ZICO DANIEL DESPEN SIHOMBING

10518049
TEKNIK DAN ANALISIS BIOMOLEKUL
TUGAS 2
Seorang mahasiswa melakukan tugas akhir di laboratorium Biokimia. Mahasiswa tersebut akan
mengekspresikan protein NSP16 yang merupakan protein nonstructural yang berperan dalam
capping mRNA pada virus SarsCov2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2). Gen
NSP16 tersebut akan diekspresikan intraseluler dan ditambahkan His-Tag untuk pemurnian.
Posisi Histag harus pada C-term. Vektor yang ada di laboratorium adalah pET16B, pET30a,
pET20b, pPICZα, dan pMM1525. Host yang tersedia di laboratorium adalah Escherichia coli
BL21, Pichia pastoris, dan Bacillus megaterium. Enzim restriksi yang tersedia di laboratorium
adalah EcoRI, XbaI, NdeI, XhoI, EcoRV, SalI, dan BamHI.
1. Tulis strategi riset dalam bentuk diagram alir untuk mengekspresikan protein NSP16
dengan memperhatikan point berikut.
a. Apakah host yang akan dipakai oleh mahasiswa tersebut? Jelaskan!
b. Bagaimana cara isolasi protein NSP 16 setelah diekspresikan.
2. Tuliskan desain primer yang digunakan untuk insersi nsp16 ke dalam vektor ekspresi.
3. Gambarkan peta vektor ekspresi yang digunakan oleh anda.
4. Enzim restriksi apakah yang dipakai? Jelaskan alasannya dan gambarkan simulasi hasil
pemotongannya.
5. Gambarkan peta plasmid rekombinan yang akan diperoleh setelah diinsersikan oleh
nsp16.
6. Bagaimana cara mengecek ligasi yang dilakukan berhasil atau tidak? Tunjukkan dengan
analisa pemotongan restriksi.
7. Berapa ukuran protein rekombinan yang akan dihasilkan? Berapa nilai pI nya? Tuliskan
juga urutan asam amino protein rekombinan tersebut.
 ZICO DANIEL DESPEN SIHOMBING
10518049
TEKNIK DAN ANALISIS BIOMOLEKUL
Jawaban.
1.
ssRNA(+) SarsCov2

RT-PCR Primer

Gen NSP16 Vektor pET20B

Restriksi Restriksi

Ligasi

Plasmid Rekombinan

Host Escherichia coli BL21 Transformasi

Ekspresi

Isolasi Protein NSP16

Pemurnian

Protein NSP16

Gambar 1. Diagram alir ekspresi protein NSP16 SarsCov2

Keterangan :
: Input/output

: Proses

Dilakukan RT-PCR dikarenakan ssRNA yang diperoleh dari SarsCov2 memiliki orientasi
positif.
 ZICO DANIEL DESPEN SIHOMBING
10518049
TEKNIK DAN ANALISIS BIOMOLEKUL
a. Host yang akan dipakai oleh mahasiswa tersebut adalah Escherichia coli BL21. Hal
tersebut dikarenakan:
1) Pada Pichia pastoris, vektor yang tersedia hanyalah pPICZα yang mana pada vektor
tersebut terdapat sinyal peptida α yang memfasilitasi ekspresi protein secara
ekstraseluler sedangkan yang diinginkan ialah ekspresi gen secara intraseluler.
2) Pada Bacillus megaterium, terlihat di dalam manual vektornya tidak terdapatnya
His-Tag baik pada posisi N-terminal maupun C-terminal sehingga tidak dapat
digunakan pada kasus ini. Selain itu, Bacillus megaterium hanya dapat digunakan
untuk ekspresi secara ekstraseluler.
3) Pada Escherichia coli, seluruh keadaan pada kasus ini terpenuhi sehingga dapat
digunakan sebagai host untuk ekspresi protein NSP16 secara intraseluler.
Dengan menggunakan Escherichia coli BL21 sebagai host, terdapat 3 kemungkinan
vektor yang dapat digunakan dan tersedia di laboratorium yaitu pET16B, pET30a, dan
pET20b. Namun, yang dapat mahasiswa pakai hanya pET20b saja hal tersebut
dikarenakan:
1) Pada pET16B, posisi His-Tag berada pada posisi N-terminal sedangkan yang
diinginkan ialah pada posisi C-terminal.
2) Pada pET30a, posisi His-Tag berada pada kedua posisi baik N-terminal maupun C-
terminal.
3) Pada pET20b, posisi His-Tag hanya berada pada posisi C-terminal saja seperti yang
diinginkan peneliti di soal.
b. Untuk isolasi protein NSP16 setelah diekspresikan dapat dilakukan terlebih dahulu
penghancuran dinding sel dikarenakan ekspresi protein dihasilkan di dalam sitosol
atau periplasma. Setelah itu, dilakukan sentrifugasi sehingga dihasilkan residu dan
supernatan. Supernatan yang diperoleh diambil dan dimurnikan dengan His-Tag
dengan menggunakan kromatografi afinitas dengan basis nikel yang diamobilisasi
sehingga dihasilkan protein NSP16 yang telah murni.
2. Berikut ini dicantumkan primer PCR untuk isolasi gen NSP16 SarsCov2 pada Tabel 1.
Tabel 1. Primer PCR untuk isolasi gen NSP16 SarsCov2
Primer Urutan 5’-3’ Panjang Tm (OC) % GC
Forward gatatcTCTAGTCAAGCGTGGC 22 56 50
 ZICO DANIEL DESPEN SIHOMBING
10518049
TEKNIK DAN ANALISIS BIOMOLEKUL
Reverse gtcgacGTTGTTAACAAGAAC 21 53 43
Keterangan : Huruf kecil merupakan urutan nukleotida dari enzim restriksi EcoRV
pada forward primer dan SalI pada reverse primer.
Berdasarkan Tabel 1, dapat dilihat bahwa primer yang dipilih memenuhi syarat dimana
terdapat basa G atau C pada ujung 3’, nilai Tm yang berada pada rentang 52-60OC
(dengan perbedaan kurang dari 5OC), dan tidak adanya repeats dan runs. Hal ini dapat
diperkuat lagi dengan adanya analisis primer menggunakan Oligo Analyzer dimana
sepasang primer tersebut masih memungkinkan adanya annealing hanya saja nilai dG nya
masih lebih dari -5 kcal/mol (Gambar 2).

Gambar 2. Multiplex forward dan reverse primer

3. Berikut ini ditampilkan peta vektor ekspresi pET20b pada Gambar 3.
 ZICO DANIEL DESPEN SIHOMBING
10518049
TEKNIK DAN ANALISIS BIOMOLEKUL

Gambar 3. Peta vektor ekspresi pET20b

4. Berdasarkan Gambar 4, dapat dilihat bahwa seluruh enzim restriksi yang terdapat di
dalam laboratorium tidak akan memotong gen NSP16 SarsCov2 (ditandai dengan warna
merah). Namun, selain itu perlu juga dilihat daerah MCS peta vektor ekspresi pET20B
pada manual (Gambar 5). Berdasarkan hasil eliminasi dengan melihat Gambar 4 dan
Gambar 5 dapat dikatakan bahwa enzim restriksi yang hanya dapat digunakan ialah
XhoI, EcoRV, SalI, EcoRI, dan BamHI. Namun, jika dilihat dari sisi in frame hanya ada 3
enzim restriksi yang memenuhinya yaitu XhoI, EcoRV, dan SalI. Ketiga enzim tersebut
dapat digunakan karena tidak memotong gen NSP16 dan terdapat di dalam vektor
ekspresi. Sehingga, akan dicoba 2 enzim restriksi saja yaitu EcoRV pada posisi 5’ dan
SalI pada posisi 3’.
 ZICO DANIEL DESPEN SIHOMBING
10518049
TEKNIK DAN ANALISIS BIOMOLEKUL

Gambar 4. Enzim restriksi yang tidak memotong gen NSP16

Gambar 5. Enzim restriksi yang berada pada MCS vektor di manual

Berikut ini juga dicantumkan simulasi hasil pemotongan PCR NSP16 SarsCov2
(Gambar 6) dan vektor pET20b (Gambar 7).
 ZICO DANIEL DESPEN SIHOMBING
10518049
TEKNIK DAN ANALISIS BIOMOLEKUL

Gambar 6. Hasil restriksi gen NSP16 SarsCov2 setelah PCR

Gambar 7. Hasil restriksi vektor pET20b

5. Berikut ini dicantumkan peta plasmid rekombinan yang akan diperoleh setelah
diinsersikan oleh NSP16 pada Gambar 8. Gen NSP16 yang diinsersikan ditandai dengan
warna merah.

Gambar 8. Peta plasmid rekombinan

 ZICO DANIEL DESPEN SIHOMBING
10518049
TEKNIK DAN ANALISIS BIOMOLEKUL
6. Untuk mengecek ligasi yang dilakukan berhasil atau tidak dapat dilakukan analisis
restriksi maupun sekuensing. Dalam melakukan analisis restriksi dapat digunakan fitur
virtual cutter dengan cara memilih urutan hasil ligasi dan enzim restriksi yang digunakan.
Berdasarkan analisis restriksi diperoleh 2 fragmen yang akan muncul saat dielektroforesis
seperti tampak pada Gambar 9. Adanya kedua fragmen tersebut mengindikasikan bahwa
ligasi telah berhasil dilakukan.

Gambar 9. Analisis restriksi untuk validasi ligase

7. Ukuran protein rekombinan yang dihasilkan sebanyak 316 asam amino (35.36 kDa)
dengan pI sebesar 7.34. Berikut ini dicantumkan urutan asam amino protein rekombinan
yang dihasilkan seperti tampak pada Gambar 10.
MDISSQAWQPGVAMPNLYKMQRMLLEKCDLQNYGDSATLPKGIMMNVAKYTQLCQYLNTLTLAVPYNMRVIHFGAGSDK
GVAPGTAVLRQWLPTGTLLVDSDLNDFVSDADSTLIGDCATVHTANKWDLIISDMYDPKTKNVTKENDSKEGFFTYICG
FIQQKLALGGSVAIKITEHSWNADLYKLMGHFAWWTAFVTNVNASSSEAFLIGCNYLGKPREQIDGYVMHANYIFWRNT
NPIQLSSYSLFDMSKFPLKLRGTAVMSLKEGQINDMILSLLSKGRLIIRENNRVVISSDVLVNNVDKLAAALEHHHHHH
*

Gambar 10. Asam amino protein rekombinan