KELOMPOK 1

LATAR
Isolasi DNA

Isolasi DNA pertama kali dilakukan oleh ilmuwan asal Swiss bernama Friedrich
Miescher pada tahun 1869. Ia menemukan senyawa asam yang mengandung nitrogen
dan fosfat pada inti sel dari sel darah putih.
Senyawa ini diberi nama nuklein, namun pada tahun 1889 muridnya yaitu Richard
Altmann menamainya asam nukleat . Metode yang digunakan oleh Miescher adalah
alkalyne lysis untuk memecahkan sel dan mengisolasi DNA.

Menurut Wilson, Keith and John, (2010) Isolasi DNA merupakan

kegunaan DNA untuk dianalisa atau dimanipulasi yang harus diisolasi
terlebih dahulu dan murni kandungannya
 ISOLASI DNA
Prinsip dasar DNA/RNA dari jaringan adalah dengan
memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut
Prinsip isolasi DNA
sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri dari
DNA, RNA, dan substansi dasar lainnya

1. Pelisisan 2. Sentrifugasi 3. ekstraksi

untuk
untuk memisahkan
untuk memecah memisahkan hasil senyawa DNA dari
dinding dan lisisan (dinding protein, lipid dengan
membran sel sel, dan cara pengocokan
kloroform) dari
DNA dengan
kecepatan tertentu
Lanjutan......

4. Purifikasi 5. Sentrifugasi 6. Presipitasi

Untuk memurnikan untuk

DNA dari memisahkan untuk
kontaminan seperti senyawa DNA mengendapkan
senyawa sekunder DNA
dari
(fenol), polisakarida.
pengotornya
dengan
kecepatan
tertentu
 Metode Ekstraksi Organik
 Metode Membran Silika
 Metode Pemisahan Magnetik
 Metode Penukar Ion
 Metode Salting-out
 Metode Pemurnian CsCl
EKSTRAKSI
Tahap 1. Ekstraksi dengan pelarut organik
EKSTRAKSI
Tahap 2. Presipitasi DNA
MEMBRAN

Ekstraksi DNA dengan

metode silica
MEMBRAN
DNA berikatan dengan silica akibat adanya konsentrasi garam yang tinggi
 PEMISAHAN
 Metode ini didasarkan pada DNA yang mengikat secara
reversibel ke permukaan partikel magnetik, yang telah dilapisi
dengan antibodi pengikat DNA atau kelompok fungsional yang
berinteraksi spesifik dengan DNA.
 Setelah mengikat DNA, partikel dipisahkan dari komponen seluler
yang terkontaminasi lainnya, dicuci dan akhirnya DNA yang
dimurnikan dengan menggunakan ekstraksi etanol.
 Cara ini cepat dan bisa otomatis. Namun, bisa lebih mahal
daripada metodologi lainnya.
 PENUKAR
 Metode ini didasarkan pada interaksi spesifik antara fosfat
bermuatan negatif dari asam nukleat dan molekul permukaan
bermuatan positif pada substrat.
 DNA mengikat secara khusus ke substrat dengan adanya garam
rendah, kontaminan dihilangkan dengan langkah mencuci
menggunakan buffer garam rendah atau sedang, dan DNA yang
dimurnikan dielusi dengan menggunakan buffer garam tinggi.
 Teknologi ini lebih umum digunakan pada peralatan isolasi
plasmid.
PEMURNIAN
 DNA genom dapat dimurnikan dengan sentrifugasi dengan gradien
densitas cesium klorida (CsCl).
 Sel dilisis menggunakan deterjen, dan lisatnya diendapkan dengan
alkohol. DNA resuspended dicampur dengan CsCl dan etidium bromida
dan disentrifugasi selama beberapa jam.
 DNA dikumpulkan dari tabung sentrifugal, diekstraksi dengan isopropanol
untuk menghilangkan etidium bromida, dan kemudian diendapkan
dengan etanol untuk mengumpulkan DNA.
 Metode ini memungkinkan isolasi DNA berkualitas tinggi, namun
memakan waktu, membutuhkan tenaga kerja besar, dan mahal
(diperlukan ultracentrifuge), sehingga tidak sesuai untuk penggunaan
rutin.
 Metode ini menggunakan bahan kimia beracun dan juga tidak mungkin
untuk mengotomatisasi.
 SALTING-
Teknik konvensional lain dimana protein dan
kontaminan lainnya diendapkan dari lisat menggunakan garam
konsentrasi tinggi seperti kalium asetat atau amonium asetat.
 Endapan dipisahkan dengan sentrifugasi, dan DNA dikumpulkan
dengan pengendapan alkohol.
 Pengeluaran protein dan kontaminan lainnya dengan menggunakan
metode ini mungkin tidak efisien, dan pengolahan RNase, dialisis,
dan/atau pengendapan alkohol berulang seringkali diperlukan
sebelum DNA dapat digunakan dalam aplikasi downstream.
 Hasil dan kemurnian DNA sangat bervariasi dengan menggunakan
metode ini.
SALTING-
 Tahapan Elektroforesis
3
1 2

Pemasangan sisir pada Menuangkan larutan agarosa setelah permukaan gel

cetakan gel agarosa yang cair setelah pemanasan padat, sisir diangkat
4 5
6

menghidupkan mesin hasil dari

setelah ditambahkan dengan
elektroforesis dengan waktu, set elektroforesis
larutan TBE, masukkan DNA
sampel pada setiap sumuran voltase dan arah migrasi yang
telah ditetapkan
Elektroforesis Gel DNA
DNA merupakan molekul yang bersifat asam,
sehingga akan bergerak dari kutub negatif
(katoda) ke kutub positif (anoda). Pergerakan
DNA di dalam gel tergantung pada
berat/ukuran molekul DNA, bentuk
konformasi DNA, konsentrasi agarosa,
tegangan listrik yang digunakan dan kekuatan
bufer elektroforesis. Jenis bufer yang
digunakan untuk elektroforesis juga
mempengaruhi resolusi pemisahan DNA.
Bufer TAE (Tris-Acetate-EDTA) akan
menghasilkan resolusi yang lebih baik untuk
fragmen DNA yang berukuran lebih dari 4 kb,
sedangkan bufer TBE (Tris-Borate-EDTA) akan
menghasilkan resolusi yang lebih baik untuk
fragmen DNA berukuran 0,1–3 kb.
Elektroforesis Gel DNA

Hasil dari elektroforesis dapat

diamati dengan sinar ultraviolet,
yang nantinya akan tampak seperti
pita-pita pada gel. Pita-pita
tersebut adalah molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah
dielektroforesis.

hasil elektroforesis setelah diamati

dengan UV illuminator.