SUMBER MIKROBA

• Sumber alami : tanah, air, udara, tanaman/hewan, limbah, dll

• Lembaga koleksi kultur
 TAHAPAN IDENTIFIKASI MIKROBA

• Untuk
ISOLASI memperoleh
kultur murni

• Untuk
memperoleh
SELEKSI
galur dengan
kinerja terbaik

• Dengan menggunakan
metode yang sesuai
IDENTIFIKASI • Untuk mengetahui
nama (klasifikasi)
mikroba tersebut
 ISOLASI
• Isolasi kultur : kegiatan pemisahan suatu kultur mikroba dari
campuran biakan mikroba di alam  sel individu terpisah

• Sebelum mengisolasi, harus diketahui :

- mikroba apa yang akan diisolasi
- habitat
 menentukan sampel apa yang akan diambil dari alam , lokasi
dan media apa yang akan digunakan
 METODE PENGAMBILAN SAMPEL
Sampel berupa padatan (tanah, serpihan batu, kayu, dll) :
 Diambil dengan menggunakan spatula atau pinset steril
 Penyimpanan menggunakan kantong plastik steril

Sampel berupa cairan atau semi cair (air, lumpur, dll) :

 Diambil menggunakan pipet steril
 Penyimpanan contoh menggunakan botol atau tabung polipropilen steril

Sampel segera dibawa ke laboratorium

(bila jarak jauh, gunakan es batu pada wadah penyimpanan)

Sampel biasanya segera dipakai atau disimpan pada suhu dingin (kulkas)
 TEKNIK ISOLASI KULTUR MURNI
1. Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran (Spread-plate)
2. Penuangan (Pour-plate)
3. Kultur yang Diperkaya (Enrichment Culture)
4. Pengenceran Berseri (Serial-dilution)
5. Isolasi Sel Tunggal
 1. Teknik Penggoresan (Streak-plate) &
Penyebaran (Spread-plate)

Penggoresan /
Pengenceran Penyebaran KULTUR
berseri dengan pada media Penggoresan MURNI
SAMPEL
larutan garam agar  koloni berulang (1 SEL = 1
fisiologis tumbuh KOLONI)
menyebar
1. siapkan sampel homogen, kemudian encerkan dengan perbandingan 1 : 10 ( 10
gram/mL sampel diencerkan dengan 90 mL air steril, pengenceran 10 -1)
2. Siapkan agar petri dish steril

3. Siapkan api bunsen dan lakukan goresan pada agar petri (strake) dengan pola seperti
pada gambar berikut yaitu Q1, Q2 dan Q3.

4. Inkubasi plate dalam posisi terbalik pada suhu 37oC selama 24 jam.
Cara Penggoresan Kultur Goresan langsung Goresan radian (untuk
(untuk mengkultur mikroba) mengkultur mikroba)

1.Goresan Langsung
2.Goresan Kuadran
3.Goresan Radian

Goresan kuadran (isolasi koloni tunggal untuk

mempelajari mikroba)
http://www.studentsguide.in/microbiology/microbiology-tools-techniques/special-methods-of-isolation-of-pure-
culture.html
 Teknik Penyebaran (Spread-plate)
• Teknik ini merupakan
prosedur rutin untuk isolasi
bakteri & menggunakan
peralatan yang sederhana
• Kelemahan : hanya sejumlah
kecil sampel yang dapat
digunakan/disebarkan pada
media
• Dua sel dapat bergabung
membentuk satu koloni
http://www.studentsguide.in/microbiology/microbiology-tools-techniques/special-methods-of-
isolation-of-pure-culture.html
 2. Teknik Penuangan (Pour-plate)
• Prinsip : pengenceran sampel
dengan media agar cair dalam
tabung reaksi, sehingga
distribusi sampel merata 
dituang ke cawan petri &
dibiarkan mengeras pada suhu
ruang, lalu diinokulasi
3. Kultur Diperkaya (Enrichment Culture)
• Untuk mengisolasi bakteri yang mempunyai sifat fisiologis yang khusus
(jumlah kecil & tumbuh lambat)

• Prinsip : menggunakan komposisi media dan kondisi inkubasi tertentu,

sehingga yang tumbuh hanya bakteri tertentu
4. Teknik Pengenceran Berseri
(Serial-dilution)
• Digunakan jika mikroba
dlm kultur campuran
terdapat dalam jumlah
lebih besar dari pada
mikroba lain.
Contoh : S. lactis dalam
susu asam
• Dengan tingkat
pengenceran tinggi,
sampel hanya
mengandung 1 galur
mikroba
• Perlu dicek kemurnian
kultur
Metode langsung untuk pemisahan mikroba tersebut dilakukan dengan sistim pengenceran
(diluting factor) seperti terlihat pada gambar dibawah ini.
5. Teknik Isolasi Sel Tunggal
a. Metode Mikromanipulator
• Menggunakan alat mikromanipulator yang digabung dengan mikroskop
untuk mengambil suatu sel mikroba tunggal dari sampel
• Dengan mikromanipulator, operator dapat mengontrol gerakan mikropipet
(tabung kapiler) di bawah lensa obyek, sehingga dapat diambil sel tunggal
& dipindahkan ke dalam tabung dan selanjutnya dipindahkan ke media
yang sesuai
• Lebih cepat, namun kelemahannya :
- alat mahal
- operator harus terampil
Micromanipulator

http://eatingforaquadrillion.blogspot.com/2011/07/how-to-get-single-cell.html
b. Metode Kapiler

-Beberapa tetes media yang mengandung mikroba, ditempatkan pada

penutup gelas obyek steril menggunakan pipet kapiler steril.
-Dengan menggunakan mikroskop, cari tetesan yang mengandung hanya
1 mikroba. Tetesan tersebut dipindahkan dengan pipet kapiler steril ke
media segar  mikroba tunggal yang berada pada tetesan mulai berbiak
untuk menghasilkan kultur murni.
 PEMBUKTIAN KEMURNIAN KULTUR

Setelah diasumsikan berhasil mengisolasi kultur murni  perlu dilakukan

pengujian dengan kriteria sebagai berikut :

1.Mikroba tampak mirip secara mikroskopis dan menunjukkan hasil

pewarnaan yang sama
2.Pada saat ditanam pada agar cawan, semua koloni menunjukkan
kesamaan
3.Hasil penggoresan dll seragam
4.Beberapa koloni isolat mempunyai penampakan/karakteristik identik,
contoh memfermentasi gula yang sama dll
 SELEKSI
Tujuan : mendapatkan galur dengan kinerja terbaik
 - tidak menghasilkan produk sampingan yang tidak
dikehendaki
- peningkatan kemampuan penggunaan sumber C
dan N yang murah  penurunan biaya produksi
- perubahan morfologi sel menjadi bentuk yang
lebih mudah dipisahkan dari produk

Pendekatan genetika untuk memperbaiki kualitas mikroba :

1. Mutasi
2. Rekombinasi
 IDENTIFIKASI
Metode untuk identifikasi mikroba adalah dengan menggunakan ciri/karakteristik :
1. Morfologis
Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya flagela, kapsul atau spora
dengan bantuan mikroskop, baik dengan pewarnaan maupun tidak
2. Nutrisional
Penentuan senyawa kimia dan kondisi fisik khusus (suhu, cahaya, gas) yang
diperlukan untuk pertumbuhan mikroba
3. Kultural
Penentuan tampilan pertumbuhan pada berbagai macam media, baik cair maupun
padat (bentuk koloni, permukaan koloni, tepi koloni, warna, dll)
Karakteristik Morfologis

Aspergillus E. coli

Streptomyces Penicillium
Kultur campuran pada agar petri dish
Bentuk dan Susunan Sel

Sel
Bakteri

http://content.answers.com/main/content/img/elsevier/dental/f0396-02.jpg
Karakteristik Kultural

Kultur pada Agar Miring

Media fermentasi
Beberapa kriteria pemilihan media fermentasi adalah sebagai berikut :

1. Menghasilkan perolehan (yield) produk target yang maksimum per gram substrat yang digunakan.
2. Menghasilkan konsentrasi produk target yang maksimum
3. Menghasilkan kecepatan pembentukan produk yang maksimum
4. Menghasilkan perolehan (yield) yang minimum untuk produk yang tidak diinginkan
5. Murah, memiliki kualitas yang berkesinambungan dan tersedia sepanjang tahun.
6. Mudah dalam penanganan selama proses, terutama untuk pengadukan, aerasi, ekstraksi, pemurnian
produk dan penanganan limbah (Stanbury nand Whitaker, 1984).
• Media alami adalah media yang disusun oleh bahan-bahan
alami seperti kentang, tepung, daging, telur, ikan, umbi-
umbian dan sebagainya. Media alami yang paling banyak
dipergunakan adalah dalam bentuk kultur jaringan tanaman
ataupun hewan. Contohnya adalah telur untuk pertumbuhan
dan perkembangbiakan virus.
• Media sintetik yaitu media yang disusun oleh senyawa kimia,
contohnya media untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan
bakteri Clostridium.
• Media semi sintetik yaitu media yang tersusun oleh campuran
bahan-bahan alami dan bahan-bahan sintesis,
Media Sterilisasi
• Sterilisasi :
suatu proses dg metode ttt yg bertujuan mematikan semua organisme
hidup (vegetatif & non-vegetatif) –spora bakteri yg > resisten thd
desinfektan maupun panas
• Desinfeksi :
proses yang menggunakan suatu bahan (kimia)yg dpt membunuh
mikroorganisme patogen kecuali spora bakteri, virus & beberapa strain
bakteri resisten
persenyawaan kimia  desinfektan
desinfektan + sterilisasi  benda mati
• Antiseptik :
desinfektan non toksik, dipakai untuk kulit, mukosa atau jaringan hidup
lain
Sterilisasi
• Sebelumnya harus bersih dari debu dan kotoran yg
bercampur dengan kuman patogen

• Macam-macam sterilisasi :
1. Sterilisasi panas kering
2. Sterilisasi dengan panas uap
3. Sterilisasi dengan ultraviolet
4. Sterilisasi dengan sinar pengion
5. Sterilisasi dengan gas kimia
6. Sterilisasi dengan filtrasi
7. Sterilisasi dengan bahan kimia
Sterilisas Panas Kering
• Bahan termostabil, co : alat gelas, sediaan farmasi
(salep, serbuk dll)
• Instrumen logam --- tidak dianjurkan
• Waktu sterilisasi yg umum :
• 160 °C - (60-150) menit
• 170 °C - (20-30) menit
Sterilisasi dengan Panas Uap
• Sering digunakan karena :
• Mudah pelaksanaannya
• Diterapkan hampir 80% kebutuhan
• Biaya operasional rendah
• Hasil sterilisasi kering
• Proses waktu yg relatif pendek
• Temperatur dan waktu autoklave :
• 130 ° c wktu 2 mnt
• 121 ° c waktu 12 mnt
• 116 ° c waktu 30 mnt
• Ada 2 :
1. Gravity
2. Prevacuum (high vacuum)
Sterilisasi dengan Ultraviolet :
• Terdapat keterbatasan daya tembus maka
penggunaannya :
1. Sterilisasi udara (air hygiene)
2. Inaktivasi mikrg pada permukaan bahan at tersuspensi dlm
cairan
3. Untuk produk dlm komposisi yg tak stabil yg sulit disterilisasi
dg tata cara konvensional
• Efek max radiasi λ 265 nm
Sterilisasi Dengan Sinar Pengion
• Sinar beta Sterilisasi dingin
• Sinar gamma Temperatur kamar
• Paling ideal namun proteksi worker thd radiasi
lebih sulit dan lebih mahal
• Bahan ster. dlm btk wadah akhir
Sterilisasi dengan Gas Kimia
• Contoh : gas etilen dioksid, formaldehide, formalin
• Keuntungan :
• Temp rendah (bhn termolabil)
• Kemampuan penetrasi dan absorpsi etilen dioksid yg
tinggi pd bbrp jenis pembungkus (kertas, polietilen)
• Keuntungan gas formaldehide dibanding etilen
dioksid :
• Lebih murah
• Kurang berbahaya u/ intoksiskasi
• Tidak mudah meledak
• Kurang meninggalkan residu pd bahan yg disterilkan
Sterilisasi dengan Filtrasi
• Filter bakteri dibuat dari barmacam-macam bahan dan bentuk.
Ada beberapa macam atau tipe saringan yang sudah banyak
digunakan yaitu sebagai berikut.
• Saringan yang terbuat dari serat-serat abses yang dipres dan
dibentuk keping bulat. Saringan tersebut lebih dikenal dengan
nama Seitz Filter
• Saringan yang dibuat dari tanah Diatome (Berkefeld filter).
Filter ini seperti tabung kosong atau berbentuk lilin. Ukuran
yang terdapat pada filter Barkefeld ialah :
• W (dense) untuk yang berpori halus
• N (normal) untuk yang berpori sedang
• V (course) untuk yang berpori kasar
• Tipe-tipe filter yang dipergunakan dapat berbentuk filter selulosa atau
gelas porselen. Sedangkan cara penggunaan filter umumnya
dilakukan sebagai berikut:
• Filter yang dimaksud ditempatkan antara corong dan penghubung,
kemudian diikat.
• Alat filter kemudian ditempatkan di atas botol penampung hasil yang
dihubungkan dengan pompa hampa udara (pompa vakum).
• Larutan yang disaring ditempatkan pada corong, dan pompa vakum
dijalankan sehingga hasil saringan akan didapatkan pada botol
penampung.
Sterilisasi dengan Bahan Kimia
• Glutaraldehyd 2% dalam suasana basa
• Selama 20-30 menit
• Potensi bertahan sampai 14 hari
Desinfektan dan Antiseptik
Digunakan untuk membersihkan :
1. Tangan staf
2. Kulit dan selaput lendir px
3. Alat kesehatan
4. Permukaan yg keras (meja, almari, lantai,
dinding)

 Mencegah inos
Desinfektan
• Beberapa peralatan yang tidak kontak langsung
dengan px --- cukup desinfektan, co:
• kamar operasi, unit isolasi, stetoskop
• meja operasi
• Efektifitas desinfektan tergantung :
• pH
• type & jml mikroorganisma
• ada/tidak bahan organik pd benda ybs
• jangka waktu u/ membunuh mo
Beberapa penyebab inaktivasi desinfektan
 Pengenceran tidak tepat
 Air pengencer tercemar
 Tempat tidak sesuai (penutup gabus)
 pH tidak sesuai
 Digunakan untuk bahan yg tdk cocok
Penggolongan Desinfektan :
1. Gol. alkohol – alkohol 70%
2. Gol. phenol – lysol kreolon
3. Gol. chloro xylenol
4. Gol. chlorin aktif – hypochlorite dan na-dichloro
icocynaturat
5. Gol. senyawa amonium kwartener – DET
6. Gol. formaldehide konsentrasi 1 mg/l
Desinfektan yang Digunakan pada Fasilitas Kesehatan :
1. Alkohol
ethyl at isopropil alkohol (60-90%) u/ ampul, termometer dll
2. Gol. halogen
• chlirin – sod hypochlorit
• pd kons 125 ppm-10000 ppm
• iodophor
3. Glutaraldehyde 2%
4. Hydrogen peroxyde 3-6% u/ lantai
5. Formaldehyde
• u/desinfeksi ruangan pd kons 1 mg/l, at sterilisasi ruangan pd wadah
tertutup
6. Fenolic kons 0,3%-0,6%
• lysol – kreolon
• u/ desinfeksi linen, lantai ruangan
• tdk dianjurkan u/ alat karpet dan plastik krn absorpsi
7. Amonium quartenary
• u/ dinding permukaan logam – sifat sebagai detergent
Antiseptik
Belum ada antiseptik yang ideal, syaratnya :
1. Dapat menurunkan/mencegah penularan penyakit
2. Hipoalergenik menurun
3. Nyaman dipakai
4. Tidak berbahaya untuk dipakai
5. Menghemat waktu
6. Persistem
7. Murah
Macam Antiseptik
• Alkohol – etanol 70%
• Diguanide (chlorhexidine)
habitane-hibiserub & savlon
• Yodium dan yodofor
betadine, lar yodium dlm air
• Hexachlorophane
phisohex, dermisan
TERIMA KASIH