PROTOKOL PRAKTIKUM

UNIT LABORATORIUM BIOMEDIK TERPADU

Ekstraksi DNA dari darah

1. Persiapan alat dan bahan ekstraksi :

• Nyalakan water bath setting pada suhu 70o C
• Inkubasi Elution Buffer pada suhu 70o C
2. Darah sebanyak 200 µl ditambahkan binding buffer sebanyak 200 µl dan 40 µl Proteinase K,
homogenkan dengan cara divortex lalu diinkubasi selama 10 menit pada suhu70o C.
3. Ditambahkan isopropanol sebanyak 100 µl, kemudian divortex.
4. Pindahkan semua campuran ke spin colum kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm
selama 1 menit.
5. Ganti collection tube, ditambahkan 500 µl Inhibitor Removal Buffer kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.
6. Ganti collection tube, ditambahkan 500 µl Wash Buffer kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
8000 rpm selama 1 menit.
7. Ganti collection tube, ditambahkan 400 µl Wash Buffer kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
8000 rpm selama 1 menit.
8. Ganti dengan microtube 1,5 ml, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.
9. Ganti dengan microtube 1,5 ml, ditambahkan elution buffer (70o C) sebanyak 100 µl, kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.
10. Buang spin colum dan beri label pada tabung.
11. Template DNA siap digunakan untuk proses selanjutnya.
 PROTOKOL PCR KRAS

Alat: Bahan:
1. Mesin PCR (Thermocycler) 1. Tabung 200 µL
2. Mikropipet set 2. Yellow tip dan white tip
3. PCR cooler 3. Master Mix (Go Green Master Mix Promega)
4. Primer KRAS (F dan R (10 ng)
5. ddH2O
6. Template DNA

Prosedur membuat Mix PCR :

Mix PCR 1X

2x MM (Go Green MM) 12.5 µL

Primer F KRAS (10 ng) 0.5 µL

Primer F KRAS (10 ng) 0.5 µL

ddH2O 4 µL

Template DNA 7.5 µL

Total Volume 25 µL

Program PCR KRAS :

Pre Denaturasi : 95˚C selama 5 menit

Denaturasi : 95˚C selama 15 detik

Annealing : 56˚C selama 60 detik diulang 40 siklus

Extension : 72˚C selama 30 detik

Final extension : 72˚C selama 5 menit

Ukuran Produk PCR : 288 bp

 PROTOKOL PCR KROMOSOM Y

Alat: Bahan:
1. Mesin PCR (Thermocycler) 1. Tabung 200 µL
2. Mikropipet set 2. Yellow tip dan white tip
3. PCR cooler 3. Master Mix (Go Green Master Mix Promega)
4. Primer KRAS (F dan R (10 ng)
5. ddH2O
6. Template DNA

Prosedur membuat Mix PCR:

Mix PCR 1X

2x MM (Go Green MM) 12.5 µL

Primer F dan R (10 ng) 2 µL

ddH2O 8.5 µL

Template DNA 2 µL
Total Volume 25 µL

Program PCR KROMOSOM Y:

Pre Denaturasi : 94˚C selama 5 menit

Denaturasi : 94˚C selama 60 detik

Annealing : 62˚C selama 15 detik diulang 35 siklus

Extension : 72˚C selama 60 detik

Final extension : 72˚C selama 60 detik

Ukuran Produk PCR : bp

Elektroforesis Gel Agarosa 1,5%

1. Prosedur Pembuatan Gel Agarose 1,5%:

a. Timbang agarose powder sebanyak 0,52 gram.
b. Tuang ke dalam tabung atau botol tahan panas (untuk di microwave).
c. Tambahkan 35 ml TBE buffer 1x.
d. Didihkan sampai larut pada suhu 70 ̊ C dalam microwave selama 1 menit.
e. Dinginkan sampai suhu 60 ˚C atau sampai terasa hangat dalam suhu kamar.
f. Tambahkan 1µl Gel Red®.
g. Tuang ke dalam tray (cetakan) yang sebelumnya telah dipasang comb(sisir).

2. Prosedur Elektroforesis:
a. Hasil PCR masing-masing sebanyak 3 µl dicampur dengan loading dye 1 µl.
b. Masukkan ke dalam well gel agarosa (1,5)% di dalam elektroforesis chamber, salah satu
(biasanya well pertama atau terakhir) well diisi dengan marker 100 bp sebanyak 2 µl.
c. Nyalakan power supply pada poisisi 100 volt selama 40 menit.
d. Hasil elektroforesis dilihat dengan menggunakan Gel Doc.

3. Hasil Analisa Gel Elektroforesis:

a. Pemeriksaan Gel Based pada umumnya dinyatakan valid apabila, memenuhi kriteria sebagai
berikut:
b. Tidak terdapat produk amplifikasi pada kontrol negatif.
c. Pada kontrol Positif terbentuk produk PCR dengan panjang produk sesuai yang diharapkan
(digunakan marker sebagai penentu ukuran).
d. Pemeriksaan PCR dinyatakan positif apabila produk PCR yang dihasilkan sejajar dengan kontrol
positif.