UNIVERSITAS SEMBILANBELAS NOVEMBER KOLAKA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI Program Studi Farmasi Penuntun Praktikum MIKFOnIOlOonwasalNama Lengkap Semester Kelompok Tanda Tangan BIODATA PRAKTIKAN 3x4 Terbaru {tidak boleh foto | berpakaian ‘seragam Sekolah) | | Pas Foto | PenuntutPraktikum Mikrobologi Dasar arm Sat mFS 8 ns IePenuntut Praktikum Mikrobiologi Dasar KATA PENGANTAR Alhamdulillah, puji syukur dipanjatkan kehadirat Allah SWT, karena atas rahmat dan hidayah-Nya Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar ini dapat diselesaikan, Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar ini disusun dengan harapan dapat membantu para mahasiswa (praktikan) untuk lebih mudah mempelajari dan memahami Mikrobiologi Dasar, dan sebagai penuntun dalam melaksanakan Praktikum Mikrobiologi Dasar Farmasi, Program Studi Farmasi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Sembilanbelas November Kolaka. Materi-materi praktikum di dalam penuntun praktikum ini disusun dengan memperhatikan fasilitas yang tersedia di dalam laboratorium juga pengetahuan dan keterampilan dalam bidang Mikrobiologi Dasar yang perlu dikuasai oleh mahasiswa (praktikan). Materi-materi praktikum dalam petunjuk praktikum ini meliputi pengenalan terhadap mikroba secara umum dan teknik-teknik yang berhubungan dengan mikroba yang dilengkapi dengan gambar. Materi-materi tersebut disusun dari berbagai_buku-buku Mikrobiologi Dasar sehingga memudahkan mahasiswa (praktikan). Semoga buku penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar ini bermanfaat bagi pemakai dan pembaca. Penyusun menyadari bahwa penuntun ini masih jauh dari sempuma. Oleh karena itu, tegur sapa dan koreksi untuk perbaikan penuntun ini, sangat kami harapkan. Kolaka, 07 Juni 2021 ‘Tim Penyusun Praga Sot Forms Flt Sone & to USHA 3penunut Praktiku Mi. Dasar TATA TERTIB PRAKTIKUM . if lum acara_praktiki ji hadir 5 menit sebel Praktikum 4, Praktikan en dari dari § menit tidak diperkenankan men, eden diperkenankan mengikuti praktikum apabila keter, raktil sat ere kai jas praktikum berwai 5 iharuskan memakai Jas A puth yan 7 oie memasuk laboratorium), alat pelindung berupa fee bersin (handscoon) dan masker (pada saat pengambilan dan penimban inokulasi mikroba, isolasi mikroba dan perlakuan yang _berhubun; mikroba, pemakaian jas praktikum dan masker juga diwajibkan sa pengamatan hasil di luar jam praktikum). 3. Setiap praktikan diwajibkan menjaga kebersihan meja dan alat alat lab yang digunakan. bertan, = SIKU preter test 'aMbatan lebit 'gaN media, '98N dengan fat Melakukan 4. Setiap praktikan harus mencuci tangan sebelum maupun sesudah praktikum dilaksanakan. 5. Setiap praktikan harus mempelajari dan memahami teori dan prosedur kerja sebelum praktek berlangsung. Sebelum praktikum dimulai, praktikan wajib mengumpulkan laporan sementara yang merupakan prasyarat mengikuti acara Praktikum pada hari itu. Praktikan yang tidak mengumpulkan laporan sementara, tidak diperbolehkan mengikuti praktikum pada hari itu. . Praktikan diharuskan bekerja secara terencana, hati-hati dan teliti. Setelah selesai praktkum, alat-alat maupun bahan yang digunakan harus dikembalkan dalam kondisi bersih dan utuh. Semua praktikan bertanggung jawab terhadap Kebersihan dan keamanan ruang praktikum, serta alat-alat yang digunakan. 7 Praktikan yang memecahkan, merusakkan dan atau menghilangkan ala diharuskan melapor ke dosen/asisten jaga dan mengganti alat ape Cina gty®. Praktikan yang merusakkan, memecahkan atau menghilangkan van menuliskan pada blangko yang telah disediakan di lab i bava" gawasan dosen/assisten koordinator, . Praktikan qi ipa menaumacnaseean Menjaga kemumian bahan-bahan yang one pa ‘gala macam kontaminan yang dapat mengganggu kevall . Setiap Praktikay . / in ii ti UI Praktium, “2 membuat taporan praktikum dan wajib menaitl 10. Bagi Mahasi si maka rater 8 Presentase kehadiran praktikum Kurang dati 26 Praktikum Mikrobiologi nace tidak diperbolehkan mengikutiPenuntut Praktikum MikrobiologiDasar SOP PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DASAR Setiay fi eee akan selalu berhubungan dengan mikroba patogen selama diinginkan, set um Mikrobiologi Dasar. Untuk mencegah halhal yang tidak duit ined ‘i fi iP Praktikan diharuskanmentaati peraturan yang telah ditetapkan njalankan petunjuk yang diberikan asisten/dosen jaga. 41. Te ir ic ‘as dan benda-benda lain yang tidak diperlukan diletakkan pada tempat yang disediakan. Jangan sekali-kali meletakkannya di atas meja laboratorium | 2. Sekalah baik-baik meja laboratorium dengan desinfektan sebelum dan sesudah kegiatan laboratorium. 2 . Cucilah tangan anda baik-baik dengan air dan sabun sebelum dan sesudah kegiatan | laboratorium. Lakukan hal yang sama bila anda meninggalkan laboratorium untuk ke toilet atau bila anda ke luar dari ruangan laboratorium. 4, Jangan merokok, makan atau minum di ruang laboratorium. 5, Jauhkan tangan anda dari mulut, hidung, mata dan telinga selama anda bekerja di laboratorium. 6. Perlakukan semua organisme yang anda tangani sebagai pathogen atau mampu menimbulkan penyakit. Kebanyakan biakan yang disediakan laboratorium tidak berbahaya, tetapi beberapa di antaranya berbahaya. 7. Anda tidak diperkenankan membawa keluar biakan mikroba apapun dari ruanganmikroba/ruangan laboratorium. 8. Usahakan supaya mikroba yang anda tangani tidak tercecer dan tidak tercampur dengan mikroba lain. 9. Bila biakan yang sedang praktikum, tuangkan desint dan buang di tempat yang di terkontaminasi. 40.Bila anda memecahkan tabung berisi mikroba, tuangkan desinfektan ke atasnya, sapukan dan buang di tempat yang disediakan untuk pecahan kaca atau gkan spiritus dan kerudian bakar. tuan 11.Bila anda terkontaminasi atau terluka, hubungi assisten/dosen jaga. 412. Buanglah sampah-sampah yang tidak terkontaminasi di tempat yang disediakan. it | isterkan dengan cara memijarkan seluruh kulasi dan ose harus disterilkan d k I eae eawatnya sebelum dan sesudah setiap penggunaan. Percikan biakan gapat Siindarkan dengan cara memulai pemanasan di dalam kerucut api sebelah dalam yang berwarna lebih biru. anda pindahkan tercecer ke lantai atau di meja fektan di atasnya, seka dengan kertas tissue/kapas isediakan untuk bahan-bahan bukan kaca yangPenuntut Praktikum | Mikrobiologi Dasar perlu digunakan lebih dari 1 kaj 7 ng sama g ia 14,Apabila pipet yal di la di antara penggunaar 7 Ngan sung di atas mej Nn, tetapi letal meletakkannya langeot g telah tersedia. Kkanah pada penyangg@ pipet yans ee ’ 45.Api pada pembakar bunsen harus arene a oa tidak digunakan, ji idak diperlukan lagi serta bahan-bahan bekas pakaj 18a a ena iene ‘harus diletakkan dalam tempatnya mashgiag’ yang disediakan sebagai berikut : a. Cawan petri, labu dan reaksi diletakkan di tempat yang disediakan, b. Kaca obyek dan penutupnya harus diletakkan dalam tempat-tempat Khusus yang telah diberi desinfektan. c. Bakteri yang ada pada kaca obyek belum tentu mati semuanya sekalipun telah difiksasi dengan panas, jadi berhati-hatilah menanganinya. d. Jangan sekali-kali membuang biakan di tempat cuci. 17.Kurangi bercakap-cakap selama praktikum, agar tidak merugikan pekerjaan sendiri atau rekan lain. 48.Setiap pengerjaan praktikum dan pengamatan harus dicatat dengan cermat. 49.Setiap praktikan diwajibkan membersihkan mikroskop dan mengembalikan ke tempat semula setelah digunakan, selain itu praktikan diharuskan untuk membersihkan meja kerja, memeriksa nyala api dan listrik dipadamkan, menutup kran air dan gas, mencuci tangan dengan desinfektan/lysol, kemudian melapor ke assisten/dosen jaga. ee jas laboratorium anda sehingga selalu bersin pada waktu anda detana ‘tb ke laboratorium pada waktu berikutnya. Gunakanlah sarung igan dan masker yang selalu baru di setiap praktikum Mikrobiologi DasarPenuntut Praktium Mikrobologi Dasar CONTOH FORMAT LAPORAN PRAKTIKUM : ACARA. (topik acara (diisi acara Praktikum yang dilaksanakan sesuai panduan) .. Praktikum yang dilaksanakan sesuai Panduan) A. TUJUAN : (disitujuan mata acara praktikum) B. TINJAUAN PUSTAKA (Bobot Nila): "\ (lisi teori-teori dari pustaka yang mendasari materi mata acara praktikum tersebut, Pustaka yang diacu minimal dari 6 sumber, berbahasa asing (buku atau jurnal penelitian terkait praktikum), tahun sumber pustaka di atas tahun 2008) Cara mengacu pustaka dalam uraian: Apabila ada bagian karya tuls yang diacu dalam uraian (misalnya tinjauan pustaka atau pembahasan) makanama akhir dari pengarang atau penyunting dan tahun publikasi harus dicantumkan. Contoh: a. Menurut Wijayanti (2013) daya antibakteri minyak serai... b. Prasetyo dan Adelina (2013) menyatakan bahwa... ©. sebagai nilai KHM dan KBM terhadap S. Aureus (Putra dan Lestari, 2012) x Apabila jumlah pengarang kurang dari 6, dicantumkan seluruhnya nama akhir pengarang Ketika referensi tersebut dirujuk pertama kali dalam uraian, Selanjutnya, cantumkan nama akhir pengarang pertama diikuti dengan dkk. disertai tahun publikasi. Contoh: a. Pertama kali: Utarini, Kumara, Prihaswan, Prabandari, dan Anwar (2000)... b. Selanjutnya: Utarini dkk. (2000) 3. Untuk referensi yang ditulis oleh 6 pengarang atau lebih, cantumkan nama akhir pengarang pertama diikuti dengan dkk. S . Kutipan kedua dilakukan apabila penulis mengalami kesulitan dalam memperoleh artikel asli daari bahasan yang diacu. Kutipan kedua sebaiknya dibatasi untuk menghindari pengulangan kesalahan penulisan nama penulis, tahun publikasi ataupun materi tulisan. Contoh: Menurut Prasatyo (cit. Wiayanti, 2000)... (artinya artikel asii ditulis oleh Prasetyo, kemudian dikutip oleh Wijayanti pada tahun 2000) om Sc Fs Flt 8 by. ST 7Pen sntut Praktikum Mikrobiologi Dasar PERTEMUAN | PENGENALAN ALAT DAN KESELAMATAN KERJA, Pendahuluan A. Maksud dan Tujuan Percobaan Maksud s / 1. Mahasiswa mengenal dan mengetahui fungsi alat-alat yang umun * Gigunakan pada praktikum mikrobiologi : 2. Mengetahui tata cara, cara bekerja yang baik dan benar dilaboratoriun mikrobiologi Tujuan 41. Menentukan alat-alat yang digunakan dalam praktikum Mikrobiologi Farmasi 2. Menentukan tata cara cara bekerja yang baik dan benar di laboratorium Mikrobiologi farmasi. B. Prinsip Percobaan 1. Mampu menggunakan alat alat yang digunakan dalam praktikun Mikrobiologi Farmasi 2. Mampu bekerja dengan baik dan benar di laboratorium Mikrobiologi farmasi C. Sasaran Percobaan 1. Mahasiswa diharapkan mengenal_alat-alat yang digunakan sesuti dengan Perlakuan yang ada dan memahami prinsip kerja alat 2. Mahasiswa mengetahui cara kerja dan menerapkan keselamatan dan keamanan kerja. Materi Pembelajaran Alat merupakan salah satu Pekerjaan dj laboratorium berlangsungnya Praktikum, Pe, memiliki nama yang menunuyjul ketika alat digunak: an. a in. Beberay Pendukung daripada keberhasilan ea Sehingga memudahkan dan melancatt ngetahuan alat sangat diperlukan, setiaP © kkan kegunaan alat, prinsip kerja atau Pr pa kegunaan alat dapat dikenali berdas e a miktoskop cahay tu alat untuk melihat sel mikrob ng ta" dapat dilthat den, miktoskop dapat diamati sel bakteri Ya" een mata telanjang. Pada umumnva, mata tidak ma”?Penuntut Praktikum Mikrobologi Dasar membedakan benda d merupakan Uraian mikroskop cahaya, 3 eee diameter lebih kecil dari 0,1 mm. Berikut ‘entang cara penggunaan, bagian-bagian, dan spesifikasi Lensa Okuler ~Tubus Okuler — Revolver 5 é Lensa Objektif __ “=——-Lengan Mikrosko} Meja Benda Penjepit Kondensor —Makrometer Diafragma ~~ penyangga Sumber Cahaya =! ‘wikrometer a ~~ Kaki Mikroskop 2. Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi, menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 1,5 - 2 atm dengan suhu 121°C dan lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15- 20 menit. Cara Pemakaian : a. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoclave, jika air dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi/steril untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat. b. Masukkan alat dan bahan. ; Tutup dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoclave dan nyalakan. - ; d. Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi seluruh bagian autoclave, klep pengaman ditutup (dikencangkan) gan tunggu sampai Selesai. Penghitungan waktu 15 - 20 menit dimulai sejak tekanan ~2 atm dan nyalakan timer. e. Ke saealeee selesai berbunyi, maka tunggu tekanan turun hingga eee dengan tekanan udara di lingkungan Garum pada preisure gauge/penunjuk tekanan menunjuk ke angka nol). Kemudian Klep-Klep pengaman dibuka dan keluarkan isinya dengan hati-hati. untuk mensterilkan alat-alat dari kaca yang digunakan menggunakan udara kering. Suhu 170 - 180°C dan lama kan biasanya 1,5 - 2 jam. 3. Oven adalah alat dalam mikrobiologi, sterilisasi yang dilakulPenuntut Praktiun Miksobiologi Dasar Cara Pemakaian : a) Masukkan alat-alat yang telah siap ke dalam oven; b) Tutup oven dan tutup tombol pengatur tekanan dan nyalakan tombol, c) Atur suhu pada termometer dengan cara memutar pengatur suhy sesuai suhu oven; d) Hitung waktu sterilisasi selama 1,5 - 2 jam dan dimulai ketika suhu sudah mencapai 170-180°C; e) Matikan tombol setelah 1,5 - 2 jam, tunggu sampai suhu turun dan oven dingin selanjutnya alat-alat dapat dikeluarkan. 4. Cawan Petri Cawan Petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi) mikroba. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan cawan bagian atas sebagai peru? peuild Petri tersedia berbagai macam ukuran, diameter cawan yang bias® erdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak 15-20 mi, sedangks" cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml. 5. Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube)PenuntutPraktikum MikrobiologiOasar Ta i Mek) si digunakan untuk uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan marie ung reaksi dapat diisi media padat maupun cair. Tutup tabung ema rupa kapas, tutup metal, tutup plastik atau aluminium foil. Arent) dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi ea a fungsinya, yaitu medid agar tegak (deep tubeagar) dan tontare fa oe agar). Untuk Mmembuat agar miring, perlu diperhatikan fidake Craningan media yaitu Iuas permukaan yang kontak dengan udara Sk terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi, 6. Erlenmeyer berfungsi untuk menampung larutan, bahan atau cairan yang. Erlenmeyer dapat digunakan untuk meracik dan menghomogenkan bahan-bahan komposisi media, menampung akuades, kultivasi mikroba dalam kultur cair, dil. 7. Gelas Beaker Gelas beaker merupakan alat yang memiliki banyak fungsi, pada mikrobiologi, dapat digunakan untuk preparasi media, menampung akuades dil. Gelas ukur (c) berguna untuk mengukur volume suatu cairan, seperti labu erienmeyer, gelas ukur memiliki beberapa pilhan berdasarkan skala volumenya. Pada saat mengukur volume larutan, sebaiknya volume tersebut ditentukan berdasarkan meniskus cekung larutan. ‘gr So am Fb Se kg kePenuntut raktikum Miobilog! 0952 8, Jarum Inokulum 5 i kan biakan yang untuk memindahkan i SE ae baru. Jarum inokulum biasanya terbuat dari Se el latinum sehingga dapat berpijar jika terkena Panag, kawat nikrom als Plgapat berbentuk lingkaran (loop) dan disebut ox Bentuk Avene o optranefer loop, dan yang berbentuk lurus diseby ata inoculate transfer needle. Inokulating loop cocok untuk melahuan inokuang oer agar, sedangkan inoculating pe soca digunakan sae cokulas! sevara tusukan pada agar tegak (stabinoculatng), © Mikropipet dan Tip Mikropipet —__=— = Alat untuk memindahkan/mengambil cairan yang bervolume oe biasanya Kurang dari 1000 wl. Banyak pillhan kapasitas dalam (adjustable misslnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya oe bisa volume pipette) antara 1! sampai 20 yl, atau mikropipet yang inet) diatur volumenya, hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume fant misalnya mikropipet 5 yl. dalam penggunaannya, mikropipet memeri! Cara Pemakaian: i-kall 8) Sebelum digunakan, thumb knob sebalknya ditekan betta Untuk memastikan lancamya mikropipet. 2) Masukkan tip bersh ke dalam nozzie/ ujung mikropipet / ¢) Tekan thumb knob sampai hambatan pertama / first stop, jang@” lebih kedalam lagi d) Masukkan tip ke dalam cairan sedalam 3 - 4 mm. @) Tahan pipet dalam p sisi vertikal kemudian lepaskan tekanan da! knob maka cairan akan masuk ke tip. 4) Pindahkan ujung tip ke tempat Penampung yang diinginkan. itekor thu? POF om at SePenuntut Proktikum MikrobiologiDasar 9) Tekan thumb knob ‘samy semakei pai hambatan kedua / second stop atau tekan Soh mal mungkin maka semua cairan akan keluar dari ujung tip. ika ingin melepas tip putar thumb knob ‘searah jarum jam dan ditekan maka tip akan terdorong keluar dengan sendirinya, atau menggunakan alat tambahan yang berfungsi mendorong tip keluar. 10. Mortar dan Penumbuk /Pastle Mortar dan penumbuk (pastle) digunakan untuk menumbuk atau menghancurkan materi cuplikan, misal : daging, roti atau tanah sebelum diproses lebih lanjut. 11. Lampu Bunsen (Pembakar Spiritus) dan pHindikator universal ang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah any eee Api yang menyala dapat membuat aliran udara karena dari bawah dan diharapkan kontaminan ikut terbakar n udara tersebut. Untuk sterilisasi jarum Ose atau yang ot re ly yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian 7 yang berwarna iru (paling panas). Lampu Bunsen dapat menggunakan aoe bakar gas, alkohol, spirtus. pH Indikator Universal (b) berguna eaak mengukur/mengetahui pH suatu larutan. Hal ini sangat penting dalam pembal oksigen dikonsumsi 5 Prgran Fm Sn aco SCYPenuntutPraktikum Mikobicog! D950" karena pH pada medium berpengaryh an media Kertas pH indikator dicelupkan sampaj i adap dian strip warna dicocokkan dengan sian ma pembuati petumbuhan mikroba. perubahan warna kemut acuan. ‘Tahap pelaksanaan 4. Asisten mengabsen praktikan; 2. Asisten praktikum membuka pertemuan dengan bedoa agar Prati berjalan lancar, efekif, efisien dan bernilai ibadah; Asisten memberikan pra test untuk mengevaluasi kesiapan praktixan: . Asisten menjelaskan orientasi percobaan yang akan dilakukan; =” . Asisten membagi kelompok; . Asisten praktikan membagi diri dalam kelompok-kelompok untuk menyiapkan alat dan bahan percobaan yang akan dilakukan; . Praktikan di damping asisten melakukan percobaan sesuai prosedur. Praktikan dan asisten dapat melakukan diskusi-diskudi singkat terk percobaan yang sedang berlangsung; ait Menyusun laporan yang mengarahkan kepada capaian kompetensi, On are © Tugas Modul 1. Sebutkan nama dan fungsi dari alat-alat di atas! 2. Gambarkan dan sebutkan fungsi dari alat-alat penting yang digunakan dalam penelitian bidang Mikrobiologi! (selain yang disebut nomor 1}! 4 Pertanyaan lain dapat diberikan dosen/assisten!Penuntut Praktikum Mikrobiologi Dasar LAPORAN HASIL PRAKTIKUM Nama Alat Metode Sterilisasi Suhu dan Waktu Alat Sterilisasi ~ 10 11 12 13 14 15 pram Se Fira te Se ee SEPenuntutPraktikum Mirobioloi Basar PERTEMUAN II METODE STERILISAS! DAN PEMBUATAN MEDIUM 1. Pendahuluan ‘A. Maksud dan Tujuan Percobaan Maksud a Mengetahui macam-macam metode streilisasi dan medium Untuy berbagai mikroorganisme Tujuan Menentukan macam-macam metode streilisasi dan medium Untuk berbagai mikroorganisme B. Prinsip Percobaan 4. Mampu melakukan dan memilih metode streilisasi yang baik dan benar berdasarkan bahan yang akan di gunakan 2, Mampu membuat medium berdasarkan mikroorganisme yang akan digunakan C. Sasaran Percobaan Mahasiswa diharapkan dapat menerapkan praktek laboratorum yang baik, melakukan dan menyebutkan macam macam metode Sterilisasi, menentukan dan melakukan Proses sterilisasi_terhadap peralatan dan bahan praktikum, memilih medium yang sesuai untuk erbagal_mikroorganisasi, mampu memformulasi pembuatan medi, mampu melakukan proses _sterilisasi i ia untuk pertumbuhan mikroorganisme. i dan penyiapan media Ml. Materi Pembelajaran Steriisasi - yang lamaperageste Suatu proses untuk mematikan semua organism? Mikrobiologi adalah a benda (alat ataupun bahan). Tujuan sterilisasi dala" semua mikroorganisme ro*@™ Menghambat pertumbuhan dan menyingkit@t dalam suatu pekerjaan 7 22 Pada alat dan bahan yang akan dgurae” steriisasi dapat dilakuk Suna menciptakan suasana aseptis Secara U™ secara kimia. Steriisasi meen", 3 Metode: mekanis, fisis dan ata terbagi menjadi 2 penyinaran aa diantaranya menggunakan microfite, ‘an pemanasan, sedangkan kimia adalah a menggunakan bahan kimi dikerjak: ‘imia (desinfektay ini kerekan cecara aseptis atau (aes hal ini bertujuan supaye Pea iginkan, Adapun ster as dari mikroba pence! ast "Sasi yang sering digunakan dalam praPenuntut Praktixum Mikrobiologi Dasar mikrobiologi adalah sterilisasi secara fisis dengan pemanasan, yang dibagi Menjadi sterilisasi kering dan sterilisasi basah. Metode Sterilisasi Sterilisasi secara Fisis 1, Pemanasan @) Sterilisasi Kering (Panas Kering) Beberapa cara yang dapat dilakukan pada sterilisasi kering adalah: 1) Pemijaran Pemijaran merupakan suatu kegiatan membakar langsung alat-alat sepertiujung ose, ujung pinset, ujung spatula yang berbahan logam. Pemijaran dilakukan sampai alat-alat tersebut berwarna merah pijar. Flaming (Jilatan Api) Alat-alat seperti kaca objek, cawan petri yang telah berisi media, mulut erlenmeyer yang berisi media dan jarum cukup dilakukan jilatan api atau melewatkan alat tersebut pada nyala api bunsen. Artinya alat-alat tersebut hanya mengalami jilatan api dan tidak sampai memijar. 3) Udara Panas Umumnya sterilisasi kering dilakukan dengan cara ini, dimana alat yang digunakan adalah oven. Suhu yang biasa digunakan 160-180°C selama 1- 2 jam. Sterilisasi kering dengan oven ini baik dilakukan terhadap alat-alat kering yang terbuat dari kaca, seperti: cawan petri, tabung reaksi, botol sampel, pipet, alat suntik kaca, pinset, gunting, bahan-bahan yang tidak tembus uap seperti gliserin, minyak, vaselin, bubuk, dan atau apa saja yang tidak menjadi rusak, menyala, hangus atau menguap pada suhu tinggi. 2) b) Sterilisasi Basah (Panas Basah) Sterilisasi basah dapat dilakukan dengan beberapa cara, diantaranya: 2. Uap Mengalir merupakan sterlisasi dengan menggunakan uap pada suhu 1000C yang dialirkan pada benda yang disterikan secara berulang-ulang (tiga sampai empat kali beberapa menit) dengan selang waktu 24 jam. Atau steriisasi denganuap mengalir ini juga disebut dengan sterilisasi bertingkat atau tyndalisasi, Cara ini dikenalkan oleh John Tyndall (1820-1893). Keuntungan cara ini jalah tidak membutuhkan alat khusus. Namun ‘a membutuhkan waktu yang lama, selain itu waktu selang antara kerugianny ise pora yang resisten atau dorman aliran uap mengalir tersebut memungkin s f atau (non aktif) menjadi aktif kembali menjadi sel vegetatif. Cara ini digunakan untuk media.PenuntotPraktikum Mikrobiol O05 on Autoklaf merupakan alat yang digunakan dalam teri anan Stetiligag: klaf uap by Sag) 3, Uap Bertek’ “alam tekanan. Dalam auto! P berada 4 menggunakan wep poningkatan tekanan mengakibatkan sup, a keadaan jenuh, lebih tinggi. Sterilisas! cara ini menggunakan guhy 4°08 tape er ei dengan tekanan 1 alm. Tekanan yang lebih besar35- selama 15 - dibutuhkan pada temp’ ang lebih tinggi dari permukaan [a ji id at-tempat yang lebih t 7 0 berada no autoklaf harus dikeluarkan semuanya untuk mem y suhu yang diinginkan (121°C). Alat dan bahan yang disterilkan dengan cara ini akan dilewat ole panas selama proses sterilisasi berlangsung. Sehingga bahan-bahan disterilkan dengan cara ini harus yang beralfat permeabel terhadap ap panas dan tidak rusak pada suhu 110-121 'C. Panas lembab Sangat efekiy untuk mensterikan bahan dan alat meskipun pada suhu yang tidak terlaly tinggi, karena ketika uap air berkondensasi pada bahan dan alat yang disterikan, dilepaskan panas sebanyak 686 kalori per gram uap air pada suhu 121°C. Sterilisasi cara ini efektif untuk semua mikroorganisme, bax vegetatif maupun spora. n dara Oleh h uap A. Sterilisasi Kimiawi Biasanya digunakan senyawa desinfektan antara lain: 1). Peralatan besar dengan menggunakan HCI, HgCl2, Formalin, Phenol, Chlorin dan alkohol. 2). Lingkungan dengan menggunakan pestisida dan antiseptis, 3). Media dengan NaThiosulfat. Biasanya yang paling banyak digunakan adalah alkohol, baik untuk menstrilkan alat, tangan pekerja ataupun meja kerja. B. Sterilisasi Mekanik Sterilisasi secara mekanik dengan menggunakan saringan berporiyang sangat kecil, biasanya berkisar (0.22 - 0.45 mikron), sehingga mikroba tertahanpada 12 saringan tersebut. Alat yang dikenal dengan mikrofilter tersebut berkerja dengan gaya sentrifugasi ata Pompa vakum. Dimana pada sterilisasi ini: bakteri tertahan disaringsn virus tidak dapat tersaring, dan digunakan untuk bahan yang tidak tahan Panas dan mudah menguap, seperti vitamin, larutan enzim dan antiotk microfilter. f PEMBUATAN MEDIA DASAR Media kultur bal nutrisi atau zat-zat media kultur yang k ir ; a, Mn, dan sedive a ee Posisinya terdiri dari C, H, 0, N, S. P, K, Mg. Fe tuk air, ion anorganik, Co, Cu, dan Mo. Unsur-unsur ini ditemukan dalam an untuk pertumbuham neu! Kecil, dan makromolekul, Syarat media yar’ nmiktoba adalah lingkungan kehidupannya harus sesualPenuntut Praktikum Mikrobiologi Dasar oe ae rea mikroba tersebut, yaitu: susunan Unt pertaea ee fates mengandung ar untuk menjaga Kelembaban dan ae dae aeetaboleme; juga mengandung sumber karbon, mineral, ¥ ) tekanan osmose yaitu harus isotonik, derajat keasaman/pH mumnya netral tapi ada juga yang alkali, temperatur harus sesuai dan steril. Media harus mengandung semua kebutuhan untuk pertumbuhan mikroba, yaitu: sumber energi (contoh: gula), sumber nitrogen, juga ion inorganik essensial dan kebutuhan yang khusus, seperti vitamin (Jawetz dkk, 1996). ‘Selain itu, media tumbuh mikroba juga dibedakan berdasar sifat fisik yaitu media padat, setengah padat dan cair. Media padat yaitu media yang Mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat, media setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, media cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth). Media tumbuh mikroba juga dibedakan menjadi media sintesis yaitu media yang komposisinya diketahul jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar. Media semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA. Media non sintesis yaitu media komposisinya tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak daribahan dasarnya, misalnyaTomato Juice Agar. Pembuatan Media Media Potato Dekstrosa Agar (PDA) Bahan : 250 g kentang (potato), 20 g dekstrosa, 15-18 g agar-agar, 1000 ml aquades, label. ‘lat: Gelas Beaker, Erlenmeyer, Timbangan Analitik, Autoclave. Cara membuat: b. 2 amoo . Saring ekstral |. Atur pHnya menjadi 6-7 . Tuang media ke Kupas kentang dan iris menjadi bentuk dadu kecil-kecil dan timbang sebanyak 2509. | 7 Tuang 1000 mi aquades ke Gelas Beaker selanjutnya masukkan irisan kentangdan rebus sampai lunak | k menggunakan kertas saring/saringan dan tampung menggunakanGelas Beaker. / ; Tembahkan ‘Aquades sampai volume mencapai 1000 mi kembali. Masukkan 15 g agar-agar, aduk dan larutkan sampaihomogen. ‘Tambahkan 20 g dekstrosa, aduk dan larutkan sampai homogen lagi. dengan menambahkan larutan HC! 1 N atau NaQH kur dengan pH indikator universal. tana td Erenmeyer dan sterilkan menggunakan autoclave dengan cara kerja seperti diuraikan pada mater | 2 in Soe SUNYPenuntut Paktikum Mikrobiolog! Daser Media Potato Dekstrosa Bahan : 250 g Kentang (potato), 20 g Dekstrosa, 1000 ml Aquades, labe) Alat — : Gelas Beaker, Erlenmeyer, Timbangan Analitik, Autoclave Cara membuat : . Kupas kentang iris menjadi bentuk dadu kecil-kecil dan timbang ‘sebanyak 250g. Twang 1000 ml aquades selanjutnya masukkan irisan kentang dan rebus sampai lunak. Saring ekstrak menggunakan kertas saring / saringan dan tampung menggunakan gelas Beaker. Tambahkan aquades sampai volume mencapai 1000 mi kembali. . Tambahkan dekstrosa, aduk dan homogenkan lagi. . Atur pHnya menjadi 6-7 dengan menambahkan larutan HCI 1 N atau NaOH 1N dan ukur dengan pH indikator universal. Tuang media ke Erlenmeyer dan sterilkan Mmenggunakan autoclave dengan cara kerja seperti diuraikan pada materi I. ea 9 Fs Bp > o@ a Media Nutrient ‘Agar (NA) Bahan + 20g Nutrient Agar, 1000 mi Aquades, Label. lat: Gelas Beaker, Erlenmeyer, Timbangan Analitik, Autoclave. Cara membuat : a. Timbang 23 \omogen, b. Tuang ke Erlenmeyer dan atur 9/NA, larutkan dalam 1000 ml aquades dan aduk sam 2 ibs akan larut PHnya menjadi 6-7 dengan mena rutanHCl 1 N atay NaOH 1 N dan ukur dengan pH indikator univers ¢. Sterikan mediua . sepat diuraikanpada mater) eounakan autoclave dengan cara kerja 22Penuntut Praktium Mic obiologi Dasar Media Natrium Agar Miring Bahan : 20g Nutrient Agar, 1000 ml Aquades, Label. Alat : Gelas Beaker, Erlenmeyer, Timbangan Analitik, Autoclave Cara membuat : a. b. Tmbang 23 g NA, larutkan dalam 1000 ml aquades dan aduk sampai homogen, Tuang ke Erlenmeyer dan atur pHnya menjadi 6-7 dengan menambahkan larutanHCl 1 N atauNaOH 1 N dan ukurdengan pH indikator universal. . Sterilkan mediua menggunakan autoclave dengan cara kerja seperti diuraikan pada materi |. |. Sebelum diautoklaf, tuangkan media NA dengan volume tertentu menggunakan pipet volume : 5 ml ke dalam tabung reaksi untuk NA miring, 10 ml ke dalam tabung reaksi untuk NA tegak, gra Sat me oat So & Tele SV 2Penuntut Praktikum Mikrobiologi Basar 2h Tahap Pelaksanaan A. Asistensi Umum ; ten praktikum membuka * jalan incar,efektf efiien dan i ‘absen praktikan. fatten mmenjelaskan orientasi percobaan yang akan dilakukan, * ‘asisten membagi kelompok. Asisten menjelaskan persiapan pertemuan dengan berdoa agar bernilai ibadah. Prakticun fdan prosedur kerja tiap percobaan, P2PONn jlisasi dan pembuatan medium 8 Pr ot tkon membagi diri dalam kelompok-kelompok unty menyiapkan alat dan bahan percobaan yang akan dilakukan, 2. Praktikan didampingi asisten melakukan percobaan sesui prosedur, 3. Praktikan dan asisten dapat melakukan diskusi-diskusi singkat terkait percobaan yang sedang berlansung. 4, Menyusun laporan untuk capaian kompetensi. Posedur Kerja Pembuatan Medium dan Prosedur streilisasi A. Alat Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah Tabung Reaksi, Pipet Tetes, Erlenmeyer, Gelas Ukur, Cawan Petri, Gelas Kimia, Sentrifuges, Jarum Ose, Lampu Bunsen, Oven, Autoklaf. B. Bahan Bunsen medium NA (Nutrien Agar), PDA (Potato Dextrosa Agar) C. Cara kerja 1. Pembuatan Medium a) Medium nutrient agar ditimbang satu persatu Bahan : Ekstrak daging 3 gram, pepton 5 gram, agar 15 — 20 gram, air suling. Cara kerja : Semua bahan dima: dalam air suling hing Sampai 1000 ml aqu suhu 121°C sukkan ke dalam gelas Erlenmeyer dilarutkan 19a 800 mi, dipanaskan sampai larut, dicukupken fadest, Kemudian disetrilkan dalam autoklaf pad# selama 15 menit atur pH7. b) Contoh medium semi sintetik Medium semi sinteti Ik 1 liter (1000 mi bene ett: Pembuatan medium unk Wie citimbang 20 gram, Bila ingin membuat 100 ml ma"@Penuntut Praktikum Mikrobiologi Dasar medium yang ditimbang sebanyak 100/1000 x 20 gram. Dipanaskan sampai larut, dicukupkan sampai 1000 ml aquadest, kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. 2. Sterilisasi 1). Sterilisasi Pemijaran Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh : Jarum Inokulum, Pinset, Batang L. Sterilisasi Oven Sterilisasi menggunakan oven (170-180)°C selama 1,5 - 2 jam. Proses sterilisasi panas kering terjadi melalui mekanisme konduksi panas. Panas akan diabsorpsi oleh permukaan luar alat yang disterilkan, lalu merambat ke bagian dalam permukaan sampai akhimya suhu untuk sterilisasi tercapai. Pada sterilisasi panas kering, pembunuhan mikroba terjadi melalui mekanisme oksidasi sampai terjadi koagulasi protein sel. Sterilisasi menggunakan cara ini _kurang efektif dalam untuk membunuh mikroba sehingga memerlukan suhu yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang. Sterilisasi panas kering umumnya digunakanuntuk alat yang terbuat dari kaca misal : Erlenmeyer, Tabung Reaksi, Cawan Petri. 2). 3). Uap air panas bertekanan : Sterilisasi menggunakan autoclave (121°C, tekanan 1,5 - 2 atm, 45-20 menit). Pada saat melakukan sterilisasi uap bertekanan, sebenamya dari uap jenuh pada tekanan tertentu selama waktu dan suhu tertentu pada suatu objek terjadi pelepasan energi uap yang mengakibatkan denaturasi atau koagulasi protein sel mikroba sehingga melemahkan aktivitas mikroba. Selain itu, steriisasi menggunakan autoclave merupakan cara yang paling baik karena uap air panas dengan tekanan tinggi menyebabkan penetrasi uap air ke dalam selsel mikroba menjadi optimal sehingga langsung mematikan mikroba. Sterilisasi ini digunakan untuk alat yang terbuat dari kaca dan bahan/media misal : Erlenmeyer, Tabung Reaksi, Cawan Petri, PDA, NA. Sterilisasi_ secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alcohol. 4).Penuntut Praktixum Mikobiologi Dasar Pertanyaan Penuntun (wajib isi sebelum praktikum): 4. Apa Pengertian Sterilisasi? 2, Apa Pengertian Steril? 3, Apa pengertian Sterilitas? 4. Jelaskan pengertian dan prinsip kerja aseptis ! . dele ili fs ae temic stots _Sterilisasi_ dan sebutkan cara mensterilkan lanbahan yang digunakan dalam Percobaan ini !Penuntut Praktikum Mikrobiologi Basar Pertanyaan- pertanyaan pada saat diskusi: 1. Apa fungsi agar pada media pertumbuhan? 2. Mengapa pada waktu inkubasi cawan petri harus diletakkan terbalik? 3. Jelaskan prinsip dasar dan tujuan teknik isolasi mikroba secara streak plate, pour platedan spread plate! 4. Apa yang dimaksud dengan kultur mumibiakan murni? 5. Bagaimana teknik penggoresan yang benar pada teknik isolasi secara streak plate agar supaya didapatkan koloni bakteri terpisah? 6. Kapan fiksasi dilakukan dalam pengecatan bakteri? Apa tujuan dilakukannya fiksasi dalam tahapan pengecatan bakteri? 7. Pertanyaan lain dapat diberikan assisten/dosen. rer Or a Se IV ”Penuntut Praktikum Mikrabiologi Dasar Hasil Pengamatan Tabel : Hasil Pengamatan Sterilisasi media No Media Pengamatan Hari Keadaan Ke- Kontaminasi Tidak Kontaminasi 1 PDA 3 | Potato Dextrosa 28Penuntut Proktikum Mikrobologi Dasar PERTEMUAN Ill PENGECATAN BAKTERI Pendahuluan A. Maksud dan Tujuan Percobaan Maksud 1, Mengetahui bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri, 2. Mengetahul pewarnaan gram, sederhana dan negatif. 3. Mengetahui golongan bakteri gram positif dan gram negatif. Tujuan 1. Membedakan bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri. 2. Mampu menggunakan teknik pewarnaan gram, sederhana dan negatif. 3. Mampu membedakan bakteri gram posistif dan gram negatif melalui pewarnaan, B. Prinsip Percobaan 1. Melakukan pengamatan bentuk dan struktur sel bakteri berdasarkan hasil pewarnaan. 2. Melakukan pengamatan dan membedakan bakteri gram positif dan gram negatif berdasarkan hasil pewarnaan. C. Sasaran Percobaan Mahasiswa diharapkan dapat menerapkan praktek laboratorium yang baik, mengetahui prosedur kerja teknik pewamaan dan dapat menentukan bentuk dan struktur sel bakteri serta membedakan bakteri gram positif dan negatif. Materi Pembelajaran Bentuk bakteri beraneka macam yaitu basil (tongkat/batang), coccus, spirilum. Bakteri bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Bakteri bentuk kokus dibagi menjadi monokokus, diplokokus, dan stafilokokus.Untuk bakteri bentuk spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro, 1998). Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwama in dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka arnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara penelitian mikrobiologl (Dwidjoseputro, 1998). juga transparal dikembangkan suatu teknik pews yang paling utama dalam penelitian- Pewarnaan gram bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri denganmudah. edakan spesies bakteri menjadi dua kelompok ram untuk memb: } bovae Gain’ Gian positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik Irigy el mereka, Motode ini diberl nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkanPeruntutPraktikum Mik ebiolog! Dasa dasar teknik pewarnaan bakteri a, 4. Prins suler dari bakteri dengan senyawa att adanya ikatan ion antara kop’ fen. Terjadi ikatan ionkarena adanya muata dar pewamaan Yano aluet maupun pada pewarnaan, Berdasarkan ea i ka dopat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa, ecale bier adalah a).memberi warna pada sel atau bagian-bagiannya Sa anemia kontras dan tampak lebih jelas, b). dapat untuk menunjukkan pars bagian struktur sel, ¢). membedakan mikroba satu dengan yang lain, dan d). menentukan pH. dan potensial oksidasi reduksi ekstraseluler dan intraseluler (Jutono dkk., 1980). Pengecatan bakteri umumnya menggunakan lebih dari satu tingkat pengecatan. Hasil pengecatan dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti : fiksasi, substrat, dekolorisator dan sebagainya. Dalam pembuatan pulasan bakteri yang siap diwarnai, perlu dilakukan fiksasi terlebih dahulu yang bertujuan antara lain : a). mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel, b). merubah afnitas cat, c). mencegah terjadinya otolisis sel, d). dapat membunuh mikroba secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan- perubahan bentuk atau strukturnya, e). melekatkan bakteri di atas gelas benda dan f). membuat sel-sel lebih kuat/keras. teknik ini pada tahun 188: Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat wama metil ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol. Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwamai dengan safranin akan berwama merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, poripori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna ungu. Pewarnaan secara umum digunakan untuk mengetahui morfologi sel bakteri, namun terdapat pula teknik pewarnaan untuk mengetahui beberapa bagian dari sel bakteri seperti endospora, kapsul dan flagella. Beberapa teknik Pewarnaan yang sering digunakan diantaranya : Pewarnaan negatif (negativ estanng ), pewarnaan sederhana, pewarnaan asam (acid fast staining — Zieh! - Bie Ras uate Pewamaan endospora ( Endospore staining — Schaeffer - cmmieneas bat ), Pewarnaan Gram( Gram staining ), dsb. Konfirmasi jenis aaa pat dilakukan menggunakan KOH 10%. Pewarnaan untuk jamut a menggunakan teknik : Lactophenol blue stain, PAS and methenamine silver staining dan Gomori m ine si i blue (LCB) adalah re etpenemine silver (GMS) stain , Lactophenol cotton 30Penuntut Praktikum Mikrobologi Dasar |. Tahap Pelaksanaan A. Sebelum Praktikum 1. Asisten dan praktikan membuat larutan cat. 2. Asisten menyiapkan bakteri uji B. Hari Praktikum 1. Asisten praktikum membuka Pertemuan dengan berdoa agar Praktkum berjalantancer, efektif, efisien dan bernilai ibadah. Asisten mengabsen praktikan. Asisten memberikan pra-test untuk megevaluasi kesiapan praktikan. Asisten menjelaskan orientasi percobaan yang akan dilakukan. Asisten — praktikan membagi diri dalam kelompok kelompok untuk menyiapkan alat dan bahan percobaan yang akan dilakukan. Praktikan didampingi asisten melakukan percobaan sesui prosedur. Praktikan dan asisten dapat melakukan diskusi-diskusi singkat terkait percobaanyang sedang berlansung. 8. Menyusun laporan untuk capaian kompetensi. ean xo Il, Prosedur Kerja A. Alat yang digunakan Mikorskrop objek dan deg gelas, botol semprot, baskom, pipet tetes, ose bulat, pembakaran spiritus B. Bahan yang digunakan Air suling steril, medium NA (Nutrient Agar), kotoran gigi, biakan Bacillus subtilis dan Escherichia coli, Cat tinta cina atau Nigrosine, Alcohol 70%, Larutan Kristeal Violet (Gram A), Larutan lodin (Gram B), Larutan Alcohol ‘Asam Aseton (Gram C), Larutan Safranin dan Metilen Bule C. Cara kerja 4. Penyiapan bakteri uji a. Disiapkan alat dan bahan. b. Diambil bakteri uji dari biakan muri dengan menggunakan ose bulat. c. Diremajakan dalam medium NA miring dan dikubasikan pada suhu 37°C selama 24 jam : , d. Setelah bakteri uji diremajakan kemudian disuspensikan dengan NaCI Fisiologi 0,9%. . Pewarnaan negatif ; te bersnkan gelas obyek dan kaca penutup dengan Alcohol 70% sampai bebas lemak. < b. iambil 4 ose biakan, diletakkan biakan pada obyek gelas kemudian ditetetsi nigrosine. alPenuntut Praktikum Mikrobiologi Dasar c da. e. nggunakan objek gelas lain diletakkan pada obj ee cea sampel sehingga membentuk sudut ae selanjutnya ditark objek gelas tersebut dengan arah yang berlawanan hingga membentuk film tips. Membiarkan hingga mengering lalu diamati di bawah mikroskop, Gambar hasil diamati. boone on LT reat sa 0% Fitts Ben ana Deng - Pijarkan jarum oase le Ai akan Bact outs \ Z Beri 1 tetes Nigrosin | ‘Ratakan dengan kaca objek lainnya Wa + Diamkan hingga kering ~ Amati dengan perbesaran 400 x 3. Pewarnaan Sederhana b, Bersihkan gelas objek dan kaca 1 70% sampai bekas lemak. heres Dibuat preparat olesan bakteri i spirtus. akteri lalu fiksasi dengan pembakaran ~ Diteteskan larutan cat yang digunakan di atas olesan preparat tersebut sebanyak1-2 tetes dan biarkan selama 1-2 menit. | Dicuci dengan air mengalir sampai sisa cat tercuci habis, Kemudian mengeringkan dengan hat-hati menggunakan tissve . Diamati di bawah mikroskop, Menggambar hasil yang diamati.Penuntut Praktikum Mikrobiologi Dasar bine sengse ae 4. Pewaraan Gram a. b. 2 sesoa . Bersihkan gelas obyek dan kaca penutup dengan alcohol 70% ‘sampai bebas lemak. Diambil 1 ose biakan, diletakkan biakan pada objek gelas kemudianditetesi dengan 1-2 tetets Gram A. . Mencuci dengan air mengallir dan mengeringkan dengan tissue roll dengan hati hati. |. Meneteskan larutan Gram B, membiarkan selama 1 menit. . Mencuci dengan air dan keringkan. Meneteskan larutan Gram C, membiarkan selama 30 detik. |. Mencuci dengan air dan keringkan. . Menetesi dengan larutan Gram D, membiarkan selama 30 detik, mencuei dengan air dan mengeringkan dengan tissue. Mengamati dibawah mikroskop, gambar hasil pengamatan. nora Su iis Ss kk Ske 33PenuntutPraktikum Mikrobolagi Basar penambahan Knstal Ungu penambahan lugol's iodine et = alkohol 96% pemberian sefranin 34Penuntut Prakticum Mikrobiologi Dasar Hasil Pengamatan -—__ Pengamatan” ee ee ome ee | arnt at Se 35PenunttPraktihum Mir bilag Dasar Hasil Pengamatan 36Penuntut Praktikum Mikrobiologi Dasar PERTEMUAN IV SOLAS! DAN PENANAMAN MIKROBA |. Pendahuluan 41. Maksud dan Tujuan Percobaan Maksud Mengetahui dan memahami cara menginokulasikan dan mengisolasi mikroorganisme pada beberapa medium. Tujuan 1. Menginokulasi mikroorganisme dengan metode gores pada medium 2. Mengisolasi mikroorganisme pada substrat padat dan substrat cair 3. Mengetahu bentuk-bentuk pertumbuhan mikroorganisme 2. Prinsip Percobaan . Penginokulasian mikroorganisme dari biakan murni dan sampel dengan metodetegak, agar miring, metode cair, serta metode gores pada cawan petri menggunakan medium NA, NB, PDA kemudian diamati bentuk permukaan mikroba diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 x 24 jam untuk bakteri dan pada suhu kamar 3 x 24 jam untuk jamur 2. Pengisolasian mikroorganisme dari substrat cair dan substrat padat dengan menggunakan medium NA dan menggunakan Metode Tuang. Metode sebar dan metode gores kemudian diamati bentuk permukaan mikroba setelah diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 x 24 jam 3. Sasaran Percobaan 4. Mahasiswa diharapkan dapat mengetahui cara isolasi mikroorganisme dengan metode tuang, sebar dan gores. 2. Mahasiswa diharapkan dapat mengetahui cara inokulasi mikroorganisme dengan metode agar tegak, miring, cair dan gores Materi Pembelajaran Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri daricampuran berbagai jenis. Di dalam laboratorium, populasi mikroba dapat diisolasi dari sumber / habitat seperti udara, tanah, air, makanan dan lainnya. il isolasi i ikroba campuran dan perlu Hasil asi umumnya merupakan biakan mikroba c dimurnikan untuk memperoleh biakan murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat fisiologi dan biokimiawinya. Isolasi dapat dilakukan_ menggunakan beberapa teknik berikut ram Suhr bls Se i SH 37Penuntut Praktikum Mirobiologi Basar atu mikroba perlu diperhatikan faktorfaktor nutrisi serta kebutuhan kan oksigen, (gas, 02 atau udara). Cara menumbunkan mikroba yanganaerob sangat berbeda dengan yang aerob. Mengisolasi suatu mikroba jalah memisahkan mikroba tersebut dari lingkungannya di alam dan kan muri dalam medium buatan. Untuk isolasi ai bial m ea ee eee menanam dan menumbuhkan mikroba pada medium biakan serta syarat-syarat lain untuk pertumbuhannya (Jutono dkk, 1980), Mikroba jarang terdapat di alam dalam keadaan mumi. Kebanyakan merupakan campuran bermacam-macam spesies mikroba. Macam-macam cara mengisolasi dan menanam mikrobia adalah : 1). Spread plate method (cara tebar/sebar), 2) Streak platemethod (cara gores), 3). Pour plate method (cara tabur). Spread PlateMethod (Cara Tebar/Sebar) Teknik spread plate merupakan teknik isolasi_ mikroba dengan cara menginokulasikultur mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan media agar yang telah memadat. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur mikroba. Karena konsentrasi sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap, sehingga sekurang- kurangnya ada satu dari pengenceran itu yang mengandung koloni terpisah (30- 300 koloni). Koloni mikrobia yang terpisah memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung. Alat dan bahan: . Spreader / Batang Bengkok / Batang Drigalsky . Pipet Volume, Lampu Bunsen . Media NA dalam Cawan Petri . Kultur Murni Bakteri . Larutan pengencer (BPW atau NaCl fisiologis 0,9%) PROS Cara kerja: 2. Buatlah pengenceran 10-1 - 10-6 dari kultur mumi bakteri dengan larutan pengencer. 3. Ambil tabung reaksi yang mengandung kultur muri bakteri, buka dan bakar leher tabung. 4. Pindahkan 0,1 ml kultur bakteri secara aseptis ke permukaan media NA dalamcawan petri. . aa Spreader yang sebelumnya telah dicelupkan dalam alkohol, biarkan 6. Tebarkan/sebarkan kultur bakteri dengan spreader secara merata dan biarkan sampai permukaan agar mengering (lihat Gambar 1). 7. Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya inkubasikan secara terbalik Selama 24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya. 8. Bandingkan pertumbuhan dari tiap-tiap Pengenceran dan bandingkan pertumbuhannya dengan hasil teknik Z (sterilisasi secara fitrasi). annie nae a 38 Pram brn Flats Save 6 ade UKL080 Penuntut Praktikum Mikrobiologi Dasar 7 = FERRED FERRED: penn mo = - a a ED SS ‘MIXED SZ = CULTURE — PHYSIOLOGICAL SALINE (GROWING ON THE MEDIUM alias Pour Plate Method (Cara Tabur) Cara pada ini dasarnya ialah menginokulasi medium agar yang sedang mencair temperatur 45 - 50°C dengan suspensi bahan yang mengandung mikroba, dan menuangkannya ke dalam cawan petri steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-koloni yang tersebar di permukaan agar yang mungkin berasal dari 1 sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980). Alat dan bahan: 1. Media NA dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1) 2. Cawan petri steril 3. Kultur murni bakteri 4. Pipet volume, lampu bunsen Cara kerja: 2. Dinginkan media NA dalam tabung reaksi sampai suhu + 45 - 50°C (Cirinya : terasa hangat di kulittidak ‘kemranyas'’). 3. Buka tutup tabung yang mengandung kultur muri bakteri, dan bakar leher botol. 4, Pindahkan 1 mi kultur mumi bakteri ke dalam tabung reaksi yang mengandungNA secara aseptis. 8 5, Bakar leher tabung di atas bunsen, dan tuangkan media NA yang telah mengandung kultur murni bakteri ke dalam cawan petri. — 6, Goyangkan perlahan-lahan untuk mencampur Kultur bakteri dengan NA’ gampai homogen.Penggoyangan petri jangan terlalu kuat. Pada saat penuangan media, petri bisa diletakkan dalam radius maksimal 20 cm dari sumber api (zona steril) (hat Gambar 2). 7. Setelan agar memadat diinkubasi terbalik pada suhu kamar selama 2a jam. Inkubasi terbalk dilakukan seteleh agar memadat, Amati pertumbuhannya. pero ls Ses eb Ss 0Penuntut Praktikum Mikrobilog!Dasar Streak Plate Method (Cara Gores) Cara gores umumnya digunakan untuk mengisolasi koloni mikroba pada cawan agar sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan muri. Cara ini dasamya ialah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada permukaan medium agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari + sel mikroba, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980). Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Bakteri yang memiliki flagella seringkali membentuk koloni yang menyebar terutama bila digunakan lempengan yang basah. Untuk mencegah hal itu harus digunakan lempengan agar yang benar-benar kering permukaannya (Lay, 1994) Alat dan bahan: 4. Media NA dalam cawan petri 2. Kultur murni bakteri 3, Jarum ose 4, Lampu Bunsen Cara Kerja: * es j{ingga memjar di ates bunsen, kemudian dinginkan. akin cavan pat ingin untuk menggores pada permukaan media 294° . Ambil 1 " . cimulal pada ona oP bakteri dan goreskan pada permukaan media 2061 ng. Pethatikan teknik penggoresan! Ose disentuhkan pad permukaan media agar dala i meluncur di atas permukaan eae a enter . Setiap kali menggoreskan ose untuk dahulu dan biarkan dingin kuadran berikutnya, pijarkan ose tet 4. Inkubasikan secara_terbali iba : pertumbuhannya, lik pada suhu kamar selama 24 jam dan amat 40 Popa Sk ms aPenuntut Praktikum Mikrobiologi Dasar Metode cawan gores dibagi menjadi beberapa tipe, diantaranya : 1. Goresan Sinambung Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau mediumbaru Cara kerja : Sentuhkan ujung ose pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Putar cawan 180o lanjutkan goresan sampai habis. Tipe goresan sinambung/kontinyu juga dilakukan pada media agar miring dalam tabung reaksi Goresan T Tipe goresan T diguankan untuk mendapatkan koloni tunggal ores n denganmembagi wilayah goresan menjadi 3. ‘a: Tandai bagian luar-bawah cawan petri dengan membagi cawan i sf i bagtan menggunakan spidol marker, inokulasi daerah 1 dengan menjadi 7 j ji lanjutkan i ‘arum ose dan tunggu dingin, kemudian Saree ars aaa 2. Cawan diputar untuk memperoleh goresan streak zig- za\ yang sempurna. sn me Foe Svs abo USUAL aPenuntut Praktikum Mikrobiologi D2sar h Mikroba Penghitungan jumlah sel mikroba dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, antara lain secara langsung dengan hitung mikroskopik (direct microscopic count) menggunakan haemocytometer dan secara tidak langsung dengan hitung cawan (p|ate count), selain itu juga terdapat penghitungan menggunakan metode MPN dan turbidimetri menggunakan alat spektrofotometer. Penghitungan Jumlal Penghitungan langsung menggunakan haemocytometer. Hitung mikroskopik merupakanmetode yang cepat dan murah tetapi mempunyai beberapa kelemahan antara lain: sel- sel yang mati tidak dapat dibedakan dari sel hidup, sel-sel yang berukuran sngat kecil sulit dillhat sehingga kadang-kadang tidak terhitung. Pada haemocytometer ruang hitungterdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm?. Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotakkecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruanghitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui Teknik - Teknik Pemindahan Kultur Mikroba Untuk mencegah tercemarnya pada waktu memindahkan mikroba, cara-cara memindahkan biakan mur Alat dan bahan: Nee We eget 9 ea ai pereobaan 1) Ned avn cr a ens es Prtean anu ose! ‘alam tabung reaksi (hasil percobaan 1) i eum inokulasi . Kultur murni bakteri Lampu bunsen Vortex mixer biakan muri, perlu diadakan teknik aseptik Dalam percobaanpercobaan ini akan dipelajati ni dengan cara aseptik. @PNOARONA 42 Pe Be Frm fatePenuntut Praltikum Mikrobiologi asar Cara Kerja: 1, Siapkan media NA dan NB hasil percobaan 1 (media NA miring, media NA tegak dan media NB/cair). Pemindahan kultur mikroba dilakukan satu persatu untuk Masing-masing media. 2. Longgarkankan tutup dari masin, (angandi lepaskan!), 3. Pegang tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri di tangan kiri. 4, Pegang jarum ose Pada tangan kanan dan bakar di atas nyala lampu bunsen hingga kawat memijar. Perhatian : pemanasan jarum ose dilakukan dari Pangkal ke ujung sampai memijar, sebelum digunakan kawat didinginkan beberapa saat! Pegang ose menggunakan ibu Jari dan jari telunjuk, gunakan Jari kelingking untuk membuka tutup tabung reaksi (tutup tabung reaksi tetap dipegang seperti posisi semula). . Bakar mulut tabung reaksi, masukkan jarum ose dan ambil 1 ose biakan bakteri. 7. Bakar kembali mulut tabung reaksi dan tutup tabung reaksi kembali.. 8. Ambillah tabung reaksi yang akan diinokulasi dengan tangan kiri, dengan carayang sama buka tutup tabung reaksi, dan bakar mulut tabung reaksi. 9. Inokulasikan biakan bakteri pada tabung reaksi inokulasi dengan cara goresan zig-zag pada permukaan NA miring. 10. Bakar mulut tabung reaksi dan tutup tabung reaksi kembali, kemudian bakar ose. 11. Beri label : tanggal percobaan, nama bakteri, teknik pemindahan dan nama kelompok. . . 12. Tolan dengan cara yang sama untuk media nutrien cair/NB menggunakan jarum ose dan media agar tegak secara tusukan tegak lurus menggunakan jaruminokulasi. s 13, inkubasian selama 24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya. \g-masing tabung reaksi yang berisi media pn ss ls Se Ns 43Penuntut Paktikum Mikrobilog! 0259" Pertanyaan Diskusi 4, Apa fungsi agar pada m .edia pertumbuhan? Mengapa pada waktu inkubasi cawan petri harus diletakkan terbalik? ny 3. Jelaskan prinsip dasar dan tujuan teknik isolasi mikroba secara streak plate, pourplate dan spread plate! x |. Apa yang dimaksud dengan kultur murnibiakan murni? 2 9. Bagaimana teknik penggoresan yang benar pada teknik isolasi secara streak plateagar supaya didapatkan koloni bakteri terpisah? . Kapan fiksasi dilakukan dalam pengecatan bakteri? Apa tuj , ? a tujuan dilakukannyafiksasi dalam tahapan pengecatan bakterl? - Pertanyaan lain dapat diberikan assisten/dosen, 4hPenuntut Praktixum Mikrobiologi Dasar PERTEMUAN V UJI SENSITIVITAS DAN POTENS! ANTIBIOTIK Pendahuluan 1. Maksud dan Tujuan Percobaan Maksud 1. Mengetahui cara pengujian Sensitivitas dan potensi antibioti metociaal potensi antibiotic dengan 2. Mengetahui cara Pengujian potensi antibiotic metode dilusi (pengenceran), Tujuan Percobaan 1. Menentukan besarnya potensi sampel antibiotika di pasaran terhadap Escherichia coli, Bacillus subtilis. 2. Menentukan sensitivitas antibiotic yang beredar di pasaran terhadap Escherichia coli, Bacillus subtilis. 2. Prinsip Percobaan 1, Membandingkan lebar diameter hambat (zona bening) yang dihasilkan oleh antibiotika di pasaran 2. Uji aktivitas antimikroba dengan melakukan pengujian konsentrasi hambat minimum (KHM) mikroba berdasarkan metode difusi agar menggunakan pencadang logamigelas/kertas, dimana_konsentrasi senyawa obat tertentu dimasukkan kedalam masing-masing pencadang kemudian diukur zona bening disekitar pencadang sampai diperoleh konsentrasi senyawa obat terkecil yang masin memberikan daya hambat. 3. Sasaran Percobaan - 1. Mahasiswa diharapkan dapat mengetahui cara penentuan sensitivitas antibiotic terhadap mikroorganisme. 8 . 2. Mahasiswa dapat menentukan tingkat sensitivitas dari sampel berapa ‘obat antibiotic yang beredar terhadap pertumbuhan mikroorganisme tertentu yang bersifat pathogen. Materi Pembelajaran Indonesia dinyatakan bahwa potensi adalah perbandingan ase sedan Ur ashgi dosis larutan standar atau larutan pembanding yang t hambatan pertumbuhan yang sama pada biakan jasad renik (potensi) antibiotik dapat ditunjukkan pada kondisi i efek daya hambatannya pada mikroba. Suatu penurunan ea erie juga an dapat menunjukkan perubahan kecil yang tidak dapat ditunjukkan oleh metode kimia, sehingga pengujian secara mikrobiologi atau bistog| acer merupakan suatu standar untuk mengatasi keraguan tentang menghasilkan derajat i yang peka dan sesuai. Aktivitas (1 gr Sa Far os Ss kao ISU 45Penuntut Praktikum Mikrobiolog asa armakope Indonesia menentukan bahwa 7 . Namun potensi so nvibiotika standar berkisar antara 95° 105%. yang ae bennebut potensi antibiotika st kadaluwarsa, penyimpal y ; T dan dapat menurun Sera yang menghasilkan Ee oe memilki an ae ia en CRs sail antibiotika dapat dilihat pa aan kuat eae ae efek lagi. Aktivitas tan, Makin rendah MIC mal t potensialnya, dan besar diameter hambatan. meter hambatan, makin kuat pug i ir diar pt i ae area petmnya, antibiotk yang mepunyai potensi tinggi Sera InG iat rendah dan diameter yang besar. Ada dua metode umum memi a ligunakan : 1). Metode Penetapan ee a a ee aaa difusi antibiotika dari silinder lempeng, sehingga mikroba yang ditambahkan dihambat pertumbuhannya pada daerah berupa lingkaran atau zona disekeliling silinder yang berisi larutan antibiotika, 2). Metode Turbidimetri Metode ini berdasarkan hambatan pertumbuhan biakan mikroba dalam larutan serbasama antibotika, dalam media cair yang dapat menumbuhkan mikroba dengan cepat bila tidak terdapat antibiotika. ivitas. F kemungkinan hilangnya aktivitas. Uji potensi antimikroba dapat dilakukan dengan 2 macam metode, yaitu metodedifusi dan metode dilusi. Cara pengujian potensi (daya atau kekuatan) senyawa antimikroba ada bermacammacam, tergantung pada sifat dan bentuk sediaan senyawa antimikroba, Pada umumnya digunakan cara Pengenceran, cylinder diffusion plate method, Paper disk diffusion method dan agar dilution plate method. Prinsip kerja metode difusi adalah terdifusinya senyawa antimikroba (misalnya antibiotik) ke dalam media Ppadat di mana mikroba uji (misalnya bakteri patogen) telah diinokulasikan. Metode difusi dapat dilakukan secara paper disk dan secara sumuran. Pada metode difusi secara paper disk, kertas disk yang Mengandung antibiotik diletakkan di atas deca. tone yang telah ditanam mikroba uji, setelah itu hasilnya a ja a ee pertumbuhan mikroba oleh antibiotik terlihat sebagai Pertumbuhan mikroba, Metode difusi secara sumuran dilakukan dengan membuat sumuran di i ; lengan med agar yang telah ditanami mikrot nani c ba Uji. Sumuran dibuat te, yada eae gak lurus terhadap eee media. Antibiotik diinokulasikan ke dalam sumuran ini dan disk Luasnya zona ony Masinya dibaca seperti Pada difusi secara papet . a jemi f antibiotic, *Pmih merupakan petunjuk kepekaan mikrebs tethadp Selain itu, luasny in Ha berdifusi antibiotik dalam mi dia jernih ju i tan eda (L, Juga berkaitan dengan kecepa 9Y; 1994; Jawetz dik, 1986).Penuntut Praktikum Mikrobiologi Dasar PROSEDUR KERJA : Uji Potensi Senyawa Antibiotik socara Difusi Sumuran Alat dan Bahan : zeamoa Alat gelas : petridish steril, tabung reaksi, erlenmeyer, pipet ukur, pipet tetes, gelas ukur ‘ Maicopnet Pelobang gabus no. 4, jangka ‘sorong/penggaris, jarum ose, spidol,kertas label, vortex mixer, spreader Senyawauji berupa antibiotik (misalnya Amoxycilliin sirup kering) dengan variasikonsentrasi : 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml Kultur muri bakteri ujidalam media NB umur 24 jam Media nutrien agar (NA) Deret larutan standar Mac Farland Nutrient Broth (NB) untuk pembuatan suspensi bakteri uji . Aquadest sterilsebagai pelarut senyawa uji Alkohol 70 % Cara Kerja: Preparasi Senyawa Uji Preparasi senyawa uji dilakukan sesual petunjuk dalam kemasan, kemudian buatlah berbagai variasi konsentrasi senyawa uji. Pada praktikumini dibuat 4 variasi konsentrasi senyawa uj (konsentrasi 25; 12.5; 6,25 dan 3,125 mg/ml (Perhatikan cara pembuatan konsentrasi senyawa uj!) Preparasi Mikroba Uji Siapkan kultur murni bakteri uji b. Siapkan deret larutan standard Mac Farland c, Buat sebanyak 2 tabung @10 mi sus} Pengujian Potensi Antibiotik seca! 1. Siapkan beberapa petri berisi 20 ml media nutri pensi bakteri ujimenggunakan media BPW dan setarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mac Farland II (konsentrasimikroba 6, 108 CFU/ml). ra Difusi Sumuran ient agar (NA), 15 ml NA dan 5 mI NA steril. a1 sn nm Fs So eo ISNAPenuntut Praktikum Mikrobiologi Dasar 48 2. Pembuatan kontrol kontaminasi media i eptis buatlah sumuran pada i berisi 20 media NA, secara as Soa eee eo welobang gabus no. 4. Ambil bulatan NA pada sumur yang aoe eclenmen jarum ose secara hati-hati sehingga NA di sekeliingnya rae eet ulatan NA tersebut dalam beker glass tidak tergores/rusak. Masukkan p berisi akohol b) Beri label pada dasar petri : kel. prakt/tgl/perlakuan. 3. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji secara double layer Tuang 5 mi NA steril ke dalam cawan petri steril, biarkan memadat i layer agar. Ray cuapenel aie uji, inokulasikan ke dalam 15 ml media NA secara pour plate, kemudian tuangkan secara merata sebagai seed layer agar di atasbase layer agar, biarkan memadat. c. Buat 1 sumuran dengan menggunakan pelubang gabus No. 4. Pembuatan sumuran dilakukan sampai dasar seed layer agar dan tidak menembus base layer agar yang berfungsi sebagai dasar sumurai d. Beri label pada dasar petri: kel. prakt/tgl/perlakuan/nama bakteri uj s Pembuatan kontrol negatif dan pengujian potensi antibiotik secara difusi sumuran Buatlah media base layer agar dan seed layer agar seperti pada tahan . Bagian dasar petri dibuat garis dengan spidol untuk membaginya menjadi 4 bagian. Buat sumuran pada bagian tengah ke-4 bidang petri tersebut dengan cara yangsama dengan no. 3). Dengan menggunakan mikropipet, pada masingmasing sumuran tersebut diinokulasikan 50 il senyawa uji dengan kontrol negatif/pelarut dan 4 variasi konsentrasi senyawa uji. . Beri label pada dasar petri secara benar f. Inkubasikan selama 24 jam Perhatian : inkubasi tidak dilakukan secara terbalik! Amati zona keruh dan jemih di setiap petri. f) Amati, gambar Pertumbuhannya. Ukur diameter zona jemih di sekitar sumuran dengan jangka Sorong/penggaris. Hitung diameter zona hambat yang terbentuk 2 sp 2 Param Set ms Fees St ene vhsBuku Panduan Praktikum Mikrobiologi Dasar 2021 Penuntut Praltikum MikcobiologiDasar Uji Potensi Senyawa Antibiotik Secara Difusi Paper Disk Alat dan Bahan : a. Alat-alat: Petridish, pinset, pipet volume steril b. eal murni bakteri uji dalam media NB umur 24 jam ©. Disk antibiotik (paper disk yang men ibiotik penisilin/ampi " \gandung antibiotik penisilin/ sebagai kontrol positit 7 ce Disk blank Senyawayji berupa antibiotik (misalnya Amoxycilllin sirup kering) dengan variasi konsentrasi : 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml f. Media nutrien agar (NA) g. Deret larutan standar Mac Farland h, i i in) e. Buffered Pepton Water (BPW) untuk pembuatan suspensi bakteri uj Aquadest steril sebagai pelarut senyawa ui Alkohol 70 % Cara Kerja : a. _Preparasi Mikroba Uji 1) Siapkan kultur muri bakteri uj. b. Siapkan deret larutan standard Mac Farland. cc. Buat 10 ml suspensi bakteri uji menggunakan media BPW dan setarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mac Farland Il (konsentrasi mikroba 6. 108 CFU/ml). Pengujian Potensi Antibiotik secara Difusi Paper Disk Pembuatan kontrol kontaminasi media a. Siapkan 20 ml media NA dan tuang secara aseptis ke dalam petri steril, biarkan memadat. b. Beri label pada dasar petri : Kel. Prakt /tgl / perlakuan. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri yji a. Ambil 0,2 ml suspensi bakteri Uji, inokulasikan ke dalam petri berisi media NA secara spread plate (harus merata di seluruh permukaan media) dan biarkan permukaan agar mengering. - b. Beri label pada dasar petri : kel. prakt/igl/perlakuan/nama bakteri uii 3) Pengujian potensi antibiotik secara difusi paper disk a) Siapkan petri berisi | media nutrien agar (NA) : : c. rae 0,2 ml suspensi bakteri uj inokulasikan ke media NA secara merata ” ‘Gengan cara spread plate dan biarkan permukaan agar mengering. d. Se = aseptik,letakkan 41 disk antibiotik (disk yang mengandung ao ) dan 4 disk blank (yang mengandung berbagai isilinfampisilin) da ; aearaae vcenyawa uji antbiotk sebanyak 20 pi, serta 1 disk blank pram tt Fer ees Svs oy SLA 49Penuntut Praktikum Mikrobitogi Dasar kontrol negatif (disk yango mengandung pelarut) pada permukaan m, ledia NA. e. Setiap paper disk di finokulasikan dengan jarak tertentu secara te, agar supaya tidak terjadi overlapping zona hambat yang terbentuk. ratur, {. Beri label pada dasar petri secara benar f) Inkubasikan selama : ‘Amati zona keruh dan jernih di setiap petri 24 jam, g. Amati, gambar pertumbuhannya dan ukur diameter zona jernih terbentukdi sekitar paper disk dengan jangka sorong/penggaris, Yang 50Penuntut Praktixum Mikrobiologi asar PERTANYAAN-PERTANYAAN DISKUS! : 2. Apa perbedaan metode difusi sur Anda kerjakan diatas? eae in difusi paper disk yang - Mengapa pada preparasi mikroba uji diperlukan larutan standar? 4. Bagaimana cara pembuatan larutan standar Mac Farland? 5, Apa fungsi dari : kontrol kontaminasi media, kontrol pertumbuhan mikroba uji dankontrol negatif/pelarut? 6. Mungkinkah digunakan pelarut senyawa uji yang memil ) potensi antimikroba?Jelaskan! N . Pertanyaan lain diberikan dosen/assistenPenuntutPraktikum Mikrobiotogi Dasa Tabel Pengamatan Nama Antibiotik Bakteri uji Diameter zona hambatan (mm) T 1 it WV Bakteri | Bakteri Bakteri Bakteri Keterangan 5?Penuntut Praktikum Mikrobiolog Dasar DAFTAR PUSTAKA 4. Anonim, 1992, ii Cara Uji Cemaran Mikroba, SNI (Stand i 1992, Badan Pen; mn Makanen, Jakarta Anonim, 1994, K igawasan Obat dan Makanar p » Keputus: in, 661/MenKes/SK/VII/1994 Tentang Psayarat oh Kesehatan RI No. . Tradisional, Jake ie , Jakarta Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tanaman Obat, Cetakan Pertama, Departemen Kesehatan i é Republik Indonesia, Direktorat J fi ide pom. Dror cee Obat Tradisional, Jakarta endera . : , Meto isi aabiseciiera aa PPOMN (MA Suplemen 2000 Revisi 2008), ar ac Prnci 1g wens Cans dan Makanan Nasional, Jakarta Atlas, aa » Principles of Microbiology, Wm. C. Brown Publishers. lowa jonang, G., dan Koeswardono, E.A., 1982, Mikrobiologi Kedokteran Untuk Laboratorium dan Klinik, 45-46, P.T. Gramedia, Jakarta 5. BPOM, 2006, Metode Analisis PPOMN, MA PPOMN nomor 96/mik/00, Uji AngkaKapang/Khamir dalam Obat Tradisional, Jakarta 6. Holt, et.al, 2000, Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Ed., Lippincott Williams and Wilkins Philadelphia, USA. 7. Hugo, W.B. and Russel, A.D., 1999, Pharmaceutical Microbiology, 5th Ed. Blackwell Science, Oxford 8. Jawetz, and Melnick, 1996, Mikrobiologi Kedokteran, EGC, Jakarta 9. Jutono, J. Soedarsono, S. Hartadi, S. Kabirun S., Suhadi D., 1980, Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum, Departemen Mikrobiologi, Fakultas Pertanian UGM, Yogyakarta 40.Lay, B., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada, Jakarta - 41.Madigan, M.7., JM. Martinko, and J. Parker, Brock, 2000, Biology of Microorganisms, 9th ed, Prentice Hall Intemational Inc., Upper Saddle River, NewYork 12. Madigan, M.T., J.M. Martinko, 13. Biology and Microorganisms, Fransisco 44.McKane, L., Kandel, J., 1998, Microbiol GrawHill Inc., New York Murray P.R., 41 ASM Press, Washington a 15. Pelezar, M.J. 14988, Dasar-dasar Mikrobiologi, UI Press, eee 46. Prescott LM Habley, J.P. and Klein, D.A., 4999, Microbiology, Fourth ; Grawe-il, New York oe fe Me 2008 Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmas!, Departemen cea Fakultas MIPA Universitas Indonesia, Jakarta P.V, Dunlap and DP. Clark, 2009, Brock 42th ed, Pearson Benjamin Cummings, San ogy : Essentials and Application, Mc 1999, Manual of Clinical Microbiology, 53 tat Eel Sa 6 eg ISHNPenuntut Praktikum Mikrobiologi Dasar KARTU KONTROL PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DASAR FARMASI No. Percobaan Nilai Nilai Nilai Paraf Respon TP |Laporan| Penanggung Jawab 1 2 3 4 Penanggung Jawab Praktikum apt. Harni Sartika Kamaruddin, S.Si., MSi.