Pengamatan

mikroorganisme dengan
pewarnaan dan tanpa
pewarnaan
• Pengamatan mikroorganisme dapat
dilakukan dengan dua cara :

• A. Pengamatan mikroorganisme hidup

• B. Pengamatan mikroorganisme dengan

pewarnaan
• A. Pengamatan mikroorganisme hidup

• Pengamatan mikroorganisme hidup

memberikan ciri-ciri yang membantu
dalam klasifikasi.

• Cara mikroorganisme memperoleh dan

mencerna makanan bahan makanan, serta
pergerakan hanya dapat dilihat sewaktu
mikroorganisme hidup
Bakteri dibagi menjadi kelompok yang
tidak bergerak (non motil) dan bergerak
(motil).

Kelompok bakteri yang tidak bergerak ini

dalam cairan terlihat bergerak setempat;
gerakan ini disebut gerakan brown.

Gerakan brown disebabkan benturan

molekul air dengan bakteri. Semakin kecil
ukuran bakteri makin kuat gerakan brown .
Bakteri yang berukuran besar jarang
memperlihatkan gerakan brown.
• Pergerakan aktif bakteri disebabkan
oleh flagella .

• Bakteri yang bergerak ini seakan-akan

terlihat seperti meluncur dengan
gerakan melenggak-lenggok atau
meloncat-loncat dalam cairan.

• Gerakan yang aktif ini menunjukan

bahwa bakteri mempunyai flagella.

• Pengamatan mikroorgansime hidup dapat

dilakukan dua cara yaitu :
1.Preparat Basah
• Ciri khasnya adalah hanya menggunakan
obyek glass biasa atau obyek glass
datar.

• Cara membuat preparat basah

• 1. Kaca objek dibersihkan dengan kapas
yang diberi alkohol
• 2. Pindahkan 2 mata ose suspensi biakan
ke atas kaca obyek .
• 3. Tutup kaca obyek dengan kaca
penutup atau cover glass
• 4. Periksa dengan pembesaran 10 x atau
45 kali.
• 2. Preparat tetes bergantung
• Dalam mempelajari morfologi mikroba
dapat digunakan preparat tetes
bergantung, preparat basah atau
preaparat yang diwarnai.

• Pada preparat tetes bergantung atau

preparat basah diamati mikroba yang
hidup, sedangkan pada preparat yang
diwarnai mikroba tersebut mati.
• Preparat tetes bergantung dan
preparat basah digunakan untuk
mengamati pergerakan mikroba.

• Preparat tetes bergantung

menggunakan obyek glass yang ada
cekungan ditengahnya sehingga
suspensi bakteri tidak cepat
mengering.
• Cara membuat preparat tetes
bergantung
• 1. Beri vaselin pada sudut-sudut kaca
penutup dengan tusuk gigi.
• 2. Letakkan 2 mata ose suspensi
biakan dibagian tengah kaca penutup
atau cover glass.
• 3. Kaca obyek diletakkan di atas kaca
penutup,kemudian balikkan dengan
cepat.
• 4. Preparat tetes bergantung
diperiksa dengan pembesaran 10 xdan
45 kali.
Gambar pembuatan preparat tetes bergantung
• B. Pengamatan mikroorganisme dengan
pewarnaan.

• Mikroorgansime sulit dilihat dengan

mikroskop cahaya karena tidak
mengadsorbsi atau membiaskan cahaya.

• Alasan inilah yang menyebabkan zat

warna digunakan untuk mewarnai
mikroorgansime atau latar belakangnya.
• Zat warna mengadsorbsi dan
membiaskan cahaya sehingga kontras
mikroorganisme dengan sekelilingnya
ditingkatkan.

• Penggunaan zat warna memungkinkan

pengamatan struktur sel seperti spora,
flagella, penataan bakteri dan bahan
inklusi yang ada dalam sel bakteri.
• Tujuan dari Pewarnaan :
1)Mempermudah melihat bentuk
bakteri
2)Melihat struktur luar dan kalau
memungkinkan struktur dalam
3)Melihat reaksi bakteri terhadap
pewarna yang diberikan sehingga
sifat-sifat fisik dan kimia yang ada
akan dapat diketahui.
4)Memperjelas ukuran jasad
• Zat warna yang bisa digunakan
untuk mewarnai bakteri adalah
zat warna biologi.

• Zat warna biologi adalah zat

warna yang memiliki gugus
kromofor dan gugus auxochrom.
Zat Warna yang digunakan dalam pewarnaan
ada dua kelompok :
1.Zat warna basa yaitu :
Zat warna basa mempunyai muatan pada
bagian kationnya dan lebih banyak digunakan
karena muatan negatif banyak ditemukan
pada dinding sel, membran plasma dan
sitoplasma sewaktu proses pewarnaan.
• misal : - Metilen Biru
- Kristal Violet
- Funchsin basa.
- Hijau malakit
2. Zat warna asam
Bagian yang berperan memberikan warna
pada muatan negatifnya.

Zat warna asam yang bermuatan negatif

lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme , tapi mewarnai latar
belakang sediaan pewarnaan.

Zat warna asam yang bermuatan negatif

tidak dapat berikatan dengan muatan negatif
yang terdapat pada sel bakteri.
• Contoh zat warna asam :
• -Eosin
• - merah kongo
• - sudan IV
• - Hitam sudan B
Faktor-faktor yang menentukan
keberhasilan didalam pewarnaan

1 . Fiksasi
Dilakukan sebelum zat warna digunakan
Fungsi :
a. Meletakan sel pada objek glass
b. Membunuh bakteri karena sel dalam
keadaan mati lebih mudah untuk diwarnai
daripada sel dalam keadaan hidup.
c. Melepaskan granular protein menjadi
gugus reaktif seperti NH3 akan bereaksi
dengan gugus oH dari zat warna.
d. Mencegah terjadinya otolisis sel yaitu proses
pecahnya sel yang disebabkan oleh enzim yang
ada di dalamnya.
E. Mengubah daya ikat zat warna

Fiksasi dapat dilakukan secara fisik dengan

pemanasan atau pengeringan secara dingin,
sedang secara kimia dengan penambahan sabun,
formalin, fenol dll.

2. Peluntur warna
Untuk menghilangkan warna sel yang telah
diwarnai senyawa ini digunakan untuk
menghasilkan keadaan yang kontras pada sel
mikroba sehingga dapat jelas dilihat di bawah
mikroskop.
Beberapa jenis peluntur antara lain :
a. peluntur zat warna asam seperti HNO3, HCl,
H2SO4 serta campuran asam-asam tersebut
dengan alkohol.

b peluntur zar warna basa seperti KOH, NaOH,

sabun dan garam-garam basa.

c. Peluntur zat warna lemah seperti alkohol, air,

minyak cengkeh, aseton dan gliserin.

D. Garam dari logam-logam berat seperti

AgNO3, CuSO4 dll

E. Garam-garam dari logam ringan.

.
3. Substrat
yang berhubungan dengan kandungan
utama sel yang terdiri dari karbohidrat,
protein, lemak dan sama nukleat. Zat
warna asam atau basa dapat bereaksi
dengan isi sel akan dipengaruhi oleh
kehadiran senyawa tersebut, apakah
menjadi cepat atau lambat.
4. Zat warna penutup
Yang diberikan pada akhir pewarnaan
dengan tujuan untuk memberikan warna
kontras pada sel mikroba yang diwarnai
yang tidak menyerap warna pertama
misal metilen biru, safranin, eritrosin dll.

Sesuai dengan jenis pewarnaan mikroba

ada 2 kelompok besar :
1. Pewarnaan negatif
2. Pewarnaan positif dibagi atas :
a. pewarnaan sederhana
b. pewarnaan diiferensial.
Pewarnaan negatif

yaitu pewarnaan yang dilakukan dengan

menggunakan zat warna yang molekul-
molekulnya lebih besar daripada sel pori-
pori sel bakteri.

Zat warna tidak akan mewarnai bakteri

akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar
bakteri dengan mikroskop mikroba akan
terlihat tidak bewarna dengan latar
belakang hitam.
Zat warna yang dipakai ialah nigrosin
/tinta cina. Pada metode ini preparat
tidak dipanaskan di atas api melainkan
dikeringkan di udara.

Cara pembuatan zat warna negatif:

Nigrosin (water soluble ) 10 g ditambah
dengan 100 ml air sulinbg, kemudian
dipanaskan di atas penangas air selama
½ jam kemudian ditambahkan 0.5 ml
formaldehid sebagai pengawet kemudian
disaring.
Pewarnaan positif
Ialah pewarnaan yang memakai zat
warna yang dapat bereaksi dengan
sel bakteri sehingga sel bakteri
berwana dan latar belakang tidak
bewarna (transparan).

Termasuk pewarnaan positif :

1. Pewarnaan sederhana
2. Pewarnaan differensial
1. Pewarnaan sederhana
Pada pewarnaan ini hanya menggunakan
satu macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara
mikroorgansime dan sekelilingnya.

Pewarnaan ini menggunakan zat warna

basa seperti kristal violet, biru metilen,
karbol fuksin basa, safranin atau hijau
malakit.

Ada juga menggunakan zat warna negatif

seperti nigrosin dan merah kongo
Prosedur pewarnaan sederhana mudah
dan cepat sehingga pewarnaan ini sering
digunakan untuk melihat bentuk, ukuran
dan penataan mikroorganisme.

Prosedur pewarnaan sederhana

1. Buat preparat ulas atau suspensi
bakteri.
2. Buat larutan zat warna contoh larutan
biru metilen atau karbol fuchsin basa.
3. Biarkan selama 30 detik
4.Cuci dan keringkan hati-hati dengan
kertas saring.
5.Periksa dengan mikroskop 100x
2. Pewarnaan differensial
- Menggunakan lebih dari 1 zat warna
- Membedakan sifat bakteri.
- Melihat bagian-bagian bakteri.
- Dapat digunakan untuk identifikasi
bakteri tahap awal
Prosedur pewarnaan sederhana mudah
dan cepat sehingga pewarnaan ini sering
digunakan untuk melihat bentuk, ukuran
dan penataan mikroorganisme.

Prosedur pewarnaan sederhana

1. Buat preparat ulas atau suspensi
bakteri.
2. Buat larutan zat warna contoh larutan
biru metilen atau karbol fuchsin basa.
3. Biarkan selama 30 detik
4.Cuci dan keringkan hati-hati dengan
kertas saring.
5.Periksa dengan mikroskop 100x
Macam-Macam Pewarnaan
Differensial

1.Pewarnaan Gram
2.Pewarnaan Bakteri tahan
asam
3.Pewarnaan Spora
4.Pewarnaan kapsul
5.Pewarnaan Flagella
Pewarnaan Gram

• Ditemukan Christian Gram (1884).

• Pewarnaan dasar dan rutin dalam
identifikasi bakteri lebih lanjut.
• Bakteri dibagi dua berdasarkan
reaksi zat warna terhadap dinding
sel bakteri yaitu :
- Gram positif berwarna ungu
- Gram negatif berwarna merah.
Tahap pewarnaan Gram
Warna Bakteri
Perlakuan Waktu
Gram + Gram -
Pembuatan preparat
Fiksasi di atas api
Kristal violet 1 menit ungu ungu
Cuci dengan air
Larutan lugol 1 menit ungu ungu

Cuci dengan air

dan keringkan ungu ungu
Peluntur warna
dengan alkohol 10- 20 detik ungu tidak bewarna
Cuci dengan air
dan keringkan ungu tidak bewarna
Prosedur pewarnaan gram :
1. Buat preparat ulas atau suspensi
bakteri.
2. Fiksasi di atas nyala api.
3. Beri larutan kristal violet selama 1
menit.
4. Cuci dengan air
5. Beri larutan lugol selama 1 menit.
6. Beri larutan peluntur atau pemucat
selama 10-20 detik . Perhatikan waktu
menggunakan peluntur warna yang terlalu
lama akan memberikan hasil pewarnaan
yang menyimpang.
6. Cuci dengan air
7. Beri safranin selama 15 detik.
8. Cuci dengan air, kemudian keringkan
dengan kertas saring.
9. Periksa dengan mikroskop 100 kali.

Fungsi larutan mordan adalah

1. Meningkatkan afinitas pengikatan zat
warna oleh bakteri sehingga pengikatan
zat warna oleh bakteri menjadi lebih baik.
2. Setelah penambahan larutan mordan zat
warna akan terlihat lebih jelas
3.Setelah penambahan larutan mordan
warna sulit dilarutkan. Contoh lugol
2. Pewarnaan tahan asam (Ziehl-Neelsen)
Adalah untuk memilah kelompok bakteri
Mycobacterium dan Nocardia.
Kelompok bakteri tahan asam karena
dapat mempertahankan zat warna pertama
(karbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan
larutan peluntur. Larutan pelunturnya
adalah mengandung asam dan alkohol
Prosedur pewarnaan tahan asam :
1. Tutup preparat ulas atau suspensi sampel
dengan sepotong kertas saring, kemudian
tambahkan larutan karbol fuchsin. Panaskan
preparat selama 5 menit sehingga terlihat uap .
Jangan biarkan preparat mengering.
2. Setelah preparat dingin, buang kertas saring,
kemudian cuci dengan air.
3. Cuci dengan alkohol asam selama 20 detik.
4. Cuci dengan air
5. Warnai dengan metilen biru selama 1 menit.
6. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas
saring.
7. Tahan asan bewarna merah dan tidak tahan
asam bewarna biru.
Pewarnaan spora
Yang sering digunakan cara Schaffer
fulton
Dengan pewarnaan spora dapat
dibedakan spora dengan sel vegetatif.
Pembuatan zat warna malasit hijau :
-Malasit hijau 5 g
-- air suling 100 ml
-- Dicampur dan disaring
Prosedur
1. Buat preparat setipis mungkin dari biakan
tuan (72 jam).
2. Keringkan dan fiksasi 3 kali di atas nyala
api tetesi dengan zat warna hijau malasit.
Panaskan sampai timbul uap selama 3
menit. Jika kering tambahkan lagi zat
warna dan bilas dengan air mengalir.
3. Warnai dengan safranin selama 1 menit,
bilas dengan air mengalir, keringkan dan
tetesi dengan minyak emersi. Spora
berwarna hijau dan sel vegetatif berwarna
merah.
Pewarnaan kapsul
Kapsul merupakan larutan yang melekat
diluar dinding sel yang terdiri dari
polisakarida atau polipepetida denagn tebal
1-2 μm dan la[isan kapsul dapat dilihat
dengan mikroskop cahaya setelah diwarnai
dengan kombinasi pewarnaan negatif dan
sederhana.
Prosedur
1. Ambil suspensi biakan murni sebanyak 5
atau 6 ose dan letakan pada objek glass
ratakan suspensi tersebut.
PEWARNAAN KAPSUL

2. Tetesi dengan asam cuka glasial

selama 10 detik.
3. Tetesi dengan larutan karbol fuchsin
di atas objek glass sambil dipegang
miring.
4. Cuci sisa-sisa cat karbol funchsin
dengan larutan garam fisiologi.
5. Tutup dengan cover glass dan diamati
di bawah mikroskop.
42
PEWARNAAN FLAGELLA
Flagella merupakan struktur yang sangat
tipis dan panjang; bakteri dapat bergerak
karena flagella. Ketebalan flagella 12 -30
nm sehingga sulit terlihat dengan
mikroskop cahaya.

Penataan flagella merupakan ciri bakteri

yang digunakan dalam identifikasi.
Penataan ini terlihat seperti atrikus,
monotrikus, lofotrikus, ampitrikus dan
peritrikus.
43
PEWARNAAN FLAGELLA
Untuk melihat flagella digunakan teknis
khusus. Penambahan bahan kimia
berupa larutan mordan digunakan untuk
membengkakkan flagella sehingga dapat
dilihat denagn mikroskop cahaya.
Sediaan dibuat dengan mengalirkan
suspensi di atas kaca objek dan
dibiarkan mengering di udara. Pencucian
dan pengeringan dengan kertas saring
juga dilakukan dengan hati-hati karena
flagella mudah terlepas dari sel vegetatif
44
PEWARNAAN FLAGELLA
Prosedur kerja :
1.Buatlah suspensi dari biakan bakteri.
Suspensi dibuat dengan hati-hati dengan
mencampurkan biakan dengan 0.5 ml NaCl
fisiologis.Suspensi jangan dikocok. Biarkan
suspensi selama 15 menit.
2.Sewaktur menunggu suspensi bakteri ,
siapkan larutan pewarna flagella. Campur 9
ml larutan mordan (5 ml kalium alum dan 2
ml asam tannat dan 2 ml HgCl2) dengan 0.8
ml larutan fuchsin basa. Saring campuran
larutan ini.
45
PEWARNAAN FLAGELLA
3. Bersihkan kaca objek dengan
menggunakan alkohol 95%, kemudian
lalukan di atas nyala api beberapa kali.
Tempatkan kaca objek ini pada pinggiran
bak pewarna, sehingga letak kaca objek
miring.
4. Alirkan 2 tetes suspensi bakteri. Biarkan
mengering di udara, preparat tidak boleh
difiksasi dengan api. Buat tiga preparat
untuk setiap biakan yang disediaakan.
5. Tempatkan preparat yang telah
dikeringkan di udara di atas rak
46
pewarnaan.
PEWARNAAN FLAGELLA
6.Tambahkan larutan pewarna flagella.
Biarkan larutan pewarna selama 5 menit
untuk preparat I, 10 menit untuk preparat
II dan 15 menit untuk preparat III. Cuci
preparat dengan aquadestilata, pencucian
dilakukan hati-hati dan sebentar. Preparat
dapat pula dicelupkan dalam
aquadestillata.
7. Tambahkan larutan kristal violet selama 1
menit. Cuci dengan aquadestilata;
pencucian dilakukan hati-hati dan cepat.
Keringkan dengan kertas saring;
pengeringan juga dilakukan dengan 47 hati-
PEWARNAAN FLAGELLA
8. Periksa dengan mikroskop

48
Pewarnaan negatif
 primary
stain

mordant

decolorization

counterstain

positive
negative
Kuman Gram positif Kuman Gram negatif
• Pewarnaan flagella