk
identifikasi (mengklarifikasi penugasan identifikasi protein);
jumlah yang sama dari peptida dan pisau cukur + peptida unik
yang ditugaskan untuk identifikasi. Ini menghasilkan protein
tahun 2006 yang diambil untuk analisis dari total 2999 yang
diidentifikasi dalam kumpulan data lengkap. (Data proteomik
lengkap tersedia di database ORDA yang dapat diakses publik:
https://orda.shef.ac.uk/.)
Kumpulan data yang disejajarkan disaring lebih lanjut dengan menggunakan a
Cut-off 1,75 kali lipat untuk membedakan perubahan (naik atau turun) dalam ekspresi protein,
menghasilkan 48 protein yang diregulasi dalam BM1 relatif terhadap sel PCC (lihat bahan
tambahan, Tabel S1). Ini diprioritaskan untuk studi lebih lanjut menggunakan bukti literatur
relevansi dengan metastasis tulang, besarnya perubahan lipatan ekspresi diferensial dan bukti (jika
tersedia) non-asosiasi dengan metastasis paru, berdasarkan korelasi dengan dataset proteomik
kami yang lain yang menyertakan MDA- Varian MB-231, yang secara khusus menampung paru-
paru [10,11]. Ini memungkinkan kami untuk mengidentifikasi protein yang mungkin terlibat dalam
metastasis kanker payudara ke tulang. Akibatnya, empat protein memiliki potensi untuk
dipertimbangkan lebih lanjut: DOCK4 (perubahan lipat 2.7), SerpinB2 (perubahan lipatan 15.6),
protein siklus pembelahan sel 20 homolog (CDC20, perubahan lipatan 3.7), dan pericentrin
(perubahan lipatan 2.5). Meskipun keempatnya telah menerbitkan bukti yang menghubungkannya
dengan kanker payudara, kami fokus pada DOCK4 untuk penyelidikan lebih lanjut dan validasi
klinis berdasarkan perannya yang dipublikasikan dalam migrasi sel, termasuk migrasi sel kanker
payudara, metastasis [18-21] dan tumor angiogenesis [14], proses yang dikenal sebagai bagian
integral dari penyebaran sel tumor dan perkembangan metastasis tulang. Selain itu, DOCK4
berfungsi sebagai faktor pertukaran nukleotida guanin untuk GTPase Rac1, pengatur utama
motilitas [14,19,20] dan terlokalisasi pada tonjolan kaya aktin dalam migrasi sel kanker payudara
[19], sementara SNP dalam wilayah promotor termasuk migrasi sel kanker payudara, metastasis
[18-21] dan tumor angiogenesis [14], proses yang diketahui merupakan bagian integral dari
penyebaran sel tumor dan perkembangan metastasis tulang. Selain itu, DOCK4 berfungsi sebagai
faktor pertukaran nukleotida guanin untuk GTPase Rac1, pengatur utama motilitas [14,19,20] dan
terlokalisasi pada tonjolan kaya aktin dalam migrasi sel kanker payudara [19], sementara SNP
dalam wilayah promotor termasuk migrasi sel kanker payudara, metastasis [18-21] dan tumor
angiogenesis [14], proses yang diketahui merupakan bagian integral dari penyebaran sel tumor
dan perkembangan metastasis tulang. Selain itu, DOCK4 berfungsi sebagai faktor pertukaran
nukleotida guanin untuk GTPase Rac1, pengatur utama motilitas [14,19,20] dan terlokalisasi pada
tonjolan kaya aktin dalam migrasi sel kanker payudara [19], sementara SNP dalam wilayah
promotordok4 telah terdeteksi pada kanker payudara [22].
Konfirmasi upregulasi DOCK4 dalam sel BM1
Analisis tingkat ekspresi DOCK4 dengan western blotting
di garis sel BM1 dan PCC menunjukkan peningkatan dua
kali lipat dalam ekspresi DOCK4 di dalam garis sel BM1
bone-homing dibandingkan dengan PCC (Gambar 1A, C).
Peningkatan ekspresi DOCK4 dalam lisat sel total sel BM1
juga dikonfirmasi menggunakan visualisasi berbasis ECL.
© 2018 Penulis. Jurnal Patologi diterbitkan oleh John Wiley & Sons Ltd atas
nama Pathological Society of Great Britain and Ireland. www.pathsoc.org
JA Westbrook dkk
DOCK4 diregulasi selama motilitas sel kanker
payudara
Ada knockdown yang signifikan dari ekspresi protein DOCK4
dalam tipe sel BM1 setelah pengiriman lentiviral DOCK4
shRNA dibandingkan dengan kontrol vektor kosong (vektor
kontrol) (Gambar 1B, D). Dalam uji penyembuhan luka, sel
BM1 (vektor kontrol) telah meningkatkan kemampuan invasif
dan migrasi dibandingkan dengan sel PCC, dengan 13 dan
39% penutupan luka pada 6 dan 12 jam, masing-masing,
dibandingkan dengan 9 dan 20% untuk PCC pada 6 dan 12
jam, masing-masing (Gambar 1E, F). Invasi melalui Matrigel
berkurang dalam sel dengan DOCK4 knockdown (shRNA)
dibandingkan dengan kontrol, dengan perbedaan yang
signifikan dalam penutupan luka diamati untuk kedua jenis
sel pada 6 dan 12 jam, dan dengan efek yang lebih besar
terlihat pada 6 jam.
Hubungan antara ekspresi DOCK4 dan tingkat tumor
dalam susunan tumor payudara lokal
Ekspresi DOCK4 awalnya dinilai dalam susunan tumor
payudara lokal dari 345 tumor payudara yang tidak dipilih
(88% duktal, 9% lobular, 3% lainnya) dengan data pasien
tersedia pada tingkat tumor (18% tingkat 1, 44% tingkat 2,
tingkat 38% 3), ER dan keterlibatan kelenjar getah bening
aksila. Contoh pola pewarnaan yang khas ditunjukkan
pada Gambar 2. Analisis mengungkapkan hubungan yang
signifikan antara ekspresi DOCK4 dan tipe tumor
histologis (P = 0,002) dan tingkat tumor (P = 0,004 dengan
86,4% grade 3 dan 77,3% grade 2 karsinoma duktal
mengekspresikan DOCK4 sedang/tinggi (berlawanan
dengan 62,5% karsinoma grade 1), tetapi tidak ada
hubungan dengan status ER (positif versus negatif, P =
0,185) atau status kelenjar getah bening (terlibat versus
tidak terlibat, P = 0,15). Data ini menunjukkan bahwa
ekspresi DOCK4 dikaitkan dengan agresivitas tumor dan
selanjutnya mendukung pemilihan DOCK4 kami untuk
validasi klinis dalam kohort pasien AZURE.
Validasi klinis ekspresi DOCK4 pada pasien
kanker payudara dalam studi AZURE
Skor independen dari TMA yang diwarnai oleh dua operator
terlatih (JW dan SR) di bawah pengawasan AMH menghasilkan
nilai koefisien kappa Cohen sebesar 0,86, menandakan
kesepakatan yang sangat baik. Kemungkinan hubungan
antara hasil klinis dan skor imunohistokimia untuk DOCK4
diuji untuk 689 pasien dalam penelitian AZURE (330 kelompok
kontrol, 359 kelompok zoledronate). Data demografi untuk
pasien ini serupa dengan seluruh populasi AZURE (Tabel 1).
DOCK4 tidak memiliki hubungan yang signifikan dengan usia,
keterlibatan kelenjar getah bening, status ER, tingkat tumor
(meskipun ini mendekati signifikansi,P = 0,062), status
menopause, terapi sistemik, kemoterapi dan penggunaan
statin. Status HER2 bukanlah penilaian yang diamanatkan
tetapi tersedia untuk 307 peserta. DOCK4 secara signifikan
terkait dengan status HER2, dengan proporsi yang lebih kecil
dari pasien dengan DOCK4 rendah menjadi HER2 positif (p <
0,001). Namun, penyesuaian untuk status HER2 telah
J Pathol 2019; 247: 381–391
www.thejournalofpathology.com
DOCK4 dalam metastasis tulang kanker payudara 385

Gambar 1. Ekspresi DOCK4 dalam garis sel BM dan PCC dan efek knockdown oleh shRNA. (A–C) DOCK4 dikonfirmasi memiliki ekspresi
yang lebih tinggi dalam tipe sel BM1 dengan western blotting (induksi dua kali lipat,P = 0,027); 81 dan 88% knockdown ekspresi protein
DOCK4 masing-masing dicapai dalam sel PCC dan BM1. Gambar seluruh jalur gel representatif ditampilkan. (E dan F) Uji invasi/migrasi.
Kemampuan sel PCC dan BM1 untuk bergerak melalui matriks Matrigel™ dinilai menggunakan uji luka gores. Perbedaan signifikan
antara vektor kontrol dan sel knockdown DOCK4 terlihat pada titik waktu 6 dan 12 jam.

Gambar 2. Contoh immunostaining untuk DOCK 4 di inti TMA dari pasien dalam studi AZURE. Contoh skor intensitas ekspresi protein
untuk protein DOCK4 yang dinilai menggunakan imunohistokimia dan divisualisasikan pada perbesaran 20×. Penilaian didasarkan pada
intensitas pewarnaan di kompartemen sitoplasma sel tumor saja. Bilah skala = 200 m.

tidak berdampak pada analisis statistik selanjutnya baik dalam
kelompok kontrol atau zoledronate.
Pasien AZURE: hubungan ekspresi DOCK4 dengan
kekambuhan kejadian jauh
Kontrol lengan Analisis awal mempertimbangkan kemungkinan
hubungan antara ekspresi DOCK4 (diberi skor sebagai 1, 2 atau
3) dan DFS untuk komponen rekurensi jauh DFS. Meskipun kami
tidak menemukan hubungan yang signifikan secara statistik
antara DOCK4 dan kejadian pertama di situs non-skeletal, diambil
sebagai kelompok (P = 0,08, Gambar 3D) atau di lokasi yang jauh (
P = 0,475, Gambar 3C), DOCK4 yang lebih tinggi secara signifikan
dikaitkan dengan peningkatan risiko mengembangkan kejadian
pertama sebagai kekambuhan tulang, baik hanya

© 2018 Penulis. Jurnal Patologi diterbitkan oleh John Wiley & Sons Ltd atas J Pathol 2019; 247: 381–391
nama Pathological Society of Great Britain and Ireland. www.pathsoc.org www.thejournalofpathology.com
386 JA Westbrook dkk

Tabel 1. Karakteristik pasien yang jaringannya dinilai pada TMA dalam penelitian ini (seperti pada awal penelitian AZURE) dan kejadian DFS
pertama
kumpulan data DOCK4 Populasi percobaan AZURE penuh

Zoledronat Kontrol Zoledronat Kontrol

Ciri (n = 359) (n = 330) (n = 1681 (n = 1678)
Usia (tahun) median (kisaran) 50 (26, 75) 51 (32, 79) 51 (20–89) 51 (21, 89)
Kelenjar getah bening aksila – n (%)
0 4 (1.2) 4 (1.2) 29 (1.7) 32 (1.9)
1-3 223 (67.6) 223 (67.6) 1041 (61.9) 1032 (61.5)
≥4 103 (31.2) 103 (31.2) 604 (35.9) 608 (36.2)
Stadium tumor- n (%)
T1 115 (32.0) 116 (35.2) 542 (32.2) 523 (31.2)
T2 196 (54.6) 163 (49.4) 851 (50.6) 867 (51.7)
T3 37 (10.3) 43 (13) 227 (13.5) 228 (13.6)
T4 11 (3.1) 8 (2.4) 58 (3.5) 59 (3.5)
Tingkat histologis - n (%)
1 26 (7.2) 23 (7.0) 145 (8.6) 140 (8.3)
2 144 (40.1) 130 (39.4) 731 (43.5) 708 (42.2)
3 187 (52.1) 174 (52.7) 765 (45.5) 787 (46.9)
Tidak ditentukan 3 (0.9)
Hilang 2 (0.6)
status UGD- n (%)
ER positif 255 (77.3) 255 (77.3) 1319 (78.5) 1316 (78.4)
ER negatif 80 (22.3) 72 (21.8) 349 (20.8) 355 (21.2)
UGD tidak diketahui 1 (0.3) 3 (9) 13 (0.8) 7 (0.4)
status PR- n (%)
PR positif 126 (35.1) 102 (30.9) 725 (43.1) 698 (41.6)
PR negatif 63 (17.5) 73 (22.1) 382 (22.7) 424 (25.3)
PR tidak diketahui 169 (47.1) 153 (46.4) 571 (34.0) 548 (32.7)
Hilang 1 (0.3) 2 (0.6)
status HER2 – n (%)
HER2 positif 38 (10.6) 48 (12.7) 192 (11.4) 223 (13.3)
HER2 negatif 106 (29.5) 84 (26.0) 648 (38.5) 603 (35.9)
HER2 tidak diketahui/tidak 209 (58.3) 197 (61.2) 831 (49.5) 843 (50.1)
diukur Hilang 6 (1.7) 1 (0.3)
Status menopause - n (%)
Pramenopause 167 (46.5) 151 (45.8) 751 (44.7) 752 (44.8)
≤5 tahun sejak menopause 53 (14.8) 54 (16.4) 247 (14.7) 244 (14.5)
> 5 tahun sejak menopause Status 112 (31.2) 97 (29.4) 519 (30.9) 522 (31.1)
menopause tidak diketahui 27 (7.5) 28 (8.5) 164 (9.8) 160 (9.5)

Terapi sistemik yang direncanakan n (%)

Terapi endokrin saja 24 (6.7) 17 (5.2) 76 (4.5) 74 (4.5)
Kemoterapi saja 79 (22.0) 72 (21.8) 362 (21.5) 360 (21.5)
Terapi endokrin plus kemoterapi 256 (71.3) 241 (73.0) 1243 (73.9) 1243 (74.1)
Jenis kemoterapi – n (%)
Antrasiklin 328 (91.4) 307 (93.0) 1567 (97.6) 1564 (97.6)
Taxanes 48 (13.4) 41 (12.4) 390 (24.3) 385 (24.0)
Waktu kemoterapi
Neoadjuvant 14 (3.3) 11 (3.3) 104 (6.5) 104 (6.5)
Pasca operasi 345 (96.7) 319 (96.7) 1501 (93.5) 1499 (93.5)
penggunaan statin- n (%) 19 (5.3) 15 (4.5) 97 (5.8) 101 (6.0)
Jenis acara DFS pertama – n (%)
Kekambuhan lokoregional 26 (7.2) 17 (5.2) 79 (4.7) 78 (4.7)
Kekambuhan jauh 68 (18.9) 74 (22.4) 332 (19.8) 341 (20.3)
Kekambuhan jauh dan lokoregional 5 (1.4) 3 (0.9) 18 (1.1) 21 (1.3)
Kematian tanpa kekambuhan sebelumnya 11 (3.1) 13 (3.9) 53 (3.2) 44 (2.6)
Kekambuhan jauh pertama adalah non-skeletal - n (%) 46 (12.8) 28 (8.5) 194 (11.5) 165 (9.8)
Kekambuhan jauh pertama termasuk tulang dan lainnya - n (%) 27 (7.5) 49 (14.8) 156 (9.3) 197 (11.7)
Kekambuhan jauh pertama hanya kerangka - n (%) 16 (4.5) 38 (11.5) 97 (5.8) 140 (8.3)

Non-skeletal, kejadian kekambuhan jauh pertama tidak termasuk komponen skeletal apapun; rangka dan lainnya, kejadian kekambuhan jauh pertama yang dilaporkan mencakup situs metastasis tulang
dan lainnya, serta hanya tulang; kerangka saja, kejadian kekambuhan jauh pertama hanya kerangka - kelompok ini adalah subset dari yang diklasifikasikan sebagai kerangka dan lainnya. PR, reseptor
progesteron.

© 2018 Penulis. Jurnal Patologi diterbitkan oleh John Wiley & Sons Ltd atas J Pathol 2019; 247: 381–391
nama Pathological Society of Great Britain and Ireland. www.pathsoc.org www.thejournalofpathology.com
DOCK4 dalam metastasis tulang kanker payudara
Gambar 3. Asosiasi DOCK4 dengan acara DFS. Kaplan–Meier memperkirakan hubungan antara ekspresi DOCK4 dan (A) hanya kejadian DFS kerangka (di mana
tidak ada kejadian jauh lainnya yang direkam pada waktu yang sama), (B) kejadian kerangka dan DFS lainnya (di mana kejadian jauh lainnya mungkin telah
direkam pada saat yang sama), (C) setiap kejadian DFS dan (D) kejadian DFS non-skeletal pada pasien dalam kelompok kontrol dari percobaan AZURE (n = 434).
Nilai P berasal dari uji log-rank untuk menguji persamaan fungsi survival Q15.
di tulang (P = 0,043, Gambar 3A) atau di tulang dan tempat lain
yang jauh secara bersamaan (P = 0,033, Gambar 3B).
Selanjutnya, skor ekspresi TMA dikotomi digunakan di mana
ekspresi DOCK4 tinggi (skor 3) dibandingkan dengan ekspresi
DOCK4 rendah (skor 1 atau 2). Dengan menggunakan kategori-
kategori ini, perkiraan Kaplan-Meier dari fungsi kelangsungan
hidup untuk waktu hingga kekambuhan jauh menegaskan bahwa
DOCK4 yang tinggi secara signifikan prognostik untuk
kekambuhan jauh pertama yang hanya melibatkan tulang (HR 2.1;
95%CI 1.09, 4.15,P = 0,024, Gambar 4A). Untuk peristiwa jauh
pertama yang melibatkan situs kerangka dan situs lain secara
bersamaan, meskipun tren yang sama diamati, hubungan
tersebut tidak mencapai signifikansi (HR 1.6; 95%CI 0.88, 3.05,P =
0,113, Gambar 4C).
Dimana kejadian jauh pertama berada di tempat non-skeletal
(diambil sebagai kelompok), analisis dichotomised yang sesuai
(Gambar 4E) menyarankan penurunan risiko non-skeletal yang
tidak signifikan dengan DOCK4 tinggi (HR = 0,2; 95% CI 0,03 , 1,51,
P = 0,12). Dalam analisis dikotomi, kami tidak menemukan
hubungan antara DOCK4 tinggi dan kejadian kerangka pertama,
apakah kejadian jauh lainnya telah terjadi terlebih dahulu atau
tidak (HR = 1,3; 95% CI 0,73, 2,33, P = 0,373), menunjukkan bahwa
masuknya metastasis di tempat lain, sebelum akhirnya menyebar
ke tulang, melawan hubungan signifikan yang terlihat dengan
analisis tulang saja. Lengan Zoledronat Pada kelompok
zoledronate, analisis dikotomi mengungkapkan tidak ada
hubungan antara DOCK4 dan kejadian jauh hanya tulang (HR 0,6;
95%CI 0,14, 2,62, P = 0,488, Gambar 4B), yaitu peningkatan risiko
kejadian pertama hanya-tulang yang ditimbulkan oleh DOCK4
tinggi pada kelompok kontrol dihilangkan oleh zoledronate. Ini
menunjukkan bahwa DOCK4 dapat bertindak sebagai biomarker
prediktif untuk pencegahan metastasis tulang oleh zoledronate.
Ini dikonfirmasi dengan memeriksa plot Kaplan-Meier untuk
DOCK4 tinggi dan DOCK4 rendah membandingkan pasien kontrol
dan zoledronate untuk berbagai peristiwa (lihat bahan tambahan,
Gambar S5). Gambar S5B dengan jelas menunjukkan
pengurangan risiko hanya metastasis tulang sebagai kejadian
pertama (HR 0,1; 95% CI 0,03, 0,5,P = 0,003) pada pasien dengan
DOCK4 tinggi yang diobati dengan zoledronate.
Untuk kejadian pertama yang melibatkan tulang dan tempat lain
secara bersamaan, tidak ada hubungan signifikan yang terlihat pada
kelompok zoledronate (Gambar 4D).
© 2018 Penulis. Jurnal Patologi diterbitkan oleh John Wiley & Sons Ltd atas
nama Pathological Society of Great Britain and Ireland. www.pathsoc.org
387
Regresi bahaya proporsional Cox disesuaikan dengan
rencana terapi sistemik, status ER, status HER2 dan
keterlibatan kelenjar getah bening
Kontrol lengan Analisis yang disesuaikan (Tabel 2) menegaskan
bahwa ekspresi DOCK4 yang tinggi secara signifikan prognostik
untuk kejadian hanya kerangka (HR 2.13, 95% CI 1.06, 4.30, P =
0,034). Analisis serupa untuk kejadian kekambuhan pertama yang
melibatkan kerangka dan situs lain secara bersamaan tidak
menunjukkan hubungan yang signifikan (HR 1,63, 95% CI 0,86,
3,12,P = 0,137; Meja 2). Tidak ada hubungan signifikan yang
ditemukan dalam analisis yang disesuaikan ini untuk kejadian
jauh non-skeletal ketika dinilai secara kolektif. Analisis hubungan
ke situs metastatik individu lainnya tidak dimungkinkan dengan
dataset ini.
Lengan Zoledronat Efek prognostik yang signifikan dari
DOCK4 untuk metastasis tulang saja yang terlihat pada pasien
kelompok kontrol tidak diamati pada kelompok zoledronate
(HR 0,812, 95% CI 0,18, 3,76, P = 0,790; Tabel 2), menunjukkan
lagi bahwa peningkatan risiko metastasis tulang pada pasien
dengan kadar DOCK4 tinggi pada awal dapat dilawan dengan
pengobatan dengan zoledronate. Ini diuji secara formal
dengan memasukkan istilah interaksi dalam regresi bahaya
proporsional Cox untuk kelompok pengobatan dan tingkat
DOCK4 untuk waktu hingga kejadian pertama, hanya
kerangka. Analisis ini menyarankan efek prediktif untuk
pengobatan dengan zoledronate (HR 0,12 95% CI 0,03, 0,56;
uji rasio kemungkinanP = 0,063; SDM< 1 menunjukkan
perbaikan dengan zoledronate), meskipun ini tidak mencapai
signifikansi.
Kelangsungan hidup secara keseluruhan dan status menopause
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4I,J dan bahan
tambahan, Gambar S5I,J, meskipun tampaknya ada
kecenderungan DOCK4 tinggi yang menghasilkan hasil
yang lebih buruk, tingkat ekspresi DOCK4 tidak
berdampak signifikan pada kelangsungan hidup
keseluruhan baik pada kelompok kontrol atau
zoledronate. Ketika pasien pascamenopause dan
pramenopause dianalisis secara terpisah, meskipun
hubungan serupa dengan metastasis tulang ke kelompok
penuh diamati, ada kehilangan signifikansi statistik dan ini
mungkin karena jumlah yang terlibat lebih kecil.
J Pathol 2019; 247: 381–391
www.thejournalofpathology.com
388 JA Westbrook dkk

Gambar 4. Asosiasi univariat dari hasil kekambuhan jauh dengan ekspresi biomarker dalam kontrol dan lengan zoledronate (perkiraan berasal dari regresi
bahaya proporsional Cox). Kaplan-Meier memperkirakan fungsi kelangsungan hidup untuk waktu kekambuhan jauh (DR) dan kelangsungan hidup
keseluruhan untuk kelompok kontrol dan zoledronate. Angka 1 sampai 3 mengacu pada skor intensitas pewarnaan DOCK4. Ini adalah dikotomi, yaitu DOCK4
rendah (1 dan 2); DOCK4 tinggi (3). Perbandingan yang terbukti signifikan juga signifikan dalam analisis yang menyesuaikan efek rencana terapi sistemik,
status ER dan keterlibatan kelenjar getah bening. (A dan B) Skeletal saja, (C dan D) skeletal dan lainnya, (E dan F) non-skeletal, (G dan H) skeletal pertama
terlepas dari apakah peristiwa jauh lainnya telah terjadi sebelumnya (yaitu kelangsungan hidup bebas metastasis tulang) . (I dan J) Kelangsungan hidup secara
keseluruhan.P nilai mengacu pada tes log-rank. Untuk definisi non-skeletal, skeletal dan lainnya dan skeletal hanya lihat legenda pada Tabel 1.

© 2018 Penulis. Jurnal Patologi diterbitkan oleh John Wiley & Sons Ltd atas J Pathol 2019; 247: 381–391
nama Pathological Society of Great Britain and Ireland. www.pathsoc.org www.thejournalofpathology.com
DOCK4 dalam metastasis tulang kanker payudara 389

Tabel 2. Analisis regresi Cox untuk hubungan antara imunohistokimia protein dan kejadian kekambuhan jauh oleh kelompok percobaan AZURE
Perawatan standar Perawatan standar + zoledronate

Tidak Tidak. Tidak Tidak.

acara
mempertaruhkan SDM(95%CI) P nilai acara
mempertaruhkan SDM(95%CI) P nilai
Kekambuhan jauh non-skeletal Tidak disesuaikan 330 28 0,154 [0.021,1.131] 0.066 359 46 1.162 [0.577,2.342] 0.674
Disesuaikan 329 28 0,201 [0.027,1.506] 0.118 353 46 0,999 [0.478,2.086] 0.997
Kekambuhan jauh termasuk skeletal Tidak disesuaikan 330 49 1,642 [0.883,3.052] 0.117 359 27 0,96 [0,363,2,535] 0.934
Disesuaikan 329 49 1.634 [0.855,3.121] 0.137 353 26 0,999 [0.336.296] 0.998
Kekambuhan jauh hanya kerangka Tidak disesuaikan 330 38 2.121 [1.085,4.148] 0.028 359 16 0,595 [0.135,2.619] 0.493
Disesuaikan 329 38 2.133 [1.058,4.304] 0.034 353 16 0.812 [0.176,3.756] 0.79
Metastasis tulang kapan saja Tidak disesuaikan 330 62 1,302 [0,728,2,328] 0.374 359 49 0,81 [0,38,1,728] 0.586
Disesuaikan 329 62 1.344 [0.734,2.46] 0.338 353 47 0.882 [0.387.2.012] 0.765

Kategori referensi dalam setiap model multivariabel adalah DOCK4 rendah (1 atau 2). Perbandingan yang terbukti signifikan juga signifikan dalam analisis yang menyesuaikan efek rencana terapi sistemik,
status ER, status HER2 dan keterlibatan kelenjar getah bening. Waktu untuk metastasis tulang pertama didefinisikan sebagai waktu untuk kekambuhan jauh tulang pertama, terlepas dari apakah
kekambuhan jauh lainnya telah terjadi lebih awal (yaitu kelangsungan hidup bebas metastasis tulang). Untuk definisi non-skeletal, skeletal plus other dan skeletal only, lihat legenda pada Tabel 1.

Diskusi terkait dengan metastasis jauh pertama di tulang, mungkin

terkait dengan faktor-faktor ini, termasuk faktor-faktor di

Metastasis tulang kanker payudara menyebabkan morbiditas lingkungan mikro tulang. Khususnya, dalam hal ini, hubungan

yang signifikan dan biomarker yang dapat memprediksi spesifik DOCK4 tinggi dengan metastasis tulang setiap saat hilang

perkembangan metastasis tulang sangat dibutuhkan. Dalam studi begitu metastasis terjadi di tempat lain. Ini mungkin

translasi ini, perbandingan berbasis SILAC-MS dari varian sel menunjukkan lingkungan metastatik yang berubah secara

bone-homing dan non-homing dan fungsionalin vitro pekerjaan, substansial mempengaruhi metastasis tulang setelah metastasis

ditambah dengan validasi klinis yang ketat, memungkinkan kami non-tulang telah terjadi. Hubungan dengan tulang sebagai situs

untuk mengidentifikasi DOCK4 sebagai biomarker potensial untuk metastasis pertama hilang pada pasien yang diobati dengan

tujuan ini. zoledronate, menunjukkan bahwa pengobatan zoledronate

Ilmu penemuan kami menggunakan MDA- mengurangi risiko metastasis tulang ke tingkat yang serupa
MB-231 dan varian pelacak tulangnya BM1. Garis dengan pasien DOCK4 non-tinggi.
sel MDA-MB-231 dianggap sebagai 'standar Pekerjaan ini telah menunjukkan bahwa DOCK4 memiliki profil
emas' untuk jenis penelitian ini karena berasal prognostik dan prediktif yang serupa dengan CAPG dan GIPC1
dari efusi pleura pasien kanker payudara dengan untuk prognosis kekambuhan hanya kerangka pada pasien
metastasis tumor luas, bertahun-tahun setelah kelompok kontrol. DOCK4 juga mirip dengan penanda yang
reseksi tumor primer [23] . Selanjutnya, validitas ditemukan sebelumnya karena tidak dapat memprediksi kejadian
pendekatan ini telah dibuktikan dalam penelitian kekambuhan non-skeletal pada pasien kelompok kontrol.
kami sebelumnya di mana pentingnya protein Pengobatan dengan zoledronate menghapuskan hubungan
CAPG dan GIPC1 sebagai biomarker ditemukan tingkat tinggi dari ketiga protein ini dalam pengembangan
dan kemudian divalidasi secara klinis [10]. Di sini metastasis tulang saja.
kami fokus pada DOCK4, faktor pertukaran Ekspresi DOCK4 diinduksi oleh sitokin TGF yang bekerja
nukleotida guanin utama yang mengatur aktivasi melalui jalur Smad, dan ini merupakan langkah kunci dalam
GTPase Rac1 kecil [19,20,24,25]. Aktivasi Rac1 efek pro-metastasis TGF [21]. GIPC1 juga merupakan protein
yang dimediasi DOCK4 telah ditunjukkan untuk scaffolding kunci yang berfungsi untuk mentransmisikan
mempromosikan reorganisasi aktin dan sinyal dari reseptor TGFβ dan koreseptornya endoglin ke
pembentukan lamellipodia di ujung depan sel fosforilasi Smad hilir [26]. TGFβ adalah pengatur berbagai
kanker payudara [19], langkah dalam metastasis, termasuk intravasasi, ekstravasasi
dan kelangsungan hidup sel kanker di tempat organ yang
DOCK4 diekspresikan dalam sel induk MDA-MB-231 (PCC), jauh [27]. Faktor transkripsi c-MAF baru-baru ini telah
tetapi lebih berlimpah dalam varian bone-homing (BM1). diidentifikasi sebagai pengatur utama metastasis tulang
DOCK4 knockdown menghambat migrasi garis sel PCC dan kanker payudara [28,29]. Ekspresi c-MAF diinduksi oleh TGFβ
BM, dengan penghambatan lebih besar pada 6 jam dari dan aplikasi paten terbaru menunjukkan bahwa ekspresi
inisiasi pasca-pengujian 12, menunjukkan bahwa invasi sel DOCK4 berkorelasi dengan ekspresi MAF dalam tumor primer
yang dimediasi DOCK4 mungkin penting pada tahap awal [30]. Pemeriksaan set data proteomik kuantitatif kami
migrasi sel kanker payudara. Namun, peningkatan migrasi sel mengidentifikasi 36 protein yang juga ada dalam set gen c-
dan invasi yang dihasilkan dari ekspresi DOCK4 yang tinggi MAF (total panel yang terdiri dari 109 gen). Di dalam 36
hanyalah salah satu aspek dari sel pembentuk tulang yang protein yang dikuantifikasi oleh proteomik, 15 protein
membuatnya menjadi tulang. Secara khusus, target c-MAF menunjukkan perubahan yang sama (peningkatan atau
dan protein lain yang meningkat dalam sel pembentuk tulang penurunan ekspresi di dalam sel pembentuk tulang
mungkin mendorong fenotipe pembentuk tulang serta dibandingkan dengan sel induk) sebagai transkrip gen yang
DOCK4. Pengamatan kami bahwa, pada pasien, DOCK4 tinggi relevan sebagai respons terhadap ekspresi c-MAF. Oleh
secara khusus karena itu, DOCK4 dapat menjadi

© 2018 Penulis. Jurnal Patologi diterbitkan oleh John Wiley & Sons Ltd atas J Pathol 2019; 247: 381–391
nama Pathological Society of Great Britain and Ireland. www.pathsoc.org www.thejournalofpathology.com
390
komponen panel protein yang merespons peningkatan
ekspresi c-MAF dalam sel kanker payudara pembentuk
tulang.
Selain sebagai biomarker prognostik, data kami juga
memberikan bukti bahwa DOCK4 adalah biomarker
prediktif potensial dalam hal efek pengobatan zoledronate
untuk tulang sebagai situs metastasis pertama, karena
penambahan zoledronate tampaknya mengurangi risiko
pasien dengan tingkat DOCK4 dengan pasien dengan
tingkat DOCK4 yang lebih rendah. Ada juga HR substansial
yang mendukung efek pengobatan ketika istilah interaksi
dimasukkan dalam regresi bahaya proporsional Cox,
meskipun ini tidak memiliki signifikansi statistik dan
pengujian tambahan dalam kohort pasien lebih lanjut
diperlukan sebelum DOCK4 dapat dikonfirmasi sebagai
prediksi. penanda biologis.
Studi kami saat ini didukung lebih lanjut melalui analisis
dok4 ekspresi gen dalam database yang tersedia untuk
umum di mana dok4 tingkat transkrip memprediksi
penyebaran metastasis tulang jauh dari kanker payudara
(lihat materi tambahan, Gambar S4).
Menariknya, DOCK4 tidak prognostik untuk DFS dalam hal
metastasis di situs non-skeletal, diambil sebagai kelompok (n
= 28). Memang, data untuk kelompok kontrol pada Gambar 4
dan Tabel 2 (dan lihat bahan tambahan, Gambar S5)
menunjukkan bahwa DOCK4 tinggi dapat dikaitkan dengan
pengurangan terjadinya metastasis non-skeletal, efek yang
tidak terlihat pada zoledronate. lengan. Meskipun zoledronate
menguntungkan dalam hal mencegah metastasis tulang pada
pasien tinggi DOCK4, ini juga dapat menghilangkan efek yang
berpotensi menguntungkan untuk metastasis non-skeletal.
Meskipun data kami tidak menunjukkan penjelasan
mekanistik tertentu untuk efek ini, ada kemungkinan bahwa
zoledronate mungkin memiliki efek selain pada kerangka dan,
dalam hal ini, kami mencatat dampak negatif dari zoledronate
pada kelangsungan hidup secara keseluruhan pada wanita
pramenopause baru-baru ini dilaporkan, dimana pada pasien
non-pascamenopause dengan tumor MAF-positif, zoledronate
dikaitkan dengan DFS invasif yang lebih buruk dan
kelangsungan hidup secara keseluruhan [28]. Jelas, faktor-
faktor ini perlu diingat dalam pertimbangan DOCK4 sebagai
biomarker prediktif untuk respons zoledronat dalam
pencegahan metastasis tulang. Karena analisis kami
memasukkan situs non-skeletal sebagai satu kelompok,
mereka tidak mengecualikan kemungkinan hubungan DOCK4
dengan situs yang kurang umum untuk penyebaran
metastasis daripada kerangka.
Ada beberapa keterbatasan untuk penelitian saat ini.
Meskipun jumlah pasien yang tersedia untuk analisis dari
studi AZURE jauh melebihi yang diperlukan untuk
kekuatan statistik, saat ini tidak ada kumpulan sampel
independen yang setara yang tersedia untuk validasi lebih
lanjut. Juga, metastasis kanker payudara ke tulang
melibatkan banyak peristiwa pensinyalan autokrin dan
parakrin [31], dan ini, serta pengarahan dan perekrutan
jalur pensinyalan kunci yang melibatkan migrasi, jelas
tidak direplikasi dalam uji invasi yang digunakan dalam
penelitian ini. Alat yang lebih kompleks untuk menilai ini
saat ini tidak tersedia.
© 2018 Penulis. Jurnal Patologi diterbitkan oleh John Wiley & Sons Ltd atas
nama Pathological Society of Great Britain and Ireland. www.pathsoc.org
JA Westbrook dkk
Studi lebih lanjut tentang peran mekanistik DOCK4 dalam
metastasis tulang kanker payudara dan implikasi untuk
penghambatan farmakologis dibenarkan oleh pekerjaan kami.
ucapan terima kasih
Kami berterima kasih kepada pasien dalam penelitian AZURE.
Kami berterima kasih kepada Cancer Research UK atas
penghargaan Clinician Scientist Fellowship (kepada JEB, C18605/A
10048) dan Sheffield ECMC atas dukungannya, Yorkshire Cancer
Research untuk penghargaan proyek (S315 ke JEB, REC, VS), Breast
Cancer Now untuk percontohan dan penghargaan hibah proyek
(2012MaySP047 dan 2016MayPR74 kepada GM dan VS) dan
Dewan Riset Medis Inggris untuk Beasiswa Pengembangan Karir
(G0802416) kepada DAC. Kami juga berterima kasih kepada Adam
Davison dan Liz Straszynsky atas bantuannya dalam menyortir sel
dan Paul Morris atas bantuannya dengan imunohistokimia.
Pernyataan kontribusi penulis
JW, SW, KM, RG, HT, MO, MD, SR, AH, PS, VS GM, RC dan JB
menyusun dan/atau melakukan eksperimen. KM, VS dan
GM menyumbangkan data dalam kelompok pelatihan. JW,
DC, SW, HM, AH, MD, PS, VS, GM, RC dan JB menganalisis
data. Semua penulis terlibat dalam penulisan naskah dan
memiliki persetujuan akhir dari versi yang dikirimkan.
Referensi
1. Macedo F, Ladeira K, Pinho F, dkk. Metastasis tulang: gambaran umum.
Oncol Rev 2017; 11: 321.
2. Singh T, Kaur V, Kumar M, dkk. Peran penting bifosfonat untuk
menargetkan metastasis kanker tulang: gambaran umum. Target
Obat J 2015; 23: 1–15.
3. Casas A, Llombart A, Martin M. Denosumab untuk pengobatan
metastasis tulang pada kanker payudara stadium lanjut. Dada 2013;
22: 585–592.
4. Coleman RE, Marshall H, Cameron D, dkk. Terapi ajuvan kanker payudara
dengan asam zoledronat. N Engl J Med 2011; 365: 1396–1405.
5. Kolaborasi Penguji Kanker Payudara Dini. Pengobatan bifosfonat
adjuvant pada kanker payudara dini: meta-analisis data pasien
individu dari uji coba secara acak.Lanset 2015; 386: 1353–1361.
6. Rathbone EJ, Brown JE, Marshall HC, dkk. Osteonekrosis rahang dan kualitas
hidup terkait kesehatan mulut setelah asam zoledronat ajuvan: asam
zoledronat ajuvan untuk mengurangi subprotokol percobaan kekambuhan
(BIG01/04). J Clin Oncol 2013; 31: 2685–2691.
7. Santana-Codina N, Carretero R, Sanz-Pamplona R, dkk. Jaringan
terintegrasi transkriptom-proteom mengidentifikasi retikulum
endoplasma tiol oksidoreduktase (ERp57) sebagai pusat yang
memediasi metastasis tulang. Proteomik Sel Mol 2013; 12: 2111–2125.
8. Lam SW, Jimenez CR, Boven E. Klasifikasi kanker payudara berdasarkan
teknologi proteomik: pengetahuan terkini. Pengobatan Kanker Rev
2014; 40: 129-138.
9. Dumont B, Castronovo V, Peulen O, dkk. Analisis proteomik diferensial dari
tumor payudara manusia dan metastasis tulangnya yang cocok
mengidentifikasi membran sel dan protein ekstraseluler yang terkait
dengan metastasis tulang. J Proteome Res 2012; 11: 2247–2260.
J Pathol 2019; 247: 381–391
www.thejournalofpathology.com
DOCK4 dalam metastasis tulang kanker payudara
10. Westbrook JA, Cairns DA, Peng J, dkk. CAPG dan GIPC1: biomarker kanker
payudara untuk pengembangan dan pengobatan metastasis tulang.
Institut Kanker J Natl 2016; 108: djv360.
11. Kang Y, Siegel PM, Shu W, dkk. Program multigenik yang
memediasi metastasis kanker payudara ke tulang. Sel Kanker
2003; 3: 537–549.
12. Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, dkk. Pelabelan isotop stabil oleh
asam amino dalam kultur sel, SILAC, sebagai pendekatan sederhana
dan akurat untuk ekspresi proteomik. Proteomik Sel Mol 2002; 1: 376–
386.
13. Ong SE, Mann M. Resep praktis untuk pelabelan isotop stabil oleh
asam amino dalam kultur sel (SILAC). Nat Protoc 2006; 1: 2650–
2660.
14. Abraham S, Scarcia M, Bagshaw RD, dkk. Kompleks faktor
pertukaran Rac/Cdc42 mendorong pembentukan filopodia lateral
dan morfogenesis lumen pembuluh darah. Komunitas Nat 2015;
6: 7286.
15. Simpkins SA, Hanby AM, Holliday DL, dkk. Signifikansi klinis dan
fungsional dari hilangnya ekspresi caveolin-1 pada fibroblas
terkait kanker payudara. J Pathol 2012; 227: 490–498.
16. Hornigold N, Craven RA, Keen JN, dkk. Upregulasi Hic-5 di
glomerulosklerosis dan regulasi apoptosis sel mesangial. Inti
Ginjal 2010; 77: 329–338.
17. McShane LM, Altman DG, Sauerbrei W, dkk. Rekomendasi
pelaporan untuk studi prognostik tumor MARKer (REMARK). Nat
Clin Berlatih Urol 2005; 2: 416–422.
18. Kawada K, Upadhyay G, Ferandon S, dkk. Migrasi sel diatur oleh endositosis
reseptor faktor pertumbuhan yang diturunkan dari trombosit.
Sel Mol Biola 2009; 29: 4508–4518.
19. Hiramoto-Yamaki N, Takeuchi S, Ueda S, dkk. Ephexin4 dan EphA2
memediasi migrasi sel melalui mekanisme yang bergantung pada
RhoG. Biola Sel J 2010; 190: 461–477.
20. Kobayashi M, Harada K, Negishi M, dkk. Dock4 membentuk kompleks
dengan SH3YL1 dan mengatur migrasi sel kanker. Sinyal Sel 2014; 26:
1082–1088.
21. Yu JR, Tai Y, Jin Y, dkk. Pensinyalan TGF-beta/Smad melalui DOCK4
memfasilitasi metastasis adenokarsinoma paru Gen Dev 2015;
29: 250–261.
22. Jalali A, Ebrahimi H, Ohadi M, dkk. Variasi baru di daerah promotor
gen DOCK4 dan RAP1A manusia, dan daerah pengkode RAP1A
pada tumor payudara sporadis. Avicenna J Med Bioteknologi
2009; 1: 117–123.
BAHAN TAMBAHAN ONLINE
Bahan dan metode tambahan
Gambar S1. Skema yang menunjukkan langkah-langkah kunci dalam pendekatan proteomik SILAC yang digunakan
Gambar S2. Menguji spesifisitas antibodi dengan imunostaining sel FFPE
Gambar S3. Menguji spesifisitas antibodi dengan western blotting lisat sel
Gambar S4. Analisis ekspresi gen dari dok4 ekspresi dan waktu untuk metastasis tulang
Gambar S5. Asosiasi univariat dari hasil kekambuhan jauh dengan ekspresi biomarker untuk DOCK4 rendah dan DOCK4 tinggi
Tabel S1. Hasil proteomik untuk protein yang diregulasi dalam perbandingan SILAC sel MDA-MB-231 parental (PCC) dan bone-homing (BM1)
© 2018 Penulis. Jurnal Patologi diterbitkan oleh John Wiley & Sons Ltd atas
nama Pathological Society of Great Britain and Ireland. www.pathsoc.org
391
23. Cailleau R, Zaitun M, Cruciger QV. Garis sel karsinoma payudara
manusia jangka panjang yang berasal dari metastasis: karakterisasi
awal.In Vitro 1978; 14: 911–915.
24. Brugnera E, Haney L, Grimsley C, dkk. Aktivitas Rac-GEF yang tidak
konvensional dimediasi melalui kompleks Dock180-ELMO. Biola Sel
Nat 2002; 4: 574–582.
25. Cote JF, Vuori K. Identifikasi superfamili yang dilestarikan secara
evolusioner dari protein terkait DOCK180 dengan aktivitas pertukaran
nukleotida guanin. Ilmu Sel J 2002; 115: 4901–4913.
26. Lee NY, Ray B, Bagaimana T, dkk. Endoglin mempromosikan transformasi
faktor pertumbuhan pensinyalan Smad 1/5/8 yang dimediasi beta dan
menghambat migrasi sel endotel melalui hubungannya dengan GIPC. J Biol
Chem 2008; 283: 32527–32533.
27. Vallastyan S, Weinberg RA. Metastasis tumor: wawasan molekuler dan
paradigma yang berkembang.Sel 2011; 147: 275–292.
28. Coleman R, Hall A, Albanell J, dkk. Pengaruh amplifikasi MAF pada
hasil pengobatan dengan asam zoledronat ajuvan pada kanker
payudara dini: analisis sekunder dari percobaan internasional,
label terbuka, acak, terkontrol, fase 3 AZURE (BIG 01/04). Lancet
Oncol 2017; 18: 1543–1552.
29. Pavlovic M, Arnal-Estape A, Rojo F, dkk. Peningkatan ekspresi onkogen
MAF dan metastasis tulang kanker payudara. Institut Kanker J Natl
2015; 107: djv256.
30. Gomis RR. Metode untuk diagnosis, prognosis dan pengobatan
kanker metastatik. 2018. Kantor Paten Eropa, EP3272880.
Tersedia dari: https://data.epo.org/publication-server/rest/v1.0/
publication-dates/20180411/patents/EP3272880NWA3/document
. pdf [Diakses 14 Desember 2018].
31. Kang Y. Membedah interaksi tumor-stroma dalam metastasis tulang
kanker payudara. Metab Endokrinol (Seoul) 2016; 31: 206–212.
* 32. Wang Y, Klijn JG, Zhang Y, dkk. Profil ekspresi gen untuk memprediksi
metastasis jauh kanker payudara primer kelenjar getah bening-
negatif Lanset 2005; 365: 671–679.
* 33. Schroeder M, Haibe-Kains B, Culhane A, dkk. Kanker
payudaraVDX. Paket R Versi 1.16.0.2011. DOI: 10.18129/
B9.bioc.breastCancerVDX.
* 34. Hothorn T, Hornik K, Zeileis A. Partisi rekursif yang tidak bias: kerangka
kerja inferensi bersyarat. Statistik Grafik Komputasi J 2006; 15: 651–
674.
* 35. Therneau TM, Grambsch PM. Pemodelan Data Kelangsungan Hidup:
Memperluas Model Cox. Pegas: New York, 2000.
* Dikutip hanya dalam materi pelengkap.
J Pathol 2019; 247: 381–391
www.thejournalofpathology.com