PENGECATAN

MIKROBA
NUR’AIN MARTON ANGIO
432419001
DEFINISI PENGECATAN MIKROBA
Pengecatan atau pewarnaan merupakan salah satu
cara untuk mengamati sel;sel bakteri. Untuk
membedakan berbagai macam tipe morfologi bakteri
(kokus,basil spirilim,dan sebagainya) dapat di
gunakan pewarnanaan sederhana
TUJUAN PENGECATAN MIKROBA

• Mempermudah melihat mikroba dengan mikroskop

• Memperjelas ukuran dan bentuk mikroba
• Melihat struktur luar dan struktur dalm bakteri,seperti dinding sel
dan vakuola
• Menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia khas dari bakteri denganzat
warna
TUJUAN FIKSASI

• Menghentikan proses metabolisme secara cepat

• Mencegah kerusakan jaringan
• Mengawetkan komppnen-komponen sitologis dan histologis
• Mengeraskan materi-materi yang lembek sehingga akan terjadi koagulasi protoplasma
• Dapat membunuh bakteri sacara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan-perubahan
bentuk atau strukturnya
• Melekatkan bakteri di gelas benda
PROSEDUR PEMBUATAN SEDIAAN MIKROBA

A. Media cair digunakan untuk pembenihan diperkaya sebelum

disebarke media padat, tidak cocok untuk isolasi mikroba dan
tidak dapat dipakai untuk mempelajari koloni kuman. Contoh
media cair Nutrient broth (NB); Pepton dilution fluid (PDF);
Lactose Broth (LB); Mac Conkey Broth (MCB), dan lain-lain.
Pepton merupakan protein yang diperoleh dari peruraian enzim
hidrolitik seperti pepsin, tripsin, papain. Pepton mengandung
Nitrogen dan bersifat sebagai larutan penyangga, beberapa kuman
dapat tumbuh dalam larutan pepton 4%
PROSEDUR PEMBUATAN SEDIAAN
MIKROBA (CAIR)

A. ALAT B. BAHAN
Cawan petri Pepton Dilution Fluid (PDF)
Erlenmeyer Mc Conkey Broth (MCB)
Gelas ukur Aquades
Tabung reaksi
Pipet
Tip pipet
Batang pengaduk
Penangas air/pemanas
PROSEDUR PEMBUATAN SEDIAAN MIKROBA
(CAIR)
1. Timbang media sesuai prosedur di kemasan. (Catatan : Buatlah media sesuai kebutuhan
masing-masing/sesuai instruksi dari Dosen/Penanggung jawab praktikum).
2. Serbuk media dimasukkan secara hati-hati ke dalam erlenmeyer.
3. Tambahkan aquades dan aduk sampai merata dengan batangpengaduk
4. Untuk media yang perlu dipanaskan, gunakan pemanas sampai media tercampur homogen
(kuning dan jernih), hati-hati jangan sampai media mendidih dan meluap, panaskan dengan
hati-hati menggunakan penangas/elemen
5. Untuk media cair (PDF dan MCB) masukkan sejumlah 9 ml ke dalam tabung reaksi, PDF
sebanyak 10 tabung, dan MCB sebanyak 30 tabung.
6. Tutup erlenmeyer dan tabung reaksi yang berisi media dengan kapas penutup tabung.
7. Sterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210 C, tekanan 1 atm, selama 15 menit.
PROSEDUR PEMBUATAN SEDIAAN MIKROBA
( PADAT)

B. Media padat mengandung komposisi agar sebesar 15 %.Media

padat digunakan untuk mempelajari koloni kuman, untuk isolasi
dan untuk memperoleh biakan murni. Contoh media padat Nutrient
Agar (NA); Potato Detrose Agar (PDA); Plate Count Agar (PCA),
dan lain-lain. Berdasarkan tujuan penggunaannya media dibedakan menjadi :
Media isolasi Media yang mengandung unsur esensial yang dibutuhkan untuk
pertumbuhan mikroba.
Media diperkaya merupakan media yang mengandung bahan dasar untuk
pertumbuhan mikroba dan zat-zat tertentu yang ditambahkan seperti serum, kuning
telur, dan lain-lain.
PROSEDUR PEMBUATAN SEDIAAN
MIKROBA (CAIR)

A. ALAT B. BAHAN
Cawan petri Nutrien agar (NA)
Erlenmeyer Muller Hinton Agar (MHA)
Gelas ukur Plate Count Agar (PCA)
Tabung reaksi
Aquades
Pipet
Tip pipet
Batang pengaduk
Penangas air/pemanas
PROSEDUR PEMBUATAN SEDIAAN MIKROBA
(PADAT)

Timbang media sesuai prosedur di kemasan. (Catatan : Buatlah media sesuai kebutuhan masing-
masing/sesuai instruksi dari Dosen/Penanggung jawab praktikum).
Serbuk media dimasukkan secara hati-hati ke dalam erlenmeyer.
Tambahkan aquades dan aduk sampai merata dengan batangpengaduk
Untuk media yang perlu dipanaskan, gunakan pemanas sampai media tercampur homogen
(kuning dan jernih), hati-hati jangan sampai media mendidih dan meluap, panaskan dengan hati-
hati menggunakan penangas/elemen
Untuk pembuatan media agar miring NA, sebelum di autoklaf, tuangkan media NA untuk agar
miring sejumlah kurang lebih 5 ml ke dalam tabung reaksi. Agar miring ini aka digunakan untuk
kultur atau pembiakan bakteri. Sisa media NA biarkan dalam erlenmeyer.
Sterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210 C, tekanan 1 atm, selama 15 menit.
Untuk media NA miring, keluarkan kedia dari autoklaf dan bekukan dalam posisi miring
Untuk media NA dan MHA, tuangkan dalam cawan petri steril dan tunggu sampai beku.
 JENIS-JENIS
PEWARNAAN/PENGECATAN
PEWARNAAN SEDERHANA
PRINSIP PEWARNAAN SEDERHANA
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat warna dengan tujuan
hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya .
pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pasda umumnya antara lain kristal violet , metylen
blue , karbol , fuchsin , dan safranin
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana
karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan
bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaanpewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat
basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya
bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri.
Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan
karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.
PEWARNAAN SEDERHANA
Cara kerja :
BAHAN : 1. Bersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian di fiksasi
di atas bunsen
Bakteri Escherichia coli
2. Beri label pada bagian bawah preparat glass
Bakteri bacillus subtilis
3. Pijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan teteskan 3
Aquades ose aquades pada preparat glass menggunakan jarum ose
Methylen blue 4. Pijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media dengan cara
Tissue aseptik lalu diratakkan di atas preparat glass

Alkohol 5. Keringkan
6. Teteskan larutan zat warna methylen blue sebanyak 1 atau 2 tetes
7. Keringkan selama 1 menit
8. Cuci dengan air mengalir
9. Keringkan preparat dengan dianginkan, dan
10. Amati dibawah mikroskop karakteristik dan bentuk bakteri
PEWARNAAN SEDERHANA
INTERPRETASI DAN GAMBAR

Gambar di atas merupakan bakteri E. coli yang dilihat di bawah mikroskop cahaya dengan
pembesaran 40x. Berwarna Ungu . Bentuk E. coli tampak seperti batang (basil) pendek yang
membentuk koloni yang tersusun seperti rantai yang memanjang
PEWARNAAN GRAM
PRINSIP
Pewarnaan gram ini bertujuan untuk
mlihat bakteri bersifat gram positif
atau negatif dan bentuknya. Pewarnaan
Gram atau metode Gram adalah suatu
metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok
besar, yakni gram positif dan gram
negatif, berdasarkan sifat kimia dan
fisik dinding sel mereka.
BAHAN :
1. Bakteri Escherichia coli
2. Bakteri bacillus subtilis
3. Aquades
4. Gram A : Larutan hucker cristal violet
5. Gram B : Larutan mordan Lugols iodin
6. Gram C : Larutan peluntur
7. Gram D : Larutan safranin
8. Tissue
9. Alkohol
10. Air mengalir
PEWARNAAN GRAM

PROSEDUR Kerja :
1. Bersihkan glass preparat menggunakan tissu dan alkohol dan keringkan
2. Teteskan 3 ose aquades pada glass preparat
3. Letakkan bakteri diatas aquades tersebut secara aseptis
4. Keringkan dengan cara fiksasi
5. Tetesi gram A dan tunggu 1 menit
6. Setelah itu cuci dengan air mengalir dan keringkan kembali
7. Setelah kering tetesi dengan gram B dan tunggu 1 menit
8. Cuci dengan air mengalir dan keringkan
9. Tetesi dengan gram C dan tunggu 30 detik
10. Cuci dengan air mengalir dan keringkan
11. Tetesi dengan gram D dan tunggu 2 menit
12. Cuci dengan air mengalir dan keringkan
13. Amati dengan mikroskop
PEWARNAAN GRAM
INTERPRETASI DAN GAMBAR
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan
dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci
oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai
dengan safranin akan berwarna merah.
Bakteri gram positif memiliki selapis
dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal.
Setelah pewarnaan dengan kristal violet,
pori- pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding
sel tetap menahan warna biru
PEWARNAAN ZIEHL NEELSEN
P RI N S I P BAHAN

Pewarnaan tahan asam pada umumnya sering 1. karbol fuksin 0.3%

menggunakan pewarnaan Ziehl-Neelsen
2. alkohol 3%
dengan pewarna utama karbol fuksin dengan
pemanasan dan pewarna tandingan biru metilen 3. larutan metil biru 0.1%
Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti
dengan penggunaan pembasah yaitu kertas
pengering yang ditempel diatas preparat dan di
tetesi karbol fuksin yang fungsinya untuk
menjaga penetrasi supaya tidak pecah sehingga
selnya hanya terbuka pori-porinya saja.
PEWARNAAN ZIEHL NEELSEN
Prosedur :
1. Larutan karbol fuksin 0.3% dituang pada seluruh permukaan sediaan
2. Panaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih. Sediaan kemudian
dibiarkan dingin lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir
perlahan
3. Larutan alkohol 3% dituang pada pada sediaan dan dibiarkan beberapa menit kemudian dicuci
dengan air mengalir perlahan lalu kelebihan larutan dibuang
4. Larutan metil biru 0.1% dituang sampai menutupi permukaan sediaan dan dibiarkan selama
beberapa menit lalu kelebihan larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir secara perlahan
5. Amati apusan di bawah mikroskop, gambar serta beri keterangan.
PEWARNAAN ZIEHL NEELSEN
INTERPRETASI DAN GAMBAR

Pewarnaan Ziehl-Neelsen termasuk pewarnaan BTA

(bakteri tahan asam). Pewarnaan BTA dapat dibedakan
menjadi 2 golongan yaitu bakteri tahan asam yang akan
tetap mengikat zat pewarnaan primer (karbol fuksin)
dan tidak akan dilepas pada pencucian alkohol asam,
serta tidak akan mengikat zat warna sekunder (biru
metilen), sedangkan bakteri tidak tahan asam akan
melepaskan zat warna primer pada pencucian alkohol
asam dan akan mengikat zat warna sekunder.
PEWARNAAN NEISSER

Prinsip : Bahan
Prinsip pewarnaan 1. Pewarna neisser A
Pengecetan dengan Neisser A dan B 2. Pewarna neisser B
menyebabkan granula babes Ernst 3. Pewarna neisser C
(poolkarrel) berwarna violet hitam, cat
4. Sediaan kuman
Neisser C tidak berubah 4 (luntur), badan
bakteri akan terlunturkan oleh air yang
terdapat pada Neisser C sehingga mengambil
warna kuning atau coklat dari Neisser C.
PEWARNAAN NEISSER
Prosedur kerja:
Cara kerja pewarnaan granula dengan Metode Neisser ialah sebagai berikut :
a. Buatlah sediaan kuman pada gelas obyek, fiksasilah, dan tunggu sampai dingin.
b. Tuangkan Neisser A (biru metilen 0,1 g, alkohol 96% 2 ml, asam asetat pekat 5 ml, dan akuades 95 ml.) dan
Neisser B (kristal violet 1 g, alkohol 96% 10 ml, dan akuades 300 ml) pada sediaan kuman dan biarkan
selama 1 menit.
c. Buang sisa neisser A dan neisser B dari gelas obyek.
d. Tuangkan Neisser C(crysoidine 2 gram dan aquades (panas) 300 ml) pada sediaan dan biarkan selama 1,5
menit.
e. Buang sisa neisser C dari gelas obyek.
f. Keringkan dengan kertas pengering
PEWARNAAN NEISSER
INTERPRETASI DAN GAMBAR

Neisser A mengandung biru metilen,

alkohol 96%, asam pekat dan aquades.
Neisser B mengandung kristal violet,
alkohol 96%, dan aquades. Sedangkan
neisser C mengandung crysoidine dan
aquades. Pada metode neisser, granula
bakteri berwarna biru gelap atau biru hitam
(warna dari neisser A ditambah neisser B),
sedangkan sitoplasma bakteri berwarna
kuning kecoklatan (warna dari neisser C).
PEWARNAAN KAPSUL
Prinsip : BAHAN:
Pewarnaan diferensial merupakan teknik Bakteri Escherichia coli
pewarnaan yang menampilkan perbedaan di
Bakteri bacillus subtilis
antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel
mikroba. Teknik pewarnaan ini menggunakan tidak Aquades
hanya satu jenis larutan zat warna, berbeda Nigrosin / tinta india
dengan teknik pewarnaan sederhana (pewarnaan
Methylen blue
tunggal) yang hanya menggunakan satu jenis zat
warna saja. Pewarnaan diferensial banyak jenisnya, Tissue
antara lain ialah pewarnaan gram, pewarnaan Alkohol
spora, pewarnaan tahan asam, pewarnaan giemsa,
pewarnaan kapsul, dan pewarnaan flagel.
PEWARNAAN KAPSUL
Prosedur :

1. Bersihkan glass preparat menggunakan tissu dan alkohol

2. Beri label pada glass preparat bagian tepi bawah
3. Tetesi nigrosin pada bagian tepi
4. Letakkan masing – masing bakteri (e coli dan bacillus) di atas nigrosin dengan cara aseptik
5. Buat apusan satu arah menggunakan glass preparat lain yg telah dibersihkan
6. Keringkan dengan cara fiksasi
7. Tetesi dengan methylen blue dan diamkan selama 1 menit (keringkan dengan fiksasi)
8. Amati dengan mikroskop
PEWARNAAN KAPSUL
INTERPRETASI DAN GAMBAR
Hasil bakteri seperti yang terdapat pada
gambar ialah terdapat sel-sel bakteri yang
bewarna dan kapsul tampak kosong
disekitar tubuh bakteri (mengelilingi
bakteri), dan sekitar kapsul berwarna gelap.
Saat pengamatan bakteri ini relatif sukar
karena apabila methylen blue terlalu pekat,
maka akan mengganggu proses pengamatan
bakteri
PEWARNAAN FLAGEL
Prinsip : Bahan :
Prinsip pewarnaan flagella adalah membuat organel tersebut Basic fuchin 1 g
dapat dilihat dengan cara melapisinya dengan mordant dalam NaCl 1,5 g
jumlah yang cukup. Dua metode pewarnaan flagella, yaitu Asam tannin 2,5 g
metode Gray dan metode Leifson. Metode Gray digunakan
Alcohol 95% 3 ml
untuk mendapat hasil yang lebih baik dan mengena walaupun
Aquadest
dalam metode ini tidak dilakukan pencelupan yang khusus.
Pada pewarnaan flagella larutan kristal violet bertindak Suspensi bakteri
sebagai pewarna utama, sedangkan asam tannic dan Borax 1,0 g
alumunium kalium sulfat bertindak sebagai mordant. Kristal Methylen biru 0,1 g
violet akan membentuk endapan disekitar flagel, sehingga
meningkatkan ukuran nyata flagel.
PEWARNAAN FLAGEL
Prosedur :
Sediakan suspensasi bakteri dalam air sampai sedikit keruh
Satu tetes dari suspense di teteskan pada objek gelas sedemikian rupa sehingga tetesan mengalir
pada objek
Keringkan atau biarkan pada suhu kamar,kemudian bubuhi larutan pulas (basic fuchin 1 g, NaCl
1 stengah g, asam tannin 1 stengah g ) biarkan 10 menit
Cuci tangan dengan air ,bubuhi dengan borax methylene biru yang encer (1,0 g borax + 0,1 g
methylene biru dalam 100 ml aquadest) Biaran 10-15 menit
Cuci dengan air dengan keringkan dengan kertas saring,lihat dengan mikroskop
PEWARNAANFLAGEL
INTERPRETASI DAN GAMBAR

Flagel mampu mengikat zat

warna karena penggunaan
mordant, dan berwarna merah
ungu  lebih muda dan sel
vegetative akan berwarna
merah ungu apabila dilakukan
pengecetan flagel metode gray
PEWARNAAN SPORA
Prinsip
Menurut Volk & Wheeler, dalam pengamatan Bahan :
spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu yang
dapat menembus dinding tebal spora. Contoh dari
1. Biakan bakteri Bacillus subtilis
pewarnaan yang dimaksudkan adalah Volk & 2. Karbol Fuchsin
Wheeler tersebut adalah dengan penggunaan
3. 0,5 mL NaCl
larutan hijau malakit 5%, dan untuk memperjelas
pengamatan, sel vegetatif juga diwarnai dengan 4. Asam sulfat 1%
larutan safranin 0,5%, sehingga sel vegetatif ini 5. Metilen biru
berwarna merah. Dengan demikian ada atau
tidaknya spora dapat teramati, bahkan posisi
spora di dalam tubuh sel vegetatif juga dapat
diidentifikasi
PEWARNAAN SPORA
Prosedur kerja :
a. Dibuat suspensi bakteri Bacillus subtilis dalam 0,5 mL NaCl dalam tabung reaksi
b. Ditambah karbol fuchsin lalu dipanaskan di atas api
c. Dibuat preparat, dikeringkan, direkatkan
d. Direndam dalam asam sulfat 1%, dibilas dengan air kran
e. Dituang metilen biru, diamkan beberapa menit
f. Zat warna dibuang, dibilas, dan dikeringkan
g. Hasil pewarnaan diamati di bawah mikroskop
PEWARNAAN SPORA
INTERPRETASI DAN GAMBAR

Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan spora digunakan bakteri Bacillus
subtilis. Setelah dibuat suspensi bakteri lalau diinokulasikan di atas alas kaca
diberi larutan NaCl 0,85% lalu dipanaskan dengan tujuan memfiksasi bakteri.
Tujuan pemanasan tersebut yaitu untuk merangsang bakteri membentuk
endospora dan proses pembentukannya disebut sporulasi. Pemanasan juga
bertujuan agar zat warna yang telah diberikan mudah meresap ke dalam
dinding pelindung spora bakteri agar spora bakteri memiliki warna. Pada
pewarnaan spora diperoleh hasil yaitu, spora bakteri Bacillus subtilis berbentuk
sirkular, berwarna merah dan letak sporanya sentral
PEWARNAAN NEGATIF
Prinsip:
Tujuan pewarnaan negatif adalah untuk mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif
untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri
tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai,
seperti spirochaeta. Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme
kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras
dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang
sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat
nigrosin atau tinta cina.
PEWARNAAN NEGATIF

Bahan : Prosedur :
1. Bakteri Escherichia coli Bersihkan glass preparat menggunakan tissu dan alkohol
2. Bakteri bacillus subtilis 2. Beri label pada glass preparat bagian tepi bawah 3.
Tetesi nigrosin pada bagian tepi 4. Letakkan masing –
3. Aquades
masing bakteri (e coli dan bacillus) di atas nigrosin
4. Nigrosin / tinta india dengan cara aseptik 5. Buat apusan satu arah
5. Tissue menggunakan glass preparat lain yg telah dibersihkan 6.
6. Alkohol Keringkan dengan cara fiksasi 7. Amati menggunakan
mikroskop
PEWARNAAN NEGATIF
INTERPRETASI DAN GAMBAR

Pewarnaan negatif memerlukan pewarna

asam seperti eosin atau negrosin.pewarna
asam memiliki negatif charge
kromogen,tidak akan menembus atau
berpenetrasi ke dalam sel karena negative
charge pada permukaan bakteri. oleh karena
itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan
latar belakang berwarna.
TERIMA KASIH
NUR’AIN MARTON ANGIO
432419001