Analisis Kuantitatif

Asam Amino & Peptida

Add Your Text

METODE BRADFORD

Add Your Text

METODE FeCl3

Add Your Text

METODE LOWRY
 Metode Bradford
Metode Bradford didasarkan pada pengikatan
secara langsung zat warna Coomassine Brilliant
Blue G250 (CBBG).
Reagen CBBG bebas berwarna merah-kecoklatan
(maks 465 nm), sedangkan dalam suasana asam
reagen CBBG akan berada dalam bentuk anion
yang akan mengikat protein membentuk warna
biru (maks 595 nm).
 Reagen
Coomassie Blue G250; sebanyak 100 mg
Coomassie Blue G250 dilarutkan dalam
50 mL etanol 95%. Larutan ini kemudian
dicampur dengan 100 mL asam fosfat
85%, diencerkan hingga 1 L dengan
akuades. Reagen kemudian disaring
dengan kertas Whatman No. 1 sebelum
disimpan pada suhu kamar. Reagen ini
stabil untuk beberapa minggu, meskipun
akan terjadi sedikit pengendapan.
 Prosedur
Ambil 100 L larutan (sampel/standard),
masukkan ke tabung.
Tambahkan 5 mL reagen, homogenkan. Hindari
terjadinya gelembung (busa).
Ukur absorbansi pada 595 nm terhadap blanko
(larutan PBS).
 Metode FeCl3
Kompleks asam tannat yang terjadi dapat bereaksi
dengan ion Ferri membentuk kompleks stabil berwarna
merah. Sebelumnya, kelebihan asam tannat harus
dihilangkan dengan pencucian menggunakan larutan
NaCl fisiologis.
Metode ini mempunyai kelebihan: cepat, mudah
dikerjakan, dan akurat. Metode ini bisa memiliki batas
deteksinya hingga 5 ug/mL, dan recovery 98-103%.
Interferensi yang bisa terjadi pada metode ini adalah
bila terdapat senyawa yang bisa membentuk kompleks
dengan ion Ferri.
 Reagen

Larutan NaCl 1.5 M

Asam Tannat 1 mM; dibuat dengan melarutkan
1.7 g asam tannat dalam akuades (yang
mengandung 1 g asam benzoat) hingga 1 L.
Larutan FeCl3 10 mM; dibuat dengan
melarutkan 1.625 g dalam pelarut air-
trietanolamin (1:1) hingga 1 L.
 Metode Lowry
Metode Lowry merupakan pengembangan dari
metode Biuret. Dalam metode ini terlibat 2 reaksi.
Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk
sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana
alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I).
Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100
kali) daripada metode Biuret sehingga memerlukan
sampel protein yang lebih sedikit. Batas deteksinya
berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/mL. Namun
metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat
kesensitifannya.
 Prosedur
Ambil 0.5 mL larutan (sampel protein/standard), masukkan
ke dalam tabung sentrifuse. Tambahkan 0.5 mL larutan NaCl
1.5 M dan 0.5 mL asam tannat 1 mM, vortex. Setelah 5
menit, lakukan sentrifugasi selama 10 menit pada 3000 rpm.
Dekantir supernatan, tuntaskan dengan membalikkan tabung
pada kertas saring.
Tambahkan 5 mL larutan NaCl pada endapan, vortex,
sentrifugasi, dan buang supernatan untuk memcuci endapan.
Tambahkan 2 mL air dan 0.5 mL reagen FeCl3 pada endapan,
vortex. Setelah 5 menit, ukur absorbansinya pada 510 nm
terhadap blanko (2 mL air + 0.5 mL FeCl3).
 Reagen
Reagen pembentuk kompleks: Siapkan segera sebelum digunakan campuran
dari ketiga larutan-larutan berikut dengan perbandingan 100:1:1
Larutan A: 2%b/v Na2CO3 dalam aquades
Larutan B: 1%b/v CuSO4.5H2O dalam akuades
Larutan C: 2%b/v Kalium Natrium tartrat dalam akuades
NaOH 2N
Reagen Folin-Ciocalteu 1N
Ke dalam labu alas bulat 1500 mL masukkan 100 g sodium tungstate, 25 g
sodium molibdate, 700 mL akuades, 50 mL asam phosphate, dan 100 mL HCl.
Campuran direfluks selama 10 jam, tambahkan 150 mL lithium sulfat, 50 mL
akuades dan beberapa tetes bromine (Br2).
Didihkan campuran (tanpa pendingin) sekitar 15 menit (hingga kelebihan
bromine habis). Dinginkan, encerkan dengan akuades hingga 1 L, saring (filtrat
berwarna kehijauan).
Sebelum digunakan, encerkan 1 bagian filtrat dengan 5 bagian akuades.
 Prosedur
Ambil 1 mL sampel atau standard, tambahkan 1 mL NaOH 2N.
Hidrolisis pada 100oC selama 10 menit pada penangas air.
Dinginkan pada suhu ruangan, tambahkan 5 mL reagen
pembentuk kompleks. Biarkan larutan selama 10 menit pada
suhu kamar.
Tambahkan 0.5 mL reagen Folin-Ciocalteu, homogenkan
dengan vortex, biarkan selam 30-60 menit (jangan sampai
lebih dari 60 menit)
Baca absorbansi pada 660 nm jika konsentrasi protein di
bawah 500 g/mL atau 550 nm jika konsentrasi protein antara
100 - 2000 g/mL.
 Contoh

Analisis Asam amino dalam Tepung

Ikan & Bungkil Kedelai
 Bahan Kimia yang
dibutuhkan
Larutan HCl 6 N dan 0,1 N
Larutan penyangga trisodium sitrat 2H2O dengan 3
variasi pH yaitu pH 3,25, pH 3,95, dan pH 6,4
Larutan litium asetat terdiri atas 168 g Li(OH)3, 600
ml asam asetat glasial, dan 400 ml air bebas ion
Larutan Ninhidrin
Larutan standar asam amino
Contoh tepung dan bungkil kedelai yang sudah
dikeringkan dalam freeze drier
 Tahapan Metode
Hidrolisis protein
Pengeringan hasil analisis
Penetapan asam amino
Sebanyak 100 l diinjeksikan pada alat Asam
amino Analyzer Beckman tipe CL 119 yang
menggunakan resin penukar ion.
Perhitungan
Diagram perubahan asam
Amino pada standar
Diagram hasil pemisahan asam Amino
pada contoh tepung ikan
Analisis MSG