Protokol BD OneFlow ALOT

Tujuan Penggunaan
The BD OneFlow™ ALOT (Acute Leukemia Orientation Tube) ini ditujukan untuk flow-cytometric
immunophenotyping aberrant immature popuLations of hematopoietic cells (lymphoid and nonlymphoid lineage)
pada sumsum tuLang dan darah tepi sebagai alat bantu diagnosis acute lymphoblastic leukemia dan non-lymphoid
acute leukemia. The BD OneFlow ALOT di design untuk digunakan dengan instrument BD flow cytometer dan
software in vitro diagnostic.

Kit komponen:

• 10 tabung BD OneFlow ALOT (S)

• 10 tabung BD OneFlow ALOT (C)

Reagent Pendukung

1. Intrasure
2. FACS Lysing Solution 10X. Encerkan 1:10 sebelum digunakan.
3. Wash Buffer atau FACS Flow with BSA 0.5%
4. FACS Flow with paraformaldehyde (1%) (PFA) -> ditambahkan kalau tidak langsung dibaca,
bertahan 24 jam setelah staining. Kalau tanpa PFA, bertahan 2 jam.
Protokol

1. Keluarkan pouch tabung (S) dari kulkas dan diamkan hingga mencapai pada suhu kamar selama
15-30 menit agar tidak terjadi kondensasi.
Note : reagent sangat sensitive terhadap kelembaban.
2. Keluarkan tabung (S) dari dalam pouch dan letakkan dalam rack yang terlindung dari cahaya. Note :
Tabung hanya dikeluarkan sesaat setelah sampel darah sudah siap.
3. Tutup kembali pouch dengan rapat, pastikan seal menutup dengan sempurna dan masukkan
kembali kedalam kuLkas
4. Tulis nama ID pasien pada tabung (S).
5. Homogenkan sampel dengan membolak-balik tabung 10 kali.
6. Buat pengenceran sample hingga mencapai 1-2 juta WBC/uL. Lihat pedoman pengenceran darah
di bawah.
7. Pipet sample darah sebanyak 100µL (berisi kurang lebih 1-2 juta WBC) ke tabung BD OneFlow
ALOT (S). Pastikan semua sampel darah menyentuh reagent pada dasar tabung.
8. Pipette 50 uL Wash Buffer (BSA) atau FACS Flow kedalam tabung (S).
9. Vortex 3-5 detik.
10. Inkubasi 30 menit pada suhu ruang dalam kamar gelap.
11. Pipette 100 uL reagent A Intrasure kedalam tabung (S)
12. Inkubasi 5 menit pada suhu ruang dalam kamar gelap.
13. Tambahkan FACS Lysing solution (1x) 2 ml kedalam tabung (S)
14. Inkubasi 10 menit, suhu ruang dalam gelap.
15. Sentrifuge 800 g selama 5 menit.
16. Buang supernatan dengan cara dituang, jangan sampai pellet ikut terbuang. Vortex pellet.
17. Ukur volume yang ada di tabung (ukur dengan pipet seberapa banyak pellet tersedot).
Tambahkan Wash buffer atau FACS Flow kedalam tabung hingga volumenya menjadi 100 uL.
18. Keluarkan tabung BD OneFlow ALOT (C) dan tutup kembali pouch dengan rapat.
19. Tulis ID Pasien pada tabung (C).
20. Pipette semua sampel dalam tabung (S) kedalam tabung (C).
21. Pipette 50 uL reagent B Intrasure kedalam tabung (C)
22. Inkubasi 15 menit, pada suhu ruang, dalam kamar gelap.
23. Tambahkan 2 ml Wash buffer atau FACS flow kedalam tabung lalu vortex.
24. Sentrifuge 800 g selama 5 menit.
25. Buang supernatan dengan cara dituang. Hati-hati jangan sampai pellet ikut terbuang.
26. Tambahkan 400 uL FACS Flow (with paraformaldehyde 1%) atau FACS Flow.
27. Sampel siap di baca di Flow Cytometer.
Pedoman Pengenceran Sample

1. Rumus pengenceran untuk WBC tinggi

WBC > 30.000
= 2.000.000
jumlah (leukosit) yang terbaca di hema
=X
Jadi sample diambil X uL, lalu ditambah FACSFlow hingga 100uL.

2. Rumus pengenceran untuk WBC rendah

WBC < 30.000
=1.000.000
Jumlah (leukosit) yang terbaca di hema
=X
Jadi, sample diambil X uL, lalu ditambah FACS Flow hingga 100uL.

Contoh

1. Hasil WBC: 35.000 -> lebih dari 30.000

Volume yang diambil= 2.000.000/35.000
= 57,14 uL. Dibulatkan menjadi 60 uL, jadi FACSFlow yang ditambahkan 40uL.

2. Hasil WBC: 21.000 -> kurang dari 30.000

Volume yang diambil= 1.000.000/21.000
= 47,6 uL. Dibulatkan menjadi 48 uL. Jadi FACSFlow yang ditambahkan: 52 uL.

Pembilang 2 juta bisa juga 1 juta.

Kalau rendah (WBC < 30.000), pakai 1 juta / ...

Kalau tinggi (WBC > 30.000), pakai 2 juta / ...