METODE DETEKSI

INFEKSI VIRUS

DISUSUN OLEH :
FLORENTINA A(P27903218012)
SITI MARYATI (P27903218031)
LATAR BELAKANG
• Identifikasi penyakit oleh virus dapat dilakukan untuk mengetahui
antibodi penyebab penyakit. Diagnosis laboratorium pada umumnya
dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu pemeriksaan langsung terhadap
materi klinis secara mikroskopik dan pewarnaan, Isolasi virus dan tes
serologi.
• Uji serologi dilakukan untuk mengidentifikasi virus guna menentukan
agen penyebab penyakit. Uji serologi juga dapat digunakan untuk
mengukur titer antibodi hewan pascavaksinasi. Disamping itu uji serologi
juga dapat digunakan untuk mengetahui munculnya penyakit baru
dengan menggunakan serum dan antigen standar.
Berikut ini adalah macam- macam pemeriksaan uji serologi yang dapat digunakan
untuk deteksi virus, diantaranya :

1 Haemaglutination Test (HA)

2 Haemaglutination Inhibition Test (HI)
3 Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA/EIA)
4 Nucleic Acid Amplification Test (NAAT/NAT)
 HAEMAGLUTINATION TEST
(HA)

• Uji hemaglutinasi (HA test) yang berfungsi untuk

mengetahui titer virus yaitu kemampuan virus dalam
menginfeksi yang ditandai dengan adanya hemaglutinasi
eritrosit. Prinsip metodenya adalah mencampurkan satu
sampai dua tetes virus dengan suspensi eritrosit. Uji
hemaglutinasi (HA/HI) digunakan khusus untuk virus-
virus yang memiliki protein hemaglutini pada amplopnya.
• Terjadinya hemaglutinasi ditandai dengan butiran
berpasir akibat adanya ikatan antara sel darah merah 1%
dengan protein hemaglutinin pada amplop virus.
 Bahan-bahan yang digunakan untuk melakukan Uji Hemaglutinasi, diantaranya :
 Larutan Alsever
 Phasphate Buffered Saline (PBS) bebas Ca+Mg
 Darah Ayam sebagai Serum
 Darah Ayam untuk Pembuatan Red Blood Cell (RBC) 1%
 Antigen Virus
CARA PENGERJAAN UJI HEMAGLUTINASI
YAITU :
• Sebanyak 25 µl larutan PBS diisi ke dalam plat mikro lubang 1-12.
• Lalu dimasukkan antigen (cairan allantois/ hasil panen virus setelah inokulasi) sebanyak 25 µl dari lubang
pertama, kemudian dihomogenkan.
• Campuran tersebut dipindahkan sebanyak 25 µl dari lubang pertama, ke lubang kedua, ke lubang ketiga, dan
seterusnya sampai lubang ke-11. Hal ini tidak dilakukan pada lubang ke-12.
• Kemudian, ditambahkan lagi larutan PBS sebanyak 25 µl ke dalam lubang 1-12.
• Setelah itu dimasukkan RBC 1% sebanyak 25 µl ke lubang nomor 1-12,dihomogenkan.
• Plat mikro selanjutnya dieramkan pada suhu kamar dan diamati timbulnya aglutinasi sel darah merah, kemudian
dibaca hasil uji HA tersebut.
• Hasil positif jika terjadi hemaglutinasi dan hasil negatif jika tidak terjadi hemaglutinasi. Titer virus ditentukan dari
pengenceran tertinggi yang masih mampu mengalutinasi sel darah merah 1%. Titer HA Antigen dinyatakan
dalam log2. Misalnya aglutinasi yang sempurna pada lubang ke 7 (27) berarti titer Ag stok 128 HA Unit.
 HAEMAGLUTINATION INHIBITION TEST
(HI)
• Uji Hambatan Hemaglutinasi (HI) digunakan untuk deteksi titer
antibodi. Uji HI dilakukan setelah diperoleh hasil positif pada
uji HA. Prinsip uji HI adalah hambatan aglutinasi RBC oleh virus
akibat terikatnya virus tersebut dengan antibodi spesifik. Oleh
karena itu uji HI hanya bisa digunakan untuk virus yang
mengaglutinasi RBC .
• Bila terdapat antibodi dalam jumlah mencukupi untuk
membentuk kompleks dengan virion, hemaglutinasi dihambat.
Sebaliknya bila antibodi terdapat dalam jumlah yang tidak
mencukupi maka eritrosit akan diaglutinasi oleh antigen.
• Aktivitas hemaglutinasi berlangsung maksimal selama satu jam
karena dipengaruhi oleh kerja enzim neuraminidase yang
merusak ikatan pada reseptor eritrosit dengan hemaglutinin
dari virus
Cara pengerjaan Uji HI yakni sebagai berikut :
• Sebanyak 25 µl larutan PBS diisi kedalam lubang plat 1-12.
• Kemudian dengan menggunakan single channel dimasukkan serum ke lubang 1 sebanyak 25 µl, didilusi
larutan pada lubang 1 sampai lubang 11.
• Pada lubang ke-12 ditambahkan PBS sebanyak 25 µl.
• Setelah itu ditambahkan antigen virus ke dalam 11 tabung pada plat masing-masing sebanyak 25 µl, dan
dihomogenkan dengan shaker rotator selama 3 menit.
• Lalu ditambahkan RBC 1% sebanyak 25 µl ke dalam 12 lubang, kemudian dihomogenkan dengan
menggunakan shaker rotator selama 3 menit.
• Didiamkan pada suhu kamar selama 40 menit, kemudian dibaca hasil uji HI tersebut.
• Hasil positif jika tidak terjadi hemaglutinasi dan hasil negatif jika terjadi hemaglutinasi. Pengamatan nilai
titer antibodi dari serum sampel berdasarkan hasil pengenceran terbesar yang masih sanggup menghambat
aglutinasi (RBC) oleh antigen.
Pembacaan dilakukan setelah lubang kontrol positif (menggunakan standar serum positif yang telah diketahui
titernya) atau lubang kontrol negatif yang berisi PBS dan RBC ayam yang mengendap/terjadi hemaglutinasi.
Keunggulan uji HA/HI yang a keunggulan yaitu biaya relatif murah, waktu pengerjaan uji lebih cepat, dengan
peralatan lebih sederhana, material mudah didapatkan dan dapat menggambarkan titer antibodi spesifik
ENZYM-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY
(ELISA/EIA)
Prinsip pemeriksaan ELISA berdasarkan perubahan
warna yang terjadi pada substrat pereaksi sesuai
dengan label atau imunoprob (immuno probe)
konjugat Ab-enzim. Perubahan warna terjadi akibat
hidrolisa enzimatik pada reaksi antara konjugat
Abenzim dengan substratnya, sehingga hasil ELISA
lebih peka dan dapat dikuantifikasi.
Uji ini dilakukan pada plate 96-well berbahan 
polistirena yang dilapisi antigen. Beberapa
komponen ELISA lainnya yaitu Ab, Ag, imunoprob,
substrat, reagen penghenti reaksi (blocking
reagent), bufer.
Berikut ini teknik pengerjaannya:
• Persiapan serum sampel yaitu serum sampel dimasukkan ke dalam diluent dengan perbandingan 1:100 ke dalam
tube 1,5 ml.
• Kontrol negatif, kontrol positif, dan serum sampel hasil dilusi sebanyak 100 μl dimasukkan ke dalam lubang
mikroplate.
• Diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar, di ruang gelap.
• Mikroplate dicuci dengan aquades yang telah ditambahkan bufer (perbandingan sesuai kit insert) sebanyak 3kali.
• Dimasukkan Conjugate sebanyak 100 μl pada semua mikroplate dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu
kamar.
• Mikroplate dicuci dengan aquades yang telah ditambahkan bufer (perbandingan sesuai kit insert) sebanyak 3kali.
• Substrat tetramethylbenzidine (TMB) sebanyak 100 μl dimasukkan ke dalam lubang kontrol negatif, kontrol
positif, dan sampel pada mikroplate dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar.
• Stop solution sebanyak 100 μl dimasukkan ke dalam semua mikroplate.
• Intensitas warna campuran diukur dengan spektrofotometer yang disebut ELISA reader hingga mendapatkan hasil
berupa densitas optis (OD). Dengan menghitung rata-rata kontrol negatif yang digunakan, didapatkan nilai cut-
off untuk menentukan hasil positif-negatif suatu sampel. Hasil OD yang berada di bawah nilai cut-off merupakan
hasil negatif, dan di atas cut-off  berarti positif.
 Keuntungan Metode ELISA
Prosedurnya cepat
Tidak memerlukan purifikasi sampel
Cukup spesifik karena antibodi monoklonal hanya
akan melekat pada antigennya.
Aman karena tidak menggunakan senyawa
radioaktif.
Kelemahan Metode ELISA
Menggunakan antibodi monoklonal yang mahal
dan sulit dicari.
Dapat terjadi kesalahan deteksi (false positive) bila
larutan blocking yang digunakan tidak efektif
karena dapat menyebabkan perlekatan non-
spesifik antara antigen maupun antar antibody.
Tidak sensitif untuk identifikasi virus pada window
period.
Reaksi antara enzim dan substrat di dalamnya
hanya terjadi dalam waktu cukup singkat sehingga
harus segera dibaca absorbansinya untuk
mendapatkan hasil.
NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TEST
(NAAT/NAT)

Nucleid Acid-based Testing merupakan teknik pemeriksaan biokimia dengan penambahan

bahan asam nukleat sebagai marker spesifik target yang digunakan untuk mendeteksi
virus. NAT dikembangkan melalui prinsip uji ELISA dan uji konfirmasi Western Blot (WB).
Prinsip kerja NAT DNA atau RNA virus diamplifikasi dengan bantuan enzim reverse
transkriptase untuk medeteksi DNA virus atau agen infeksi murni.
Teknologi Amplifikasi Asam Nukleat (NAT) diterapkan untuk skrining darah, mendeteksi
keberadaan asam nukleat virus berbentuk DNA atau RNA dalam darah. Saat ini NAT
menggunakan teknologi Polymerase Chain Reaction  (PCR).
 Polymerase Chain Reaction
(PCR)

Adalah metode enzimatis

untuk melipatgandakan
(amplification) secara
eksponensial suatu sekuen
nukleotida tertentu secara
in vitro Proses yang terjadi selama
PCR :
• Denaturasi DNA templat
Komponen- komponen dalam PCR • Penempelan primer pada
yaitu : templat (annealing
• DNA template primer)
• DNA polimerase (Taq • Pemanjangan primer
polimerase) (extension primer)
• Primers
• Magnesium chloride (MgCl2)2)
• Deoxynucleotide triphospatase
(dNTPs)
• Larutan buffer
Keunggulan metode ini
prosesnya cepat sehingga
dapat mengurangi
kemungkinan meningkatnya
transmisi infeksi yang dapat
terlambat karena pemeriksaan
yang tidak sensitif untuk Kekurangan NAT adalah
mendeteksi virus diperlukannya teknologi PCR
pada periode jendela. Namun,  untuk melakukan amplifikasi
selain memiliki kelebihan asam nukleat. Teknik ini juga
dalam hal keakuratan dan memerlukan tenaga ahli yang
kecepatan deteksi infeksi. berpengalaman dan
laboratorium yang memadai
 KESIMPULAN

Infeksi virus mencetuskan respons imun terhadap satu antigen virus atau lebih. Baik respons imun selular
maupun humoral biasanya timbul sehingga pengukuran terhadap salah satunya dapat digunakan untuk
menegakkan diagnosis infeksi virus, misalnya dengan uji serologi. Uji serologi dilakukan untuk
mengidentifikasi virus guna menentukan agen penyebab penyakit diantaranya dengan metode
Haemaglutination Test (HA), Haemaglutination Inhibition Test (HI), Enzym-Linked Immunosorbent Assay
(ELISA/EIA), Nucleic Acid Amplification Test (NAAT/NAT). Setiap metode memiliki kekurangan dan kelebihan
yang dapat digunakan sesuai kebutuhan dalam proses identifikasi virus.
SEKIAN
DAN TERIMAKASIH