Diterjemahkan dari bahasa "?" ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.
com
TINJAUAN
Pengamatan mikroskopis bakteri: ulasan menyoroti
penggunaan SEM lingkungan
L. Bergmans1, P. Moisiadis1, B. Van Meerbeek1, M. Quirynen2& P. Lambrechts1
1Leuven BIOMAT Research Cluster dan2Kelompok Penelitian untuk Adhesi Mikroba, Fakultas Kedokteran Gigi, Patologi Mulut dan Bedah Wajah
Maksillo, Catholic University of Leuven, Leuven, Belgia
Abstrak
Bergmans L, Moisiadis P, Van Meerbeek B, Quirynen M,
Lambrecht P.Pengamatan mikroskopis bakteri: ulasan menyoroti
penggunaan SEM lingkungan.Jurnal Endodontik internasional,38,
775–788, 2005.
Selama bertahun-tahun, berbagai metode telah diadopsi untuk
menyelidiki bakteri yang terlibat dalam infeksi saluran akar dan
periodontitis apikal. Makalah ini mengulas teknik mikroskopis
yang paling umum digunakan dan membahas kemungkinan,
keterbatasan, dan persiapan sampelnya. Secara khusus, varian
baru-baru ini dikembangkan dari mikroskop elektron
pemindaian (SEM), disebut sebagai
Teknik mikroskopis yang ada untuk
pengamatan bakteri
Pengambilan sampel dan pengamatan bakteri sering dilakukan
untuk tujuan penelitian. Secara umum, prosedur ini bukan
bagian dari strategi perawatan dalam praktik endodontik
sehari-hari. Untuk pengamatan bakteri yang terkait dengan
penelitian, metode yang berbeda telah diadopsi selama
bertahun-tahun.
Salah satu teknik pertama untuk mengamati patogen endodontik
adalah mikroskop cahaya majemuk yang dikombinasikan dengan
pewarnaan histologis dan/atau pemotongan. Meskipun tidak cukup
kuat untuk menyelesaikan banyak struktur di dalam sel, jenis
mikroskop ini dapat digunakan untuk identifikasi bakteri tahap
pertama dengan memverifikasi
Korespondensi: Lars Bergmans, Leuven BIOMAT Research
Cluster, Department of Conservative Dentistry, School of
Dentistry, Oral Pathology and Maxillo-Facial Surgery,
Catholic University of Leuven, Kapucijnenvoer 7, B-3000
Leuven, Belgia (Tel.: +32 (0) 16 332747; faks: +32 (0)16
332752; email: lars.bergmans@med.kuleuven.ac.be ).
kanJurnal Endodontik Internasional 2005
lingkungan SEM (ESEM), disorot karena dampak
potensial di berbagai bidang penelitian biomaterial.
Kinerja teknik ESEM ini untuk pengamatan bakteri
patogen endodontik diilustrasikan dengan
pendekatan praktis. Makalah ini diakhiri dengan
diskusi tentang kemungkinan penggunaan ESEM
untuk menguji modalitas perawatan endodontik di
bawah kondisi lingkungandi tempat.
Kata kunci:morfologi bakteri, teknik mikroskopis,
keadaan asli, infeksi saluran akar, preparasi sampel.
Diterima 18 Januari 2005; diterima 26 April 2005
morfologi seluler (misalnya berbentuk batang, kokus, atau
spiral) dan reaksi organisme dengan pewarnaan Gram
(teknik pewarnaan Brown/Brenn) (Ricucci & Bergenholtz
2003). Selain itu, penanda seperti antibodi (monoklonal
atau poliklonal spesifik) dan probe asam nukleat telah
dikembangkan untuk identifikasi pada tingkat genus dan
spesies beberapa bakteri yang terkait dengan penyakit
sebagai alternatif teknik kultur yang panjang. Peralatan
khusus tambahan (yaitu iluminasi medan gelap dan
mikroskop fase kontras) telah digunakan untuk
menghitung jumlah bakteri motil di klinik secara langsung
setelah pengambilan sampel saluran akar (Tropedkk. 1992).
Demikian juga, dalam periodontik, beberapa protokol
laboratorium dan sejumlah tes diagnostik secara rutin
digunakan untuk mengevaluasi sampel plak subgingiva
dalam jumlah besar untuk mengetahui kandungan spesies
patogen yang dikenal luas. Evaluasi tersebut sangat
penting dalam memahami efek pengobatan dan digunakan
oleh peneliti dan dokter (Greenstein & Polson 1985). Teknik
yang sering digunakan termasuk kultur, bidang gelap dan
mikroskop fase kontras (Magnusson .).
Jurnal Endodontik internasional,38,775–788, 2005 775
 Pengamatan bakteri dengan ESEMBergman dkk.
dkk.1985, Quirynendkk.1995), atau tes imunologi
dan metode molekuler (Socranskydkk.1998,
Ximenez-Fyviedkk.2000, Darbydkk.2001).
Pendekatan penting kedua untuk pengamatan bakteri
menggunakan prinsip mikroskop elektron (EM). Mikroskop
yang terlibat membangun gambar dari berkas elektron
primer (PE) yang sangat terfokus, yang dipindai di atas
spesimen dalam pola raster persegi. PE memiliki panjang
gelombang yang jauh lebih pendek daripada cahaya, dan
oleh karena itu mikroskop yang menggunakan berkas
elektron memiliki 400 kali daya pisah dari mikroskop optik
sehingga mengungkapkan lebih banyak detail.
Menggunakan EM, ditunjukkan bahwa meskipun spesies
bakteri beragam dalam bentuk, organisasi mereka pada
dasarnya serupa: sel-sel kecil sekitar 0,3-10sayam tebal,
tertutup dalam membran dan terbungkus dalam dinding
sel yang kaku, tanpa kompartemen interior yang berbeda.
Faktanya, bakteri, yang memiliki struktur sel prokariotik,
tidak memiliki organel yang terikat membran di dalam
selnya dan DNA mereka sebagian besar termasuk dalam
satu molekul melingkar tertutup.
Jenis mikroskop elektron yang paling umum disebut
mikroskop elektron pemindaian konvensional (CSEM), dan
teknik terkaitnya memiliki catatan panjang dan terkenal di
bidang biomaterial. CSEM menawarkan keunggulan unik seperti
resolusi tinggi dan kedalaman bidang yang besar, dan alat
terkait telah berkembang menjadi instrumen terintegrasi yang
kompleks yang sering kali menggabungkan beberapa aksesori
penting. Peningkatan prinsip mereka berasal dari metode
membangun gambar dengan mendeteksi sinyal elektron yang
dihasilkan oleh berkas insiden dan dipancarkan dari spesimen,
sambil memindai di seluruh permukaan. Akibatnya, seluruh
kolom mikroskop, termasuk ruang sampel, beroperasi di bawah
vakum tinggi (<10)5torr) (1 torr¼ 133 Pa) untuk mencegah
hamburan gas baik sinar datang atau elektron yang dihasilkan.
Kehadiran ruang hampa, bagaimanapun, menyiratkan bahwa
sampel tidak boleh mengandung spesies yang mudah
menguap; mereka harus padat dan kering. Sampel yang
terhidrasi dalam keadaan aslinya (misalnya jaringan dan sel
biologis) harus dikeringkan atau dibekukan sebelum
pengamatan. Selain itu, kategori sampel ini menunjukkan
konduktivitas yang rendah dan selalu menjadi tantangan
karena muatan permukaan yang dihasilkan oleh berkas
elektron yang datang harus dibuang untuk mencegah distorsi
gambar. Melapisi spesimen dengan lapisan tipis bahan
konduktif listrik akan menghilangkan elektron dan mencegah
penumpukan muatan. Namun, persiapan spesimen dapat
memperkenalkan artefak dengan mengubah morfologi
spesimen sedangkan pelapis konduktif dapat mengaburkan
informasi internal
776 Jurnal Endodontik internasional,38,775–788, 2005
dengan menghalangi sinyal elektron keluar (Littledkk.
1992). Akhirnya, preparasi sampel menyiratkan bahwa
spesimen tidak mempertahankan keadaan aslinya.
Akibatnya, strategi terapi endodontik tidak dapat
diamati atau diujidi tempat.Prinsip CSEM dan masalah
teknisnya akan dibahas di bagian selanjutnya.
Untuk mengatasi keterbatasan CSEM, jenis SEM
kedua yang disebut mikroskop elektron pemindaian
lingkungan (ESEM) telah dikembangkan. Versi
komersial pertama dari produk ini dibuat oleh
ElectroScan Corporation (Wilmington, MS, USA;
kemudian dibeli oleh FEI/Philips Electron Optics)
bersama dengan karya GD Danilatos (Danilatos
1988, 1993a) lebih dari satu dekade lalu. Dalam
beberapa tahun terakhir, ESEM telah mulai
memberikan dampak di berbagai bidang material;
perluasan yang dapat dibuktikan dari peningkatan
jangkauan aplikasi dalam rentang waktu yang
singkat (Danilatos 1993b). Keuntungan utama ESEM
adalah sampel terhidrasi dan non-konduktor, seperti
jaringan biologis dan sel (bakteri), dapat dicitrakan
tanpa dehidrasi atau pelapisan konduktif
sebelumnya. Oleh karena itu ESEM berbeda dari
CSEM dalam dua aspek penting. Pertama,)6–10)7tor.
Di sekitar sampel, tekanan hingga 10-20 torr dapat
ditoleransi dan semua parameter operasional dapat
divariasikan dalam suatu rentang, yang merupakan
fungsi dari tekanan. Dengan cara ini, jika uap air
adalah gas dalam ruang sampel, sampel terhidrasi
seperti bakteri saluran akar dapat dicitrakan dalam
keadaan 'asli' mereka. Perbedaan utama kedua
antara ESEM dan CSEM adalah bahwa isolator tidak
perlu lagi dilapisi dengan lapisan logam sebelum
pencitraan. Karena gas hadir di dalam ruangan, ada
mekanisme untuk membantu menghilangkan
penumpukan muatan yang disuntikkan oleh berkas
elektron yang datang. Secara teknis, ESEM
didasarkan pada integrasi pemompaan diferensial
yang efisien dengan desain baru optik elektron dan
sistem deteksi. Prinsip-prinsip fisik dan tuntutan
teknis ESEM akan dibahas secara komprehensif di
bawah ini.
Jenis terakhir EM, yang diidentifikasi sebagai
mikroskop elektron transmisi (TEM), menawarkan sifat
unik seperti resolusi tinggi. TEM melibatkan penyinaran
seluruh spesimen atau bagian ultra-tipis (80-90 nm)
yang cukup tipis untuk mentransmisikan setidaknya
50% PE (Bancroft & Stevens 1996) menggunakan energi
berkas elektron dalam kisaran 60-350 keV. Untuk bahan
amorf, kontras dicapai dengan variasi hamburan
elektron saat elektron melintasi bahan kimia dan
kanJurnal Endodontik Internasional 2005

perbedaan fisik dalam spesimen. Berkas elektron yang
ditransmisikan yang muncul difokuskan oleh sistem lensa
untuk membentuk gambar dua dimensi yang diperbesar.
Keuntungan utama dari TEM adalah daya pisahnya.
Resolusi maksimum yang dapat diperoleh (1–2 nm untuk
sebagian besar bahan biologis) dibatasi oleh sifat spesimen
dan teknik yang terlibat dalam preparasi spesimen. Dalam
pencegahan artefak, prosedur persiapan umum spesimen
untuk TEM melibatkan pemrosesan laboratorium yang
relatif kompleks dan lama. Spesimen tetap dan dehidrasi
umumnya tertanam dalam resin epoksi dan diwarnai
dengan logam berat (misalnya kalium permanganat atau
osmium tetroksida) untuk meningkatkan kontras gambar
sebelum pemotongan ultra-tipis menggunakan
ultramikrotom dengan pisau kaca atau berlian (Nairdkk.
2005). Untuk penelitian mikroba endodontik, bagian ini juga
telah diwarnai dengan asam tanat dan pewarnaan
ruthenium red sebelum diperiksa di mikroskop (Haapasalo
1986, Sundedkk.2002). Teknik preparasi lain yang dapat
digunakan adalah cryosectioning dan freeze fracturing
(diikuti dengan freeze etching dan produksi replika)
(Haapasalo 1986, Matiasdkk.2003). Akhirnya, ketebalan
bagian terutama menentukan resolusi yang dapat
diperoleh dalam TEM, dan oleh karena itu pembuatan
bagian sangat penting dalam mempersiapkan bahan untuk
pemeriksaan ultrastruktur yang halus.
Pengamatan bakteri menggunakan ESEM
berlawanan dengan CSEM
Teknik CSEM dan preparasi sampel
Untuk SEM, pada dasarnya dua jenis sumber elektron dapat
digunakan untuk membentuk berkas elektron: (i) emisi
termionik (tungsten, Lanthanum Hexaboride atau filamen
serium) dan (ii) emisi medan (Fe). Yang terakhir membutuhkan
kondisi vakum ultra-tinggi dan dengan demikian peralatan yang
sesuai. Berkas elektron, yang biasanya memiliki energi mulai
dari beberapa kV hingga 50 kV, difokuskan oleh lensa
kondensor menjadi berkas dengan ukuran titik yang sangat
halus (-5 nm). Sinar kemudian melewati lensa objektif di mana
pasangan kumparan pemindai membelokkan sinar di atas area
persegi panjang dari permukaan sampel. Saat PE menyerang
permukaan, mereka secara inelastis tersebar oleh atom di
'tempat' dan energi berkas secara efektif tersebar pada jarak
tertentu ke dalam sampel. Interaksi di wilayah ini menyebabkan
emisi elektron: (i) elektron sekunder berenergi rendah (SE atau
SE-I) (£50 eV) yang dihasilkan oleh tumbukan inelastis dengan
elektron orbital dan terlepas dari spesimen itu sendiri dan (ii)
kanJurnal Endodontik Internasional 2005
Bergman dkk.Pengamatan bakteri dengan ESEM
energi tinggi backscattered (atau tercermin) elektron (BSE)
(>50 eV) yang timbul dari tumbukan elastis antara PE dan
inti atom. Sinyal elektron ini dikumpulkan dan diperkuat
oleh kisi atau detektor yang dibias positif, dan hasil analisis
ditampilkan sebagai intensitas tertentu di layar pada posisi
yang mewakili posisi titik sinar datang. Pembesaran
dihasilkan dari rasio area yang dipindai pada spesimen
dengan area layar. Oleh karena itu, peningkatan
perbesaran dalam CSEM dapat dicapai dengan cukup
sederhana dengan memindai berkas elektron pada area
spesimen yang lebih kecil. Mode gambar yang paling
umum memonitor sinyal SE. Karena energinya yang
rendah, elektron-elektron ini harus berasal dalam beberapa
nm (atau kurang) dari permukaan spesimen sehingga
memberikan informasi topografi. Kecerahan sinyal yang
dihasilkan tergantung pada luas permukaan yang terkena
sinar utama. Area ini relatif kecil untuk permukaan datar
tetapi meningkat untuk permukaan curam yang cenderung
lebih cerah; jadi gambar akhir adalah semu tiga dimensi.
Sinyal SE yang dipancarkan dideteksi oleh perangkat
scintillatorphotomultiplier, biasanya detektor Everhart–
Thornley (detektor E–T) (Everhart & Thornley 1960). Selain
SE, sinyal BSE juga dapat dideteksi. Karena energinya yang
jauh lebih tinggi, elektron-elektron ini dapat tersebar dari
cukup jauh di dalam sampel sehingga menghasilkan
kontras topografi yang lebih sedikit daripada kasus SE.
SADARI memiliki arah yang pasti. Dengan demikian, mereka
tidak dapat dikumpulkan oleh detektor SE standar kecuali
jika detektor tersebut secara langsung berada di jalur
perjalanannya.
Selain efek emisi dan sinyal, elektron dapat terakumulasi
pada permukaan bahan non-konduktif dan akan terjadi
pengisian. Pada energi sinar rendah, sebagian besar SE
dihasilkan tepat di bawah permukaan spesimen dan
sebagian besar akan hambur balik ke ruang hampa.
Sebaliknya, energi sinar tinggi menembus jauh lebih dalam
dan sebagian besar SE yang dihasilkan tidak dapat lepas,
sehingga pengisian akan lebih mungkin terjadi (Egerton
dkk.2004). Medan negatif dari permukaan pengisian
membelokkan berkas elektron yang datang dari arah yang
diinginkan dan menyebabkan penyimpangan gambar.
Penghapusan pengisian spesimen dapat dicapai dengan
mengurangi tegangan percepatan di bawah titik pengisian,
atau dengan pelapisan konduktif. Ketika mikroskop
digunakan pada tegangan percepatan rendah, resolusinya
sangat berkurang. Oleh karena itu, pengendapan film
konduktif umumnya lebih disukai.
Terlepas dari sifat non-konduktifnya, spesimen biologis,
dalam keadaan aslinya, terhidrasi pada suhu di atas 0 -C.
Oleh karena itu, spesimen tersebut tidak dapat
ditempatkan langsung ke dalam CSEM karena air akan
Jurnal Endodontik internasional,38,775–788, 2005 777
 Pengamatan bakteri dengan ESEMBergman dkk.
menguap dan mengganggu generasi elektron dan sistem
deteksi sehingga membentuk artefak. Dalam kasus sampel
yang mengandung cairan halus, yang menjadi berlubang
saat dikeringkan, sering kali terjadi keruntuhan total. Untuk
menghindari masalah ini, diperlukan serangkaian langkah
pemrosesan yang kompleks dan ekstensif untuk
pengamatan spesimen terhidrasi yang andal di bawah
vakum (ultra) tinggi. Beragam protokol laboratorium telah
dijelaskan dalam literatur dan umumnya melibatkan fiksasi
(pra) berturut-turut, dehidrasi/pengeringan atau
pembekuan, pelapisan dengan bahan konduktif elektron
dan pengamatan (Watson dkk.1980, Bancroft & Stevens
1996, Van Meerbeek dkk.2000). Tujuan utama dari fiksasi
adalah untuk mempertahankan struktur jaringan dalam
kondisi sedekat mungkin dengan kehidupan. Larutan
fiksatif paling populer yang digunakan saat ini adalah
fiksatif aldehida (glutaraldehida atau formaldehida) yang
dibuat dalam buffer fosfat atau cacodylate. Dehidrasi
mengacu pada penghilangan air dari massa jaringan tetap
oleh pelarut organik dan umumnya dilakukan dalam
serangkaian larutan etanol atau aseton berair konsentrasi
rendah ke agen dehidrasi absolut. Setelah dehidrasi selesai,
spesimen harus dikeringkan dengan cara yang
menyebabkan distorsi minimal dan gangguan arsitektur
jaringan. Pengeringan udara sederhana (termasuk
penguapan dengan panas atau di bawah vakum) harus
dihindari. Metode yang paling banyak digunakan untuk
mempersiapkan jaringan biologis dikenal sebagai 'critical-
point drying' (CPD).2). CO2 cair2kemudian dihilangkan
dengan konversi ke bentuk gas dengan menaikkan suhu
dan tekanan ke titik kritis. CPD menghindari pembentukan
artefak dengan tidak pernah membiarkan antarmuka
cairan/gas berkembang; dengan cara ini jaringan tidak
terkena gaya tegangan permukaan. Teknik alternatif yang
disebut freezedrying (FD) menghilangkan air sebagai uap
langsung dari es (sublimasi) tanpa melewati keadaan cair.
FD sangat efektif dalam memproses komponen kimia
sehingga organisme hidup kecil dapat diawetkan dan tetap
hidup selama dan setelah proses: mereka beralih ke
keadaan tidak aktif dimana mereka dapat dihidupkan
kembali dengan penambahan air (misalnya industri
suplemen nutrisi). Selain CPD dan FD, metode pengeringan
kimia, seperti pengeringan HMDS menggunakan
hexamethyldisilazane telah dianjurkan untuk preparasi
spesimen biologis (Perdigãodkk.1995). Selain dehidrasi/
pengeringan spesimen, spesimen juga dapat dibekukan
(Cryo-SEM) dalam nitrogen cair atau Freon berpendingin
nitrogen cair. Pembekuan mencegah uap mengganggu
generasi elektron dan
778 Jurnal Endodontik internasional,38,775–788, 2005
sistem detektor, asalkan suhu yang cukup rendah tercapai
dan dipertahankan selama pemeriksaan. Teknik ini
memungkinkan sejumlah besar spesimen berhasil diperiksa
tanpa dehidrasi, meskipun memiliki beberapa keterbatasan
termasuk kemungkinan kerusakan kristal es karena
kegagalan untuk membekukan jaringan dengan cukup
cepat.
Setelah spesimen dipasang pada rintisan dengan
karbon konduktif atau perekat berbasis perak, itu harus
dilapisi sesegera mungkin. Metode khas untuk deposisi
adalah pelapisan sputter. Spesimen dimasukkan ke
dalam ruang vakum dan film tipis (15-20 nm) dari bahan
konduktif (paling sering emas, emas/paladium, atau
platinum) disimpan. Sepanjang seluruh prosedur,
metode yang tepat untuk memanipulasi
mikroorganisme harus diadopsi. Persyaratan
tergantung pada apakah bakteri diproses dalam
suspensi, dalam jaringan, dalam kultur jaringan, atau
pada agar-agar.untuk tutorial lihat Watsondkk.1980).
Teknik ESEM (tidak diperlukan preparasi sampel)
ESEM, karena modifikasi teknis, memungkinkan variasi
lingkungan ruang spesimen melalui berbagai komposisi
yang berhubungan dengan tekanan, suhu dan gas.
Oleh karena itu, sampel terhidrasi (air bebas atau
lembab) dan isolasi dapat diperiksa tanpa persiapan
(Donald 2003). Teknik ESEM mengaitkan dua modifikasi
teknis dibandingkan dengan CSEM: (i) pemisahan kolom
vakum tinggi dari ruang spesimen vakum rendah
menggunakan aperture pembatas tekanan (PLA) dan (ii)
jenis detektor baru: 'perangkat pendeteksi gas' ( GDD)
(Danilatos 1990). Pada dasarnya, sistem khusus yang
berisi pompa dan katup menciptakan serangkaian zona
vakum/tekanan yang dipompa secara berbeda yang
dipisahkan oleh PLA. Lubang ini cukup besar untuk
memungkinkan berkas elektron melewati, tetapi masih
cukup kecil dan berorientasi khusus untuk membatasi
aliran gas dari satu kompartemen ke kompartemen
berikutnya. Di ruang sampel, tekanan umum setinggi
10-20 torr.
Seperti ditunjukkan di atas, vakum tinggi biasanya diperlukan
untuk menghentikan elektron agar tidak dihamburkan oleh
molekul gas yang menyebabkan penurunan kualitas gambar.
ESEM, bagaimanapun, berbeda karena jarak total dengan
keberadaan gas yang signifikan, yang dilalui elektron, dibuat
sesingkat mungkin. Jadi, hanya sebagian elektron yang datang
yang akan mengalami tumbukan sudut besar dengan molekul
gas. Akibatnya fraksi PE yang sangat kecil dikeluarkan dari balok
yang berasal dari kolom, dan probe pusat yang tajam adalah
kanJurnal Endodontik Internasional 2005

dipertahankan dan dilapiskan pada 'rok' yang cukup
lebar (Danilatos 1988). Namun, gas bukanlah partisipan
pasif dalam proses pencitraan; itu memainkan peran
kunci dalam deteksi sinyal. Saat elektron (SE atau BSE)
dipancarkan, mereka juga harus melakukan perjalanan
melalui gas. SE khususnya, karena energinya yang
rendah, memiliki penampang tumbukan yang tinggi
dengan molekul gas dan ionisasi molekul memiliki
kemungkinan yang signifikan untuk terjadi. Setiap
tumbukan pengion menimbulkan elektron anak (atau
lingkungan-SE) yang, seperti SE asli, ditarik ke arah GDD
bermuatan positif dan tumbukan lebih lanjut dapat
terjadi. Fenomena ini dikenal sebagai perkalian kaskade
proporsional dari arus pencitraan. Selain SE lingkungan
yang dihasilkan dalam tumbukan pengion, ion positif
juga diproduksi secara bersamaan. Partikel bermuatan
positif ini tertarik ke permukaan sampel dan menekan
efek muatan negatif seperti yang terlihat pada sampel
isolasi. Mekanisme penekanan muatan ini
memungkinkan pencitraan sel mikroba dalam keadaan
aslinya, tidak dilapisi, dengan pilihan yang relatif besar
dalam mempercepat voltase dan tanpa menyebabkan
artefak terkait pengisian.
Seperti yang dinyatakan, ESEM mengizinkan sejumlah kecil
gas (hingga 10-20 torr) di sekitar sampel. Pada prinsipnya ini
berarti bahwa sampel terhidrasi dapat dijaga agar tetap
terhidrasi sepenuhnya, tetapi dalam praktiknya untuk mencapai
hal ini membutuhkan beberapa pemikiran terutama ketika
menggunakan bahan biologis dengan kandungan air yang
tinggi. Selama proses pencitraan keseluruhan, penting untuk
menyadari (i) stabilitas termodinamika dan kinetik sampel dan
(ii) tekanan dan suhu ruang. Diagram fase untuk air yang
ditunjukkan pada Gambar 1 menunjukkan tekanan parsial uap
air yang diperlukan untuk menstabilkan air cair pada suhu
tertentu. Jika seseorang mencoba bekerja pada suhu kamar,
dapat dilihat bahwa uap air di dalam ruangan adalah
Gambar 1Air cair dapat dibawa ke
dalam kesetimbangan termodinamika
dengan fase uap. Diagram fase untuk
air menunjukkan tekanan parsial uap
air yang diperlukan untuk
Tekanan - Torr
menstabilkan air cair pada suhu
tertentu. Jadi, kondisi kerja tipikal di
ESEM mungkin seperti 2 -C dan 5,3 torr
uap air (Sumber: brosur Instruksi FEI
untuk Philips XL30 ESEM-FeG).
kanJurnal Endodontik Internasional 2005
Bergman dkk.Pengamatan bakteri dengan ESEM
sangat tinggi, dan pencitraan dalam kondisi ini saat ini tidak
praktis. Untuk mencapai kejenuhan, diinginkan untuk
menurunkan suhu sampel tepat di atas titik beku, dan
kemudian hanya diperlukan tekanan gas sedang untuk
menstabilkan air (Tai & Tang 2001). Biasanya ini dilakukan
dengan menggunakan tahap pendinginan Peltier.
ESEM untuk pengamatan patogen endodontik:
pendekatan praktis
Dasar pemikiran dari pendekatan praktis ini adalah untuk
mengilustrasikan kinerja ESEM ketika mengamati tiga
patogen endodontik umum dalam keadaan aslinya.di
tempat.Oleh karena itu, pemeriksaan di bawah kondisi
lingkungan (ESEM) dibandingkan dengan pemeriksaan di
bawah vakum tinggi konvensional (CSEM).
Pemilihan spesimen dan prosedur inokulasi
Enam gigi manusia yang diekstraksi bebas karies dipilih dan
disimpan dalam larutan kloramin 0,5% dalam air pada suhu 4-C
sampai digunakan. Mahkota gigi diisolasi dan dipreparasi
sedemikian rupa sehingga pemasangannya pada stub
spesimen dimungkinkan dengan permukaan datar yang
diposisikan secara horizontal. Permukaan ini dipotong sejajar
dengan bidang koronal sedekat mungkin dengan ekstensi pulp
menggunakan gergaji berlian yang berputar (Isomet Saw;
Buehler Ltd, Evanston, IL, USA) di bawah pendingin air. Untuk
memastikan penghapusan lapisan smear lengkap, spesimen
direndam dalam rendaman ultrasonik dengan 2,5% NaOCl
selama 4 menit diikuti oleh 17% EDTA selama 4 menit.
Selanjutnya, kristal sisa dari NaOCl atau EDTA dihilangkan
dalam tiga kali pencucian dengan salin fisiologis selama
masing-masing 2 menit. Sampel disimpan dalam 0,9% garam
fisiologis segar dan didinginkan pada suhu 4-C sampai
digunakan lebih lanjut.
15
Fase padat Fase cair Kekosongan
satuan tekanan
1 Torr sama dengan:
133 Pa
0,75 mbar
10 1 mmHg
0.001316 atm
ESEM
SEM vakum rendah
Fase gas
5
0
– 10 °C 0 °C 10 °C 20 °C 30 ° C
Jurnal Endodontik internasional,38,775–788, 2005 779
 Pengamatan bakteri dengan ESEMBergman dkk.

Sebelum inokulasi, sampel dentin diautoklaf pada pencitraan dalam lingkungan gas. Pengamatan dilakukan pada
suhu 134 -C selama 15 menit dan ditempatkan dalam tegangan 5-10 kV.
botol bijou steril dengan permukaan datar menghadap Sepanjang percobaan, menjadi jelas bahwa kultur
ke atas. Selanjutnya, botol bijou diisi dengan kaldu infus murni dariF. inti seltidak dapat dicitrakan (alasan masih
otak-jantung (BHI) (37 g L .).)1; Oxoid Ltd, Basingstoke, belum diketahui). Oleh karena itu, prosedur ini berhasil
UK) diinokulasi dengan strain Streptococcus anginosus ( diulang dengan menggunakan kultur campuran
LMG 14502) (2/6 sampel), Enterococcus faecalis (LMG F. inti seldanE. feses.Mikrograf ESEM yang dihasilkan
7937) (2/4 sampel yang tersisa) atauFusobacterium dari semua galur disajikan pada Gambar 2-4.
nucleatum (LMG 13131) (dua sampel tersisa) dari
Koleksi Mikroorganisme Terkoordinasi Belgia (BCCMTM).
Pengamatan paralel dengan CSEM
Konsentrasi awal suspensi distandarisasi pada
kepadatan sel 4·108sel mL)1. 20sayaUji L larutan ini Tiga sampel yang dipilih untuk CSEM (satu dari setiap
ditebarkan pada pelat agar darah (BA) (Blood Agar Base strain) diambil dan 20sayaUji L dari masing-masing larutan
II-; Oxoid Ltd), dilengkapi dengan haemin (5 mg mL)1), inokulasi disebarkan pada pelat BA dan diinkubasi selama 7
menadion (1 mg mL)1), 5% darah kuda steril, dan 0,8% hari (dalam kondisi anaerob: 80% N2, 10%
(b/v) Bacto Agar (Difco Laboratories, Detroid, MI, USA),
dan diinkubasi selama 24 jam untuk memastikan
vitalitas mikroorganisme pada titik inokulasi. Botol bijou
yang diisi diinkubasi dalam kondisi anaerobik (Concept
300 Anaerobic Workstation; Ruskin Technology,
Bradford, UK) selama 2 hari sebelum pengamatan
dengan ESEM atau CSEM (satu dari setiap galur per
metode).

Pengamatan dengan ESEM

Tiga sampel yang dipilih untuk ESEM (satu dari setiap

strain) diambil dan 20sayaUji L dari masing-masing
larutan inokulasi disebarkan pada pelat BA dan
diinkubasi selama 7 hari (dalam kondisi anaerob: 80% N
2, 10% CO2dan 10% H2) untuk mengkonfirmasi vitalitas Gambar 2Spesimen perintis dariS. anginosusmelekat pada
permukaan dan dapat berkembang biak membentuk koloni mikro
mikroorganisme dalam larutan pada akhir percobaan.
(ko-agregasi) sehingga menghasilkan pertumbuhan yang konfluen
Sampel ESEM dilihat secara langsung dalam mode
(10.000·, Fe-ESEM).
'Basah' lingkungan dengan Philips XL30 ESEM-FeG (FEI/
Philips Electron Optics, Eindhoven, Belanda) yang
dilengkapi dengan senapan elektron emisi Lapangan
Schottky. Dua PLA memisahkan ruang mikroskop dari
kolom FeG, sehingga menciptakan tiga wilayah yang
dipompa secara terpisah. Tekanan ruang aktual dan
suhu spesimen dikendalikan dari antarmuka pengguna
grafis MS Windows dan diatur untuk membawa air cair
ke kesetimbangan termodinamika dengan fase uap.
Saat bekerja pada suhu 4 -C, tekanan gas 3-5 torr, dan
dimasukkannya beberapa tetes air sebelum prosedur
pemompaan, diharapkan kondisi optimal untuk
mempertahankan kelembaban relatif 80-85%. Tahap
spesimen berpendingin Peltier memungkinkan
pengaturan suhu spesimen sebelum dan selama
pengamatan. Detektor elektron sekunder gas (GSED) Gambar 3Pertumbuhan konfluen dariE. faecalistelah
dipasang di bawah rakitan lensa akhir untuk menghasilkan pembentukan biofilm. Struktur tiga dimensi yang
memungkinkan elektron sekunder terorganisir ini terlampir dalam matriks EPS (10.000·,Fe-ESEM).

780 Jurnal Endodontik internasional,38,775–788, 2005 kanJurnal Endodontik Internasional 2005

 Bergman dkk.Pengamatan bakteri dengan ESEM

Gambar 4Fusobacterium nucleatumspesies (panah) terlihat Gambar 6Beberapa spesimen dariE. faecalistelah melekat pada
menggunakan ESEM hanya dalam kultur campuran denganE. feses. permukaan dentin sementara yang lain menginvasi tubulus dentin.
Bahkan saat itu sel-sel mereka tidak begitu jelas dibedakan dengan (10 000·,Fe-CSEM).
sel kokus (5000·,Fe-ESEM).

APA2dan 10% H2) untuk mengkonfirmasi vitalitas

mikroorganisme dalam larutan pada akhir percobaan. Sampel
CSEM difiksasi selama 12 jam pada 4 -C dalam 2,5%
glutaraldehida dalam 0,1 mol L)1buffer natrium cacodylate pada
pH 7,4, dibilas dalam 0,2 mol L)1buffer natrium cacodylate pada
pH 7,4 selama 1 jam dengan tiga perubahan, dibilas dengan air
suling selama 1 menit, dan kemudian didehidrasi dalam
serangkaian penangas etanol menaik. Sampel yang didehidrasi
diangin-anginkan setelah rendaman heksametildisilazan,
dipasang pada stub aluminium dengan tab berperekat karbon
atau dengan cat perak, dilapisi sputter dengan emas (Perangkat
sputtering 07 120; Balzers Union, Liechtenstein), dan diamati
dengan Philips XL20 Fe-SEM ( Philips Co., Eindhoven, Belanda)
Gambar 7Mikrograf CSEM ini menunjukkan koloni dariF. inti sel
digunakan dalam vakum tinggi konvensional
danE. feses.Kedua spesies dapat dengan jelas dibedakan (5000·,
Fe-CSEM).

mode dengan SE-detektor konvensional. Pengamatan

dilakukan pada 10 kV. Adapun ESEM, prosedur diulang
menggunakan kultur campuranF. inti seldan
E. feses.Mikrograf CSEM yang dihasilkan dari semua galur
disajikan pada Gambar 5-7.

Validasi teknik ESEM untuk pengamatan

bakteri

Kualitas gambar mikrograf ESEM

Gambar 5sel dariS. anginosustelah mengkolonisasi dentin.

Gambar CSEM memiliki resolusi lebih tinggi dan lebih sedikit
noise dibandingkan gambar ESEM analog (Gbr. 2). Detail
struktur dentin seperti serat kolagen dapat diamati (10.000·, Fe-
CSEM).
Kualitas gambar yang baik sangat penting untuk
interpretasi yang benar dari informasi yang diperoleh.
Mikrograf ESEM terdiri dari nilai abu-abu, dan kontras
dan resolusi penting. Menurut prinsip ESEM, gambar
dibangun dengan mendeteksi elektron

kanJurnal Endodontik Internasional 2005 Jurnal Endodontik internasional,38,775–788, 2005 781

 Pengamatan bakteri dengan ESEMBergman dkk.
sinyal yang dipancarkan dari spesimen selama pemindaian
permukaan. Oleh karena itu, ketika memeriksa kualitas gambar,
banyak faktor yang harus dipertimbangkan. Yang paling
penting adalah: optik elektron, spesimen dan perangkat
detektor.
Mengenai pembentukan berkas, sumber elektron jenis
Fe umumnya lebih disukai daripada yang termionik.
Sumber Fe jauh lebih terang (memungkinkan bekerja pada
kV rendah) dan menghasilkan berkas elektron yang sangat
sempit, sehingga meningkatkan kontras dan resolusi
gambar. Namun demikian, sumber Fe membutuhkan
vakum ultra-tinggi (10)10torr) di ruang emisi dan harus
diintegrasikan dalam sistem yang tepat. Dua dari sistem
tersebut (Philips XL30 ESEM-FeG dan Philips XL20 Fe-SEM)
digunakan dalam pendekatan praktis kami.
Seperti disebutkan sebelumnya, instrumen ESEM menggabungkan desain khusus
kolom elektron-optik yang memungkinkan sejumlah tahap tekanan dipertahankan di
sepanjang jalur berkas yang dihasilkan. Akibatnya, berkas elektron yang berasal dari
sumber vakum (ultra-) tinggi akan mengalami peningkatan tekanan gas pada
perjalanannya menuju permukaan spesimen. Kondisi ini pada dasarnya terkait dengan
prinsip ESEM dan telah diselidiki secara menyeluruh. Sebuah kesimpulan muncul pada
tahun 1988 ketika Danilatos (1988, 1993a) menunjukkan bahwa, karena hamburan dan
distribusi dalam gas, sebagian kecil elektron dikeluarkan dari berkas asli (dalam vakum
tinggi) dan didistribusikan kembali dalam 'rok' yang sangat luas yang mengelilinginya.
fraksi utuh yang tersisa (distribusi Gaussian tidak terpengaruh) di tengah. Temuan ini
penting karena itu berarti bahwa daya pisah EM dapat dipertahankan dalam kehadiran
gas yang rendah. Menurut publisitas beberapa produsen, ESEM saat ini menawarkan
kemampuan untuk mengambil gambar spesimen pada resolusi spasial yang sangat
tinggi; setinggi 2-5 nm dalam beberapa kasus. Seperti yang ditunjukkan di bawah ini,
mencapai resolusi optimal untuk sampel biologis lembab dalam praktik seringkali jauh
dari mudah. Namun demikian, untuk banyak kelas sampel ketidaknyamanan kehilangan
resolusi lebih dari sebanding dengan kemampuan untuk melakukan eksperimen yang
sama sekali baru. mencapai resolusi optimal ini untuk sampel biologis lembab dalam
praktiknya seringkali jauh dari mudah. Namun demikian, untuk banyak kelas sampel
ketidaknyamanan kehilangan resolusi lebih dari sebanding dengan kemampuan untuk
melakukan eksperimen yang sama sekali baru. mencapai resolusi optimal ini untuk
sampel biologis lembab dalam praktiknya seringkali jauh dari mudah. Namun demikian,
untuk banyak kelas sampel ketidaknyamanan kehilangan resolusi lebih dari sebanding
dengan kemampuan untuk melakukan eksperimen yang sama sekali baru.
Elektron pensinyalan terbentuk pada tumbukan
antara PE dari berkas insiden dan atom dari spesimen
yang diselidiki. Jenis pertama dari elektron yang
dipancarkan, yang disebut elektron sekunder, muncul di
daerah dekat permukaan sampel sehingga memberikan
informasi topografi. Adapun CSEM, detail topografi
sangat tergantung pada diameter 'spot' balok. Besarnya
sinyal yang dihasilkan tergantung pada energi dan arus
sinar datang: emisi SE meningkat seiring dengan
peningkatan energi PE sampai a
782 Jurnal Endodontik internasional,38,775–788, 2005
batas tertentu tercapai. Di luar batas ini, berkas tersebut
mengaktifkan elektron jauh di bawah permukaan; elektron ini
biasanya bergabung kembali sebelum mencapai permukaan
untuk emisi.
Selain SE, sinar datang menghasilkan emisi
backscattered electron (BSE), yang mungkin tersebar dari
cukup dalam di dalam sampel sehingga menghasilkan
detail topografi yang lebih sedikit daripada untuk kasus SE.
Menariknya, besarnya sinyal yang dihasilkan adalah fungsi
lemah dari nomor atom (Z) elemen komposisi. Dengan cara
ini, pencitraan BSE praktis dalam membedakan elemen
struktural dalam sampel sehingga memberikan informasi
komposisional (internal). Pada tingkat yang lebih dalam ini,
ukuran tempat telah diperluas oleh beberapa efek
hamburan dan hanya sejumlah kecil BSE yang dihasilkan
yang akan dideteksi oleh detektor SE karena arahnya yang
pasti. Akibatnya, sinyal BSE biasanya memiliki resolusi yang
lebih rendah dan lebih berisik daripada sinyal SE. Untuk
memecahkan sebagian masalah ini, tambahan terintegrasi
BSE-detektor dapat digunakan. Dengan demikian, sinyal
BSE dari struktur sel dapat ditingkatkan dengan
pengenalan noda logam berat (misalnya kalium
permanganat atau osmium tetroksida).
Terlepas dari kenyataan bahwa generasi sinyal elektron
tampaknya agak sederhana, memperoleh hasil yang baik
selama pengamatan ESEM jaringan biologis dalam keadaan
asli tidak mudah (Gilbert & Doherty 1993, Gwinnett 1994,
Thibergedkk.2004). Topik diskusi pertama adalah fakta
bahwa kehadiran film berair pada permukaan sampel
tampaknya membatasi pengamatan topografi. Memang,
telah dilaporkan bahwa pada perbesaran tinggi detail
permukaan tidak dapat dicitrakan; pada perbesaran rendah
kontras gambar ESEM setidaknya berkurang (Tai & Tang
2001, Habolddkk.2003). Dengan cara ini matriks EPS antar-
seluler, yang membentuk lapisan terhidrasi dan bermuatan
negatif seperti yang ada dalam biofilm, dapat berdampak
negatif pada pembentukan gambar. Demikian juga, telah
dilaporkan bahwa sinyal BSE yang berasal dari dalam sel
dihalangi oleh air sitoplasmik ketika spesimen biologis
terhidrasi diperiksa secara langsung dalam atmosfer uap
air pada suhu yang dikurangi. Pengeringan titik kritis dan
pengeringan beku dapat meningkatkan sinyal BSE dalam
situasi seperti ini (Collinsdkk.1993). Hal lain untuk diskusi
adalah komposisi kimia sampel. Jaringan dan sel biologis
terdiri dari elemen nomor atom (Z) rendah seperti karbon
dalam sel (Z¼6) dan oksigen dalam air (Z¼8). Saat kita
membayangkan perbedaan dalam hamburan antara unsur-
unsur dengan nomor atom sejenis, kontras yang dihasilkan
akan sering rendah dan mungkin sangat bergantung pada
konsentrasi lokal.
kanJurnal Endodontik Internasional 2005

ion yang lebih berat. Seperti ditunjukkan di atas, pengendapan
logam dengan nomor atom tinggi pada struktur jaringan
meningkatkan kerapatan elektron spesimen. Ketika diterapkan pada
situs tertentu di dalam sel, jenis pewarnaan ini dapat meningkatkan
kontras gambar dan mengungkapkan lebih banyak informasi.
Sebagai poin terakhir, beberapa peneliti telah menyarankan
penggunaan perangkat lunak komputer yang menggunakan
algoritma pemrosesan gambar untuk menyaring variasi kontras.
Prosedur ini dapat digunakan untuk mengoptimalkan kontras
gambar dan dengan demikian mengekstrak formasi gambar yang
seharusnya tidak terlihat (Habolddkk.2003). Meskipun demikian,
pendekatan yang paling dapat diandalkan untuk mendapatkan
kualitas gambar yang baik adalah dengan mengadopsi perangkat
keras terbaik yang tersedia sambil menggunakan kondisi optimal
untuk pemindaian.
Dengan asumsi bahwa pembentukan gambar tidak
mudah, interpretasi gambar mungkin juga tidak
sederhana. Memang, banyak pengguna telah
menyatakan bahwa memahami kontras yang diamati
pada gambar ESEM jauh dari masalah sepele. Berbagai
penelitian telah menunjukkan bahwa ada sumber
kontras dalam ESEM yang umumnya tidak terlihat di
CSEM, setidaknya sebagian karena adanya lapisan
logam standar mengaburkan sinyal emisi sebenarnya
dari sampel (Peters 1982, Collinsdkk. 1993, Schnarr &
Futing 1997, Griffin 2000, Toth & Phillips 2000, Thiberge
dkk.2004). Jelas, kontras 'tambahan' muncul dari variasi
hasil elektron yang dihasilkan oleh perbedaan struktur
elektronik lokal dan oleh rekombinasi beberapa
elektron yang dipancarkan dengan ion dari gas (Stokes
dkk.1998, Totodkk.2002). Akibatnya, orang tahu bahwa
kontras terkait dengan gerakan muatan dalam sampel
dan parameter operasi instrumen. Sebuah interpretasi
pemersatu kontras sejauh ini tidak lengkap.
Tanpa ragu, faktor penting dan terakhir yang
mengontrol kualitas gambar adalah perangkat
detektor. Dasar-dasar ESEM menciptakan tantangan
untuk mendeteksi aliran listrik dalam gas, yang telah
menyebabkan penemuan jenis detektor baru: GDD
(Danilatos 1990). Untuk menekankan kemungkinan
deteksi SE di lingkungan gas, ElectroScan
memperkenalkan akronim ESD (detektor sekunder
lingkungan), yang saat ini dikenal sebagai GSED. Fungsi
utama GSED adalah untuk membedakan (paling)
elektron pembentuk kebisingan dengan menggunakan
elektroda penekan dan cincin detektor. Selama
bertahun-tahun, desain optimal dan posisi geometris
detektor telah ditentukan. Secara khusus, deteksi BSE
yang tepat agak sulit karena hamburan melalui sudut
mendekati 180-. Dengan membuat detektor BSE yang
mengelilingi detektor SE tepat di atas spesimen,
kanJurnal Endodontik Internasional 2005
Bergman dkk.Pengamatan bakteri dengan ESEM
sistem detektor yang ditingkatkan diperoleh (Collins
dkk.1993).
Sampai titik ini, tidak ada perhatian yang diberikan pada
sinyal lain yang dapat dihasilkan ketika sinar datang
memindai seluruh permukaan spesimen di CSEM dan ESEM.
Faktanya, selain emisi SE dan BSE, penyerapan energi PE
dapat menimbulkan sinar-X dan foton cahaya tampak (efek
yang dikenal sebagai cathodoluminescence atau CL).
Deskripsi pembentukan citra dalam EM sama berlaku untuk
semua sinyal yang dipancarkan kecuali untuk sistem
deteksi yang berbeda setiap waktu. Pengumpulan dan
pendeteksian sinyal-sinyal ini dapat digunakan untuk
menghasilkan informasi lebih lanjut tentang spesimen yang
diselidiki (Danilatos 1988, 1993a, Sigee 1998, Griffin &
Browne 2000). Spektroskopi sinar-X dispersi energi (EDX
atau EDAX), misalnya, termasuk analisis komputer dari
panjang gelombang dan spektrum energi, dapat digunakan
untuk mengukur secara akurat sifat dan jumlah unsur yang
berbeda adalah materi. Namun, teknik ini tidak banyak
berguna bagi ahli mikrobiologi karena elemen ringan
seperti karbon menghasilkan sinyal sinar-X yang terlalu
lemah. Pencitraan SE tetap menjadi yang paling umum
karena dapat digunakan dengan hampir semua spesimen.
Saat ini, berbagai 'sistem lingkungan' tersedia
secara komersial. ESEM asli (yang merupakan merek
dagang dari FEI/Philips Electron Optics) mendeteksi
aliran muatan dalam gas, tetapi ketika produsen lain
memasuki pasar (menjual apa yang disebut
'instrumen tekanan variabel' atau VP-SEM, yang
biasanya belum dapat untuk beroperasi pada
tekanan tinggi karena alasan teknis), berbagai sinyal
digunakan untuk deteksi (Danilatos 1993a, Donald
2003). Untuk semua sistem, satu batasan tampaknya
terletak pada kemurnian detektor gas.
Berkonsentrasi pada ESEM 'sejati', yang mendeteksi
sinyal elektron, tidak ada detektor SE yang benar-
benar mampu mendeteksi sinyal SE murni, dan
detektor BSE bahkan lebih buruk. Untuk jenis ESEM
lainnya, informasi tentang detektor dan deteksi
sinyal 'dominan' mereka bahkan lebih terbatas.
Dalam kebanyakan sistem,
Pengamatan bakteri dalam keadaan 'asli' mereka
Keuntungan yang jelas dari ESEM untuk pengamatan sel
(bakteri) adalah kemampuan untuk melihat spesimen biologis
secara langsung tanpa dehidrasi atau pelapisan, yaitu dalam
keadaan aslinya (Collinsdkk.1993). Lebih dari mengurangi waktu
persiapan, aplikasi langsung ESEM memungkinkan
Jurnal Endodontik internasional,38,775–788, 2005 783
 Pengamatan bakteri dengan ESEMBergman dkk.
spesimen halus untuk dilihat dengan gangguan
mekanis minimal (McKinlaydkk.2004) dan tanpa
mengaburkan kontras internal. Namun, ketika
memvalidasi teknik ESEM untuk pengamatan bakteri,
kita harus ingat bahwa sel yang diinginkan adalah
mikroorganisme hidup. Untuk menentukan karakter
ESEM yang tidak rusak, kelangsungan hidup bakteri
selama seluruh prosedur pemindaian harus diselidiki.
Oleh karena itu, bagian ini akan fokus pada dua aspek
yang berhubungan dengan viabilitas: kerusakan sinar-
radiasi dan kondisi lingkungan di ruang spesimen.
Belum diketahui apakah sel hidup (bakteri) dapat
dilihat tetapi tidak dibunuh oleh berkas elektron
(National Research Council 1990, Donald 2003).
Sebenarnya, pertanyaan ini agak rumit dan banyak
masalah yang terlibat. Semuanya dimulai dengan
pengiriman PE energi tinggi ke permukaan spesimen
oleh balok insiden. Setibanya di sana, berbagai interaksi
antara elektron dan atom sampel ini terjadi, yang
mengarah pada emisi sinyal pencitraan bersama
dengan insiden kerusakan radiasi. Intensitas dan
hubungan dari jenis interaksi yang berbeda tergantung
pada berkas elektron, lingkungan, dan spesimen itu
sendiri. Secara umum, kerusakan radiasi lebih mungkin
terjadi pada TEM daripada SEM (Egertondkk.2004), dan
ESEM lebih cenderung daripada CSEM karena sifat khas
sampel dan adanya air cair (Royalldkk. 2001). Mengenai
makalah ini, potensi kerusakan ESEM pada sel biologis
(misalnya sel bakteri) akan dieksplorasi lebih lanjut.
Berkas elektron yang digunakan dalam ESEM dapat
menyebabkan perubahan sementara atau permanen pada
permukaan atau struktur massal spesimen biologis. Yang
penting adalah tumbukan tidak elastik (interaksi Coulomb) PE
dengan elektron atom, yang dapat mengakibatkan pemanasan
spesimen dan radiolisis, termasuk kerusakan struktural dan
kehilangan massa (Egertondkk.2004). Pemanasan tidak
diharapkan menjadi masalah utama dalam spesimen curah
karena aliran panas radial dalam tiga dimensi, menyebabkan
kenaikan suhu yang relatif kecil. Sebaliknya, jumlah panas yang
dihasilkan akan jauh lebih tinggi pada benda yang sangat kecil
atau tipis. Radiolisis menyiratkan munculnya ionisasi dan
pemotongan ikatan. Ikatan kimia terputus dan molekul berubah
bentuk dan posisinya, menyebabkan perubahan struktural dan
mungkin penghilangan atom ringan (terutama hidrogen,
nitrogen, dan oksigen). Spesimen organik yang mengandung
ikatan yang relatif lemah biasanya sangat sensitif terhadap
sinar dan sangat rentan terhadap radiolisis. Selain itu, air cair
dalam spesimen bertindak sebagai sumber kecil, radikal bebas
yang sangat mobile (hidroksil
784 Jurnal Endodontik internasional,38,775–788, 2005
radikal), yang mempercepat degradasi spesimen (Royall
dkk.2001). Dengan spesimen massal, kerusakan dihasilkan
dekat dengan permukaan, dalam jangkauan elektron.
Untuk spesimen mikroskopis, bagian yang rusak akan lebih
penting mengingat volume total yang lebih kecil. Meskipun
menurunkan suhu spesimen tidak mengubah penampang
inelastis, hal itu mengurangi sensitivitas spesimen organik
terhadap kerusakan struktural dan kehilangan massa
(Egertondkk.2004). Tentu saja, mendinginkan spesimen
juga akan membantu mencegah pemanasan. Masing-
masing proses yang disebutkan di atas bergantung pada
dosis. Perhatikan bahwa dalam literatur mikroskop
elektron, 'dosis' biasanya berarti paparan elektron: produk
dari rapat arus insiden (yaitu disposisi energi per satuan
volume) dan waktu pemaparan. Menurunkan dosis iradiasi
dapat dicapai dengan menurunkan tegangan percepatan
dan/atau intensitas arus sinar, atau dengan mengubah
mode pemindaian (misalnya menurunkan tingkat
pembesaran) (Donald 2003). Tingkat kerusakan struktural
dan komposisi yang dapat ditoleransi diberikan oleh tujuan
pengaturan eksperimental, dan akan membatasi jumlah
informasi yang dapat diekstraksi oleh ESEM.
Selain kerusakan radiasi sinar, faktor lain dapat
mempengaruhi, mungkin pada tingkat yang lebih rendah,
kondisi kelangsungan hidup bakteri selama prosedur
pemindaian ESEM. Diantaranya adalah faktor-faktor yang
mempengaruhi metabolisme dan pertumbuhan
mikroorganisme di habitat aslinya (yaitu suhu, potensial
redoks, pH dan nutrisi). Jadi, untuk memeriksa kebenarandi
tempat kondisi lingkungan ruang spesimen ESEM, orang
harus mempertimbangkan faktor-faktor ini juga. Menurut
spesifikasi pada strain, suhu optimal untuk kultur bakteri
yang digunakan dalam pendekatan praktis kami adalah 37
-C. Suhu spesimen selama ESEM adalah sekitar 4 -C, oleh
karena itu jauh lebih rendah. Selain suhu, potensi redoks
atau kondisi anaerobik lingkungan dapat dipertimbangkan.
Meskipun anaerobiosis sering digambarkan dalam istilah
yang kaku, perbedaan tajam tidak dapat dibuat dan
spektrum toleransi oksigen yang luas terjadi.Enterococcus
faecalisdanS. anginosusadalah anaerob fakultatif yang
menoleransi adanya konsentrasi oksigen rendah dengan
optimum 5%.Fusobacterium nucleatum termasuk dalam
kelompok anaerob obligat (yaitu mereka membutuhkan
kondisi yang dikurangi untuk metabolisme normalnya) dan
konsentrasi oksigen dianggap sebagai faktor utama yang
membatasi pertumbuhannya. Selama pendekatan praktis
kami, lingkungan gas di ruang spesimen ESEM berisi
campuran uap air dan udara sekitar pada tekanan yang
dikurangi. Kebenaran
kanJurnal Endodontik Internasional 2005

konsentrasi oksigen, bagaimanapun, tidak
ditentukan dan tidak juga implikasinya pada
kelangsungan hidup sel. Untuk lebih menjamin
potensi redoks rendah selama ESEM, mungkin
berguna untuk mengelilingi bakteri dengan cairan
transportasi yang mengandung zat pereduksi.
Faktor penting ketiga untuk kesehatan bakteri
adalah pH di sekitarnya. Banyak mikroorganisme
membutuhkan pH sekitar netralitas untuk
pertumbuhan dan sensitif terhadap asam atau alkali
yang ekstrim. Media yang digunakan dalam
pendekatan praktis kami adalah kaldu BHI dengan
pH 7,4 (±0,2 pada 25 -C) yang dibutuhkan oleh galur
kami untuk pertumbuhan. Sejauh mana pH ini
dipengaruhi oleh kondisi suhu rendah atau radiasi
sinar tidak ditentukan. Setidaknya spesimen tidak
dibilas sebelum pemindaian ESEM,
Teknik non-destruktif lainnya: pesaing ESEM
Selain ESEM, teknik mikroskopis lainnya telah
dieksplorasi dan digunakan dalam desain studi untuk
pengamatan sel (bakteri) dengan cara yang tidak
merusak, yaitu pada keadaan yang paling mendekati
keadaan asli. Bagian ini mengulas pendekatan ini
dengan mendiskusikan prinsip dan aplikasinya.
Teknik pertama, yang dapat dilihat sebagai teknik
modifikasi untuk SEM sel dan jaringan biologis, telah
diusulkan baru-baru ini dengan nama 'SEM
Basah' (Thibergedkk.2004). SEM basah bergantung pada
partisi membran (yaitu membran polimida dengan
ketebalan 145 nm) yang melindungi sampel dari vakum
sementara transparan terhadap berkas elektron. Dengan
cara ini, sampel terhidrasi dapat dipertahankan dalam
kondisi fisiologis sepenuhnya dan dicitrakan dengan sedikit
kehilangan resolusi dibandingkan dengan CSEM. Teknik ini
sekarang dapat digunakan untuk menyelidiki seluruh sel,
memberikan informasi tentang organel dan struktur
internal. Bagian jaringan juga dapat dicitrakan,
memberikan informasi struktural tentang konektivitas dan
organisasi sel dan struktur ekstraselulerdi tempat.
Teknik non-invasif kedua yang disebut laser scanning
confocal microscopy (LSCM) sekarang digunakan untuk
menentukan arsitektur sebenarnya dari plak dan lokasi
bakteri terpilih dalam biofilm (Marsh 2004). Mikroskop
confocal konvensional menghasilkan lapisan tipis (>0,35
sayam) irisan optik hingga 200sayam di bawah permukaan
bahan semi-transparan seperti sel tanpa kerusakan
dehidrasi karena vakum. Tumpukan bagian yang diambil
pada bidang fokus yang berurutan dapat menjadi
kanJurnal Endodontik Internasional 2005
Bergman dkk.Pengamatan bakteri dengan ESEM
direkonstruksi untuk menghasilkan tampilan tiga
dimensi. Mengikuti prinsip confocal, resolusi
mikroskop optik meningkat secara signifikan,
terletak di antara mikroskop cahaya konvensional
dan TEM/SEM (Watson 1991). Teknik paling
sederhana untuk menggunakan mikroskop confocal
adalah memberi label struktur kimia dalam jaringan
biologis dengan pewarna fluoresen (mikroskop
fluoresensi confocal). Selain itu, teknik pencitraan
baru seperti eksitasi laser multi-foton pada pewarna
memberikan potensi penetrasi kedalaman yang
lebih besar dan resolusi yang ditingkatkan (LSCM).
Secara umum, keuntungan utama dari teknik ini
adalah tidak memerlukan pemrosesan spesimen
khusus, karena pengamatan dapat dilakukan dalam
kondisi lingkungan yang dekat. Lewat sini,
Teknik lain untuk pengamatan bakteri yang tidak
memerlukan pengolahan spesimen khusus adalah
mikroskop gaya atom (AFM). Jenis kontak mikroskop
pemindai probe ini telah digunakan untuk mendapatkan
mikrograf bakteri kering di udara sekitar, dan bakteri hidup
dalam media kultur mereka pada resolusi yang mirip
dengan SEM (Robichondkk.1999). Menggunakan AFM,
spesimen yang ditempatkan pada penerjemah piezoelektrik
XYZ dipindai di bawah stylus yang dipasang pada pegas
kantilever, dan fitur permukaan menyebabkan stylus
membelokkan kantilever selama pemindaian. Gerakan
lentur ini diukur dengan mengamati defleksi sudut sinar
laser yang dipantulkan di bagian belakang kantilever.
Dengan umpan balik, gerakan Z dari penerjemah XYZ
dikendalikan, dan gaya kontak antara ujung dan
permukaan spesimen dipertahankan hampir konstan. Pada
akhirnya, gambar 3D sebenarnya dari permukaan sampel
direkonstruksi dari data yang dikumpulkan. AFM dapat
digunakan dalam mode kontak atau dalam mode
penyadapan. Teknik terakhir terdiri dari sedikit mengetuk
ujung di permukaan selama pemindaian, yang secara
dramatis mengurangi kekuatan pencitraan dan
meningkatkan resolusi. Spesimen yang lunak dan rapuh
terutama dipindai dengan lebih baik dalam mode
penyadapan tanpa risiko kerusakan sampel, sambil
mempertahankan resolusi tertinggi. Pencitraan mode
penyadapan dapat dilakukan dalam lingkungan cair
sementara ujung dan objek terendam, dan akibatnya
dimungkinkan untuk mendapatkan mikrograf bakteri hidup
dalam kaldu kultur (Robichondkk.1999). Namun,
interpretasi hasil yang diperoleh sulit karena sifat gaya
interaksi yang berperan antara ujung dan sampel tidak
sepenuhnya dipahami, seperti tingkat deformasi struktur
membran sel 'lunak' oleh AFM keras. tip.
Jurnal Endodontik internasional,38,775–788, 2005 785
 Pengamatan bakteri dengan ESEMBergman dkk.
Arah dan aplikasi masa depan
Sebagian besar kemajuan dalam sains bergantung pada
pengembangan teknik yang tepat untuk menunjukkannya.
Karena ESEM menyediakan cara untuk mencitrakan bakteri
saluran akar secara langsung dalam keadaan aslinya, efek dari
strategi endodontik terapeutik pada penampilan dan distribusi
patogen dapat dipantaudi tempat (misalnya sel bakteri yang
tumbuh sebagai biofilm) secara real time. Untuk meningkatkan
kemungkinan eksperimen semacam itu, peralatan tambahan
ESEM (misalnya mikro-injektor untuk memasok aliran cairan)
dapat diintegrasikan sepenuhnya. Teknik utama seperti sumber
laser dapat dihubungkan juga.Di tempat eksperimen dapat
dilakukan dan direkam di bawah tingkat cahaya sekitar. Ini
karena, tidak seperti detektor ET pada CSEM, GSED tidak peka
terhadap cahaya atau panas.
Dengan mengingat informasi tentang teknik
mikroskopis, beberapa pedoman untuk menguji strategi
perawatan endodontik menggunakan ESEM dapat
dirumuskan. Pertama-tama, penampakan morfologi bakteri
yang utuh tidak berarti bakteri tersebut (masih) hidup.
Kerusakan radiasi dan kondisi lingkungan dapat
menyebabkan kematian sel, bahkan tanpa tanda-tanda
kerusakan seperti penyusutan yang dapat dideteksi oleh
ESEM. Untuk menentukan efek bakterisida dari tindakan
terapeutik, teknik lain (misalnya kultur bakteri dan
mikroskop fluoresen) harus digunakan bersama dengan
ESEM. Selanjutnya, bakteri di bawah kondisi stres (misalnya
kelaparan atau suhu rendah), bukannya masuk ke keadaan
litik, dapat menurunkan aktivitas metabolisme mereka dan
masuk ke keadaan tidak aktif dari mana mereka dapat pulih
setelah itu. Cara perlindungan ini dapat mempengaruhi
kerentanan patogen untuk berbagai iritasi. Sebuah
pertanyaan berulang yang muncul selama diskusi tentang
penerapan informasi ESEM untuk proses dunia nyata
adalah efek dari pengurangan tekanan di ruang ESEM
dibandingkan dengan proses aktual yang terjadi pada
ambient (760 torr) atau tekanan tinggi (Prack 1993). Ini
benar-benar menjadi perhatian ketika Anda
mempertimbangkan bahwa baik keadaan dan interaksi
timbal balik (misalnya sifat pembasahan) zat dapat
berbeda. Untuk mengatasi masalah ini, langkah-langkah
perawatan yang sebenarnya dapat dilakukan baik di dalam
maupun di luar ruang spesimen. Perangkat lunak untuk
penetapan lokasi yang tepat akan memungkinkan relokasi
area yang sama pada permukaan spesimen sebelum dan
sesudah perawatan. Akhirnya, ketika memindai spesimen
dalam media kultur mereka,dkk.1999). Namun, jumlah ini-
786 Jurnal Endodontik internasional,38,775–788, 2005
Elemen pembentuk dapat dibedakan dari bakteri berdasarkan
bentuk, tinggi, dan ukurannya.
Sebagai kesimpulan, teknik ESEM, lebih muda dibandingkan
dengan metode konvensional dan karena itu masih dengan
tantangan teoretisnya, tampaknya memungkinkan pengamatan
bakteri saluran akar dalam keadaan aslinya tanpa persiapan
sebelumnya atau pelapisan konduktif. Lebih dari mengurangi
waktu preparasi, aplikasi langsungnya menyediakan cara untuk
mengeksplorasi efek pada penampilan bakteri dari modalitas
perawatan endodontik menggunakandi tempatlingkungan
pengujian ESEM. Selain itu, dengan instrumen modern yang
mampu dengan cepat beralih antara mode vakum tinggi dan
vakum rendah, pendekatan SEM konvensional dan lingkungan
dapat digunakan secara paralel.
ucapan terima kasih
Penyelidikan ini adalah bagian dari proyek OT/2002/49
(Dana Penelitian KULeuven), dan selanjutnya didukung
oleh Dana untuk Penelitian Ilmiah Flanders (FWO) dan
Lotere Nasional (Environmental SEM, F6/12- AV.F461,
G.0335.01 , Ludo Froyen), dan dengan dana dari Ketua
Toshio Nakao untuk Kedokteran Gigi Perekat yang
diresmikan di Universitas Katolik Leuven dengan
penghargaan Bart Van Meerbeek dan Paul Lambrechts
sebagai ketua. Penulis berhutang budi kepada Rudy De
Vos atas bantuan terampilnya dengan SEM-FeG
konvensional dan lingkungan.
Referensi
Bancroft JD, Stevens A (1996)Teori dan Praktek Histologi-
Teknik.New York: Churchill Livingstone. Collins SP, Pope
RK, Scheetz RW, Ray RI, Wagner PA, Little BJ
(1993) Keuntungan dari mikroskop elektron pemindaian
lingkungan dalam studi mikroorganisme.Penelitian dan
Teknik Mikroskop25,398–405.
Danilatos GD (1988) Yayasan pemindaian lingkungan
mikroskop elektron. Dalam: Hawkes PW, ed.Kemajuan dalam
Elektronika dan Fisika Elektron.Boston: Pers Akademik,
71,109–250.
Danilatos GD (1990) Teori Perangkat Detektor Gas di
ESEM. Dalam: Hawkes PW, ed.Kemajuan dalam Elektronika
dan Fisika Elektron,Jil. 78. Boston: Academic Press, hlm. 1-102.
Danilatos GD (1993a) Pengenalan instrumen ESEM.
Penelitian dan Teknik Mikroskop25,354–61. Danilatos GD
(1993b) Daftar Pustaka Pemindaian Lingkungan
mikroskop elektron.Penelitian dan Teknik Mikroskop
25,529–34.
Darby I, Mooney J, Kinane D (2001) Perubahan subgingiva
mikroflora dan respon imun humoral setelah periode
kanJurnal Endodontik Internasional 2005

terapi gigi.Jurnal Periodontologi Klinis28,796– 805.
Donald AM (2003) Penggunaan pemindaian lingkungan
mikroskop elektron untuk pencitraan bahan basah dan
isolasi.Bahan Alam2,511–6.
Egerton RF, Li P, Malac M (2004) Kerusakan radiasi di
TEM dan SEM.Mikron35,399–409.
Everhart T, Thornley RFM (1960) Detektor pita lebar untuk
arus elektron energi rendah mikro-mikroampere.Jurnal
Penelitian Ilmiah dan Industri37,246–8.
Gilbert LC, Doherty RE (1993) Menggunakan ESEM dan SEM untuk
membandingkan kinerja dentin conditioner.Penelitian
dan Teknik Mikroskop25,419–23.
Greenstein G, Polson A (1985) Pemantauan mikroskopis
patogen yang terkait dengan penyakit periodontal. Sebuah
ulasan. Jurnal Periodontologi56,740–7.
Griffin BJ (2000) Mengisi pencitraan kontras pertumbuhan material
dan cacat pada mikroskop elektron pemindaian lingkungan
- menghubungkan emisi elektron dan katodoluminesensi.
Memindai22,234–42.
Griffin BJ, Browne JR (2000) Spektral berbasis serat optik
cathodoluminescence: pilihan sederhana dan ekonomis untuk
digunakan dalam SEM konvensional dan lingkungan.Mikroanalisis
Mikroskopis6,42–8.
Gwinnett AJ (1994) Dentin yang dikondisikan secara kimiawi:
perbandingan temuan mikroskop elektron pemindaian
konvensional dan lingkungan.Bahan Gigi10,150–5.
Haapasalo M (1986) Bacteroides buccae dan taksa terkait di
infeksi saluran akar nekrotik.Jurnal Mikrobiologi Klinis
24,940–4.
Habold C, Dunel-Erb S, Chevalier C, Laurent P, Le Maho Y,
Lignot JH (2003) Pengamatan mukosa usus
menggunakan mikroskop elektron Scanning lingkungan
(ESEM); dibandingkan dengan mikroskop elektron
pemindaian konvensional (CSEM).Mikron34,373–9.
Little BJ, Wagner PA, Ray RI, Pope R, Scheetz R (1992)
Biofilm: Evaluasi ESEM dari artefak yang diperkenalkan
selama persiapan SEM.Jurnal Mikrobiologi Industri8, 213–
22.
Magnusson I, Liljenberg B, Yoneyama T, Blomqvist N (1985)
Pengambilan sampel mikrobiota subgingiva untuk mikroskop
lapangan gelap.Jurnal Periodontologi Klinis12,209–15. Marsh PD
(2004) Plak gigi sebagai biofilm mikroba.Karies
Riset38,204–11.
Matias V, Al-Amoudi A, Dubochet J, Beveridge J (2003) Cryo-
mikroskop elektron transmisi dari bagian terhidrasi beku
dariEscherichia colidanPseudomonas aeruginosa. Jurnal
Bakteriologi185,6112–8.
McKinlay KJ, Allison FJ, Scotchford CA, Grant DM, Oliver JM,
Raja JR dkk. (2004) Perbandingan mikroskop elektron pemindaian
lingkungan dengan mikroskop elektron pemindaian vakum tinggi
sebagaimana diterapkan pada penilaian morfologi sel.Jurnal
Penelitian Biomaterial dan Material
69,359–66.
kanJurnal Endodontik Internasional 2005
Bergman dkk.Pengamatan bakteri dengan ESEM
Nair P, Henry S, Cano V, Vera J (2005) Status mikroba
sistem saluran akar apikal molar pertama mandibula manusia
dengan periodontitis apikal primer setelah perawatan endodontik
'satu kali kunjungan'.Bedah Mulut Pengobatan Mulut Patologi
Oral Radiologi Oral dan Endodontik99,231–52.
Dewan Riset Nasional (1990)Efek Kesehatan dari Paparan
Tingkat Rendah Radiasi Pengion, Efek Biologis dari Radiasi
Pengion Laporan V.Washington, DC: Pers Akademik Nasional.
Perdigão J, Lambrechts P, Van Meerbeek B, Vanherle G, Lopes
AL (1995) Perbandingan emisi lapangan SEM dari empat
teknik pengeringan pascafiksasi untuk dentin manusia.Jurnal
Penelitian Bahan Biomedis29,1111–20.
Peters KR (1982) Kondisi yang dibutuhkan untuk kualitas tinggi tinggi
gambar perbesaran dalam mikroskop elektron pemindaian
elektron-I sekunder.Pemindaian Mikroskop Elektron4, 1359–
72.
Prack ER (1993) Pengantar visualisasi proses
kemampuan dan pertimbangan dalam mikroskop elektron
pengalengan lingkungan (ESEM).Penelitian dan Teknik
Mikroskop25,487–92.
Quirynen M, Bollen C, Vandekerckhove B, Dekeyser C,
Papaioannou W, Eyssen H (1995) Disinfeksi mulut penuh
vs sebagian dalam pengobatan infeksi periodontal:
pengamatan klinis dan mikrobiologis jangka pendek.
Jurnal Penelitian Gigi74,1459–67.
Ricucci D, Bergenholtz G (2003) Status bakteri di root-
gigi tambal yang terpapar ke lingkungan mulut dengan hilangnya
restorasi dan fraktur atau karies – sebuah studi histobakteriologis
dari kasus yang dirawat.Jurnal Endodontik Internasional36, 787–
802.
Robichon D, Girard JC, Cenatiempo Y, Cavellier JF (1999)
Pencitraan mikroskop kekuatan atom bakteri kering atau hidup.
Akademi Ilmu Pengetahuan RC Paris322,687–93.
Royall CP, Thiel BL, Donald AM (2001) Kerusakan radiasi
air dalam mikroskop elektron pemindaian lingkungan.
Jurnal Mikroskop204,185–95.
Schnarr H, Futing W (1997) Beberapa aspek pengoptimalan
kontras untuk penyelidikan bahan bersama di ESEM.
Memindai19,143–57.
Sigee DC (1998) SEM Lingkungan dan mikroanalisis sinar-X
dari bahan biologis.UU Mikrokimia15,283–93. Socransky
S, Haffajee A, Cugini M, Smith C, Kent R Jr (1998)
Kompleks mikroba pada plak subgingiva.Jurnal
Periodontologi Klinis25,134–44.
Stokes DJ, Thiel BL, Donald AM (1998) Pengamatan langsung terhadap
sistem emulsi air-minyak dalam cairan yang dinyatakan oleh SEM
lingkungan.Langmuir14,4402–8.
Sunde P, Olsen I, Debelian G, Tronstad L (2002) Mikrobiota dari
lesi periapikal yang refrakter terhadap terapi endodontik.Jurnal
Endodontik28,304–10.
Tai SS, Tang XM (2001) Memanipulasi sampel biologis untuk
pengamatan mikroskop elektron pemindaian lingkungan.
Memindai23,267–72.
Jurnal Endodontik internasional,38,775–788, 2005 787
 Pengamatan bakteri dengan ESEMBergman dkk.
Thiberge S, Nechushtan A, Sprinzak D, Gilead O, Behar V, Zik
O dkk. (2004) Scanning mikroskop elektron sel dan
jaringan di bawah kondisi terhidrasi penuh.Prosiding
National Academy of Sciences USA10,3346–51.
Toth M, Phillips MR (2000) Peran kontras yang diinduksi dalam
gambar yang diperoleh menggunakan ESEM.Memindai22,370–9.
Toth M, Daniels DR, Thiel BL, Donald AM (2002) Kuantifikasi
kation rekombinasi elektron-ion dalam kapasitor gas
iradiasi berkas elektron.Jurnal Perkembangan Fisika35,
1796–804.
Trope M, Tronstad L, Rosenberg ES (1992) Mikro medan gelap
jumlah spirochete skopis dalam diferensiasi abses
endodontik dan periodontal.Jurnal Endodontik18,82–6.
788 Jurnal Endodontik internasional,38,775–788, 2005
Van Meerbeek B, Vargas M, Inoue S dkk. (2000) Mikroskop
investigasi. Teknik, hasil, keterbatasan.Jurnal Kedokteran
Gigi Amerika13,3–18.
Watson TF (1991) Aplikasi optik pemindaian confocal
mikroskopis hingga kedokteran gigi.Jurnal Kedokteran Gigi Inggris
171,287–91. Watson LP, McKee AE, Merrell BR (1980) Persiapan
spesimen mikrobiologi untuk pemindaian mikroskop
elektron.Pemindaian Mikroskop Elektron2,45–56. Ximenez-
Fyvie L, Haffajee A, Socransky S (2000) Mikroba
komposisi plak supra dan subgingiva pada subjek
dengan periodontitis dewasa.Jurnal Periodontologi Klinis
27, 722–32.
kanJurnal Endodontik Internasional 2005