Terapi HSV
Terapi HSV
TINJAUAN PUSTAKA
Korespondensi: novi_s_h@yahoo.com
Diterima 21 Maret 2016; Disetujui 14 Agustus 2016
DOI: 10.23886/ejki.4.7114.204-10
Abstrak
Kemajuan ilmu biologi molekuler memberikan manfaat dalam bidang kedokteran untuk mengembangkan
terapi gen. Tujuan terapi gen adalah untuk memperbaiki kerusakan gen atau mengganti gen yang rusak
dengan gen yang normal. Pemindahan gen dilakukan dengan teknik transfeksi. Transfeksi merupakan
proses pemindahan asam nukleat baik menggunakan vektor virus (transduksi) atau menggunakan metode
nonviral yaitu zat kimia, lipid dan metode fisik. Vektor virus yang digunakan pada transduksi adalah
retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus (AAV) dan herpes simplex virus (HSV). Keberhasilan
transfeksi ditentukan oleh berbagai faktor yang dapat dapat dinilai dengan menggunakan reporter seperti
green fluorescence protein (GFP).
Kata Kunci: terapi gen, transfeksi non viral, transduksi, vektor virus
Abstract
The advancement of molecular biology provides benefit in the field of medicine to develop gene
therapy. The aim of gene therapy is to repair the genetic damage or to replace damaged gene with the
normal gene. Delivery of gene is carried out by transfection technique, a technique to transfer nucleic acid
into eukaryote cells either using viral vectors (known as transduction), and also using non viral method
such as chemical substance, lipid and physical method. Some of the viral vectors used in the transduction
are retrovirus, adenovirus, Adeno-associated virus (AAV) and Herpes Simplex Virus (HSV). The success of
transfection is determined by various factors which can be assessed using several reporters such as Green
Fluorescence Protein (GFP).
Key words: gene therapy, non viral transfection, transduction, viral vector.
204
Vol. 4, No. 3, Desember 2016 Metode Transfer Asam Nukleat
205
Novi Silvia Hardiany eJKI
panjang yang bergantung pada integrasi DNA yang kationik dari senyawa lipid berhubungan dengan fosfat
dipindahkan ke dalam kromosom. yang bermuatan negatif pada asam nukleat. Teknik
Kationik polimer sintetik lain yang telah liposom tersebut memberikan banyak keuntungan
digunakan untuk pemindahan DNA ke dalam seperti efisiensi transfer gen yang relatif cukup tinggi,
sel adalah polybrene, polyethyleneimine dan dapat mentransfeksi beberapa tipe sel yang resisten
dendrimers.8 Ko-presipitasi kalsium fosfat terhadap kalsium fosfat maupun DEAE dekstran,
merupakan teknik yang popular pada awal tahun dapat diaplikasikan untuk in vitro dan in vivo, berhasil
1970-an. Graham et al9 memeriksa berbagai kation mengirimkan DNA berbagai ukuran dari oligonukleotida
dan efek konsentrasi kation, konsentrasi fosfat dan terhadap kromosom ragi artifisial, dapat mengirimkan
pH terhadap transfeksi. Ko-presipitasi kalsium RNA serta dapat mengirimkan protein. Sel yang
fosfat digunakan secara luas karena komponennya ditransfeksi dengan teknik liposom dapat digunakan
mudah didapat dan tidak mahal, protokolnya untuk mempelajari ekspresi sementara maupun
mudah dikerjakan dan efektif untuk beragam tipe transfeksi jangka panjang yang bergantung pada
kultur sel. Protokol reaksi mencampurkan DNA integrasi DNA ke dalam kromosom atau episomal.
dengan kalsium klorida dalam larutan buffer fosfat, Tidak seperti metode DEAE-dekstran atau metode
kemudian campuran diinkubasi pada suhu ruang kimia kalsium fosfat, teknik pengiriman asam nukleat
sehingga terbentuk presipitasi. Presipitat akan dengan liposom dapat digunakan untuk transfer DNA
tersebar di dalam kultur sel yang akan diambil oleh in vivo dan RNA baik pada hewan maupun manusia.10
sel melalui endositosis atau fagositosis. Suatu lipid bermuatan positif pada pH fisiologis
Transfeksi dengan metode kalsium fosfat secara merupakan komponen lipid sintetis liposom yang
rutin digunakan baik untuk TS maupun untuk transfeksi dikembangkan untuk pengiriman gen. Lipid kationik
stabil berbagai tipe sel. Kalsium fosfat memberikan sering dicampur dengan lipid bermuatan netral seperti
perlindungan terhadap serangan nuklease serum dan L-dioleolyl fosfatidiletanolamin (DOPE) yang dapat
intraseluler namun, ko-presipitasi kalsium fosfat memiliki memperkuat kemampuan transfer gen lipid kationik.
variabilitas dan tidak cocok untuk transfeksi in vivo pada Bagian kationik molekul lipid bergabung dengan
hewan. Selain itu, perubahan pH yang kecil (±0.1) dapat muatan negatif asam nukleat, sehingga menghasilkan
menurunkan efikasi transfeksi dengan kalsium fosfat.9 kompleks asam nukleat-liposom yang kompak sebagai
akibat interaksi elektrostatis antara muatan negatif asam
Transfeksi dengan Lipid Kationik nukleat dan muatan positif dari lipid sintesis. Muatan
Istilah liposom mengacu pada suatu lipid lapis positif kompleks liposom/asam nukleat menghasilkan
ganda yang membentuk partikel koloid dalam medium efisiensi transfer lebih tinggi pada sel yang dikultur karena
air. Pada tahun 1980, liposom artifisial digunakan dekatnya hubungan kompleks dengan membran sel
untuk mengirimkan DNA ke dalam sel. Vehikulum yang bermuatan negatif. Kompleks liposom masuk ke
liposom pada tahap lanjut dikembangkan dari lipid dalam melalui endositosis atau fusi dengan membran
kationik sintetik oleh Felgner.10 Kelompok kepala plasma (Gambar 2).11
206
Vol. 4, No. 3, Desember 2016 Metode Transfer Asam Nukleat
Setelah internalisasi seluler, kompleks tampak inti, sedangkan RNA, protein atau oligonukleotida
dalam suatu endosom (Gambar 2) dan berada antisense yang dikirimkan melalui liposom bekerja
dalam inti. Sampai saat ini belum diketahui dengan di dalam sitoplasma.11
jelas bagaimana asam nukleat dilepaskan dari
endosom dan lisosom untuk melewati membran Metode Fisik
inti. DOPE dipertimbangkan sebagai lipid Metode fisik untuk transfer gen dikembangkan
fusogenik dan berperan melepaskan kompleks dan digunakan mulai awal tahun 1980. Mikroinjeksi
tersebut dari endosom dan untuk memfasilitasi langsung ke dalam sel yang dikultur atau inti
penyatuan membran sel luar dengan kompleks merupakan teknik efektif walaupun teknik tersebut sulit
asam nukleat/liposom. DNA harus masuk ke dalam karena menggunakan jarum halus untuk menyisipkan
asam nukleat ke dalam sel (Gambar 3).12
Gambar 3. Mikroinjeksi12
Metode mikroinjeksi telah digunakan untuk Metode fisik lainnya untuk transfer gen adalah
mengirim DNA ke dalam stem sel embrionik pengiriman partikel biolistik yang dikenal juga
yang digunakan untuk menghasilkan organisme sebagai particle bombardment yang mengandalkan
transgenik dan untuk memasukkan RNA antisense pengiriman asam nukleat dengan kecepatan tinggi
ke dalam C. elegans. Alat tersebut sangat mahal pada mikroproyektil terhadap sel resepien melalui
dan tekniknya perlu dikerjakan secara intensif, penetrasi membran. Metode tersebut berhasil
sehingga bukan merupakan metode yang tepat dikerjakan untuk mengirimkan asam nukleat pada
untuk penelitian menggunakan sejumlah besar sel sel yang dikultur juga pada sel in vivo.14
yang ditransfeksi.12
Elektroporasi pertama kali dilaporkan Transfeksi Viral (Transduksi)
untuk studi transfer gen pada sel tikus. Teknik Transfeksi menggunakan virus disebut
tersebut sering digunakan untuk tipe sel yang transduksi; merupakan metode yang paling umum
sulit ditransfeksi oleh metode lain seperti pada digunakan untuk uji klinik karena sangat efektif
protoplas tanaman. Mekanismenya berdasarkan dan mudah. Pada metode tersebut terjadi integrasi
penggunaan gelombang listrik untuk mengganggu virus dengan DNA genom host sehingga dihasilkan
membran sel dan membentuk lubang sementara ekspresi gen yang stabil (Gambar 4). Transduksi
yang menyebabkan masuknya asam nukleat memiliki kelemahan dalam imunogenitas dan
ke dalam sel. Teknik tersebut memerlukan sitotoksisitas. Pengiriman virus sebagi vektor dapat
penyelarasan dan optimasi durasi gelombang dan menyebabkan reaksi inflamasi pada sel dan dapat
kekuatan untuk setiap sel yang digunakan. Selain menyebabkan mutasi. Integrasi virus ke dalam
itu, elektroporasi sering memerlukan lebih banyak genom host secara acak mungkin dapat merusak
sel daripada metode kimia karena banyak sel tumor suppressor gen, mengaktifkan onkogen atau
yang mati dan optimasi yang cukup mahal sering mengganggu gen yang penting.15 Beberapa virus
diperlukan untuk menentukan efisiensi transfeksi yang digunakan sebagi vektor pada terapi gen
dan viabilitas sel.13 adalah retrovirus, adenovirus, AAV, dan HSV.
207
Novi Silvia Hardiany eJKI
208
Vol. 4, No. 3, Desember 2016 Metode Transfer Asam Nukleat
Aktivitas b-gal dapat juga diukur dalam lisat DNA 0,2-1mg/mL. Jumlah optimum DNA yang
sel menggunakan kolorimetri atau substrat digunakan untuk transfeksi bervariasi bergantung
chemiluminescent. pada tipe DNA, reagen transfeksi, target cell line
3. Luciferase. Suatu enzim yang ditemukan dan jumlah sel.
pada beberapa organisme, yang paling
popular adalah pada kunang-kunang. Optimasi Efisiensi Transfeksi10
Enzim tersebut mengkatalisis pembentukan Optimasi diperlukan untuk mendapatkan
cahaya melalui reaksi antara luciferin dan kondisi optimal agar tercapai efisiensi transfeksi
ATP. Pengukuran lusiferase sangat sensitif yang diinginkan. Indikator parameter yang perlu
sehingga enzim merupakan reporter yang dipertimbangkan adalah rasio muatan reagen
baik untuk menilai efisiensi transfeksi. transfeksi lipid kationik terhadap DNA, jumlah
4. Secreted alkaline phospatase (SEAP). SEAP asam nukleat yang ditranfeksikan, lama waktu
adalah enzim yang dimodifikasi dari plasenta sel dipaparkan dengan reagen transfeksi serta
manusia yang disekresikan sel mamalia ada atau tidaknya serum. Jumlah muatan positif
lipid kationik dari reagen transfeksi harus sama
Faktor yang Mempengaruhi Efisiensi Transfeksi19 atau melebihi muatan negatif fosfat pada DNA
Terdapat berbagai faktor yang mempengaruhi sehingga menghasilkan muatan netral atau positif
efisiensi transfeksi yaitu viabilitas sel, konfluensi, pada vesikel multilamelar yang berhubungan
jumlah pasase, kualitas dan kualitas DNA. dengan DNA.
Viabilitas sel bergantung pada mediun tempat sel Jumlah optimal DNA atau RNA bervariasi
ditumbuhkan dan lingkungan yang mendukung bergantung pada tipe asam nukleat, jumlah sel,
pertumbuhan tersebut. Sel harus ditumbuhkan ukuran sumur kultur dan target cell line yang
dalam medium yang cocok untuk sel tersebut digunakan. Sebagai contoh, sel HEK-293 optimal
dan perlu diberikan tambahan serum atau faktor ditransfeksi dengan 0,25μg vektor kontrol pGL3
pertumbuhan (growth factor) yang diperlukan untuk menggunakan reagen TransFast dengan rasio
viabilitas sel. Sel dan medium yang terkontaminasi, 2:1 dalam sumur plate 24. Sebaliknya, sel yang
misalnya kontaminasi ragi atau mikoplasma sama optimal ditransfeksi dengan 0.55 μg DNA
tidak dapat digunakan untuk transfeksi. Sel yang menggunakan reagen transfeksi Fu Gene HD
ditumbuhkan pada medium harus diletakkan di pada rasio 1:3. Dengan demikian untuk sel yang
dalam inkubator bersuhu 37◦C dengan persentase berbeda perlu dilakukan optimasi jumlah DNA.
suplai CO2 yang sesuai, biasanya 5–10%. Apabila konsentrasi DNA berada di bawah atau
Konfluensi sel harus diperhatikan agar di atas rata-rata maka efisiensi transfeksi akan
transfeksi berhasil yaitu pada saat sel mencapai menurun. Apabila jumlah DNA terlalu sedikit maka
40-80%. Jumlah sel yang terlalu sedikit sel tidak akan memberikan respon. Sedangkan
menyebabkan lambatnya pertumbuhan sel karena apabila jumlah DNA terlalu banyak maka kelebihan
tidak adanya kontak antarsel. Jumlah sel yang DNA tersebut akan bersifat toksik terhadap sel.
terlalu banyak dapat menghasilkan kontak inhibisi Reagen transfeksi harus kontak dengan sel
yang menyebabkan sel menjadi resisten untuk selama beberapa waktu, kemudian medium diganti
menerima DNA asing. Sel yang aktif melakukan untuk mengurangi efek toksik reagen transfeksi.
pembelahan mengambil DNA yang ditransfeksikan Waktu transfeksi yang optimal bergantung pada
lebih baik dibandingkan sel yang tidak membelah. tipe sel, reagen transfeksi dan asam nukleat
Pasase untuk transfeksi tidak boleh melebihi yang digunakan. Protokol transfeksi memerlukan
50 pasase. Pasase berulang dapat menyebabkan kondisi bebas serum untuk hasil yang optimal
sel tidak memberikan respons terhadap kondisi karena serum dapat berinteraksi dengan beberapa
transfeksi yang sama, sehingga menghasilkan reagen transfeksi sehingga mempengaruhi proses
ekspresi yang rendah. Selain itu, jumlah pasase transfeksi.
yang digunakan untuk berbagai macam percobaan
harus konsisten karena karakteristik sel dapat Kesimpulan
berubah menjadi sel yang immortal. Perkembangan biologi molekuler semakin
DNA plasmid untuk transfeksi harus bebas memudahkan peneliti untuk memanipulasi, gen
dari protein, RNA, kontaminasi mikroba dan salah satunya dengan transfeksi yang bermanfaat
kimiawi. Presipitasi DNA dilarutkan dalam air untuk pengembangan terapi gen. Pengiriman
steril atau buffer TE hingga mencapai konsentrasi DNA dan RNA dengan transfeksi dapat dilakukan
209
Novi Silvia Hardiany eJKI
menggunakan vektor virus, reagen kimia (seperti 10. Felgner, P.L. Lipofection: a highly efficient, lipid-
DEAE-dextran, kalsium fosfat, lipid kationik) atau mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl
metode fisik dengan mikroinjeksi, elektroporasi dan Acad. Sci USA. 1987;84:7413–7.
pengiriman partikel biolistrik. Keberhasilan transfeksi 11. Parker AL, Newman C, Briggs S, Seymour L,
Sheridan PJ. Nonviral gene delivery: techniques
dapat dinilai menggunakan reporter seperti green
and impilication for molecular medicine. Expert Rev
fluorescence protein (GFP). Keberhasilan transfeksi
Mol Med. [serial on the internet]. 2003 Sept 3;[cited
ditentukan oleh viabilitas sel, konfluensi dan jumlah 2010 December 4];5:[about 15 screens]. Diunduh
pasase sel yang akan ditransfeksi, serta kuantitas dari:http://www.expertreviews.org/.
dan kualitas DNA plasmid. 12. Cappechi MR. High efficiency transformation by
direct microinjection of DNA into cultured mammalian
Daftar Pustaka cells. Cell. 1980;22:479–88.
1. Misra S. Human gene therapy: a brief overview of 13. Stroh T, Erben U, Kuhl AA, Zeitz M, Siegmund B.
the genetic revolution. JAPI. 2013:61;127-33. Combined pulse electroporation – a novel strategy
2. Miller DA. Human gene therapy comes of age. for highly efficient transfection of human and mou
Nature. 1992:375;455-60. 14. se cells. Plos One, 2010 [serial on the internet].
3. Verna IM, Weitzman MD. Gene therapy: twenty-first Diunduh dari:http://www.plosone.org.
century medicine. Annu Rev Biochem. 2005:74;711-38. 15. Ye, GN, Daniell H, Sanford JC. Optimization of
4. Knoell DM, Yiu IM. Human gene therapy for delivery of foreign DNA into higher-plant chloroplasts.
hereditary disease. Am J Health Syst Pharma. Plant Mol Biol. 1990;15:809–19.
1998:55;899-904. 16. Patil PM, Chaudhari PD, Sahu M, Duragkar MJ.
5. Ginter EK. Gene therapy of hereditary disease. Vopr Review article on gene therapy. Int J Genetic.
Med Khim. 2000:46;265-78. 2012:4;74-9.
6. Kim TK, Eberwine JH. Mammalian cell transfection: 17. Wood NB. Lentiviral of transduction of NOD/
the present and the future. Anal Bioanal Chem. SCID repopulating cells results in multiple vector
2010;397:3173-8. integrations per transduced cell: risk of insertional
7. Transfection. Diunduh dari https://worldwide. mutation. Blood. 2003:101(4);1284-9.
promega.com/resources/product-guides-and- 18. Rochat T, Morris MA. Viral vector for gene therapy. J
selectors/protocols-and-applications-guide/ Aerosol Med. 2002:15;229-35.
transfection/. Tanggal 5 Feb 2016 19. Vorburger SA, Hunt KK. Adenoviral gene therapy.
8. Schenborn ET, Goiffon V. DEAE-dextran transfection The Oncologist. 2002:7;46-59.
of mammalian cultured cells. Meth Mol Biol. 20. Romoren K, Thu BJ, Bols NC, Evensen O.
2000;130:147–53. Transfection efficiency and cytotoxicity of cationic
9. Graham, F.L. and van der Eb, A.J. A new technique liposomes in salmonid cell lines of hepatocyte
for the assay of infectivity of human adenovirus 5 and macrophage origin. Biochim Biophys Acta.
DNA. Virology. 1973;52:456–67. 2004;1663:127-34.
210