Histotehnik Dasar

TIM HISTOLOGI VETERINER 2019

Histoteknik adalah metoda membuat sajian
histologi dari spesimen tertentu melalui suatu
rangkaian proses hingga menjadi sajian yang siap
untuk dianalisis.
Sumber Jaringan:
1.Manusia
2.Hewan
1. Pengawetan (Fixation);
2. Dehidrasi (Dehydration);
3. Pembeningan (Clearing);
4. Pembenaman (Infiltration/Impregnation/Embedding);
5. Pengecoran (Blocking/Casting);
6. Pengirisan Jaringan (Sectioning);
7. Pewarnaan (Staining);
8. Perekatan (Mounting);
9. Pelabelan (Labelling)
Pengawetan

Pengawetan (fixation) dilakukan untuk

mempertahankan struktur sel dan jaringan
sedapat mungkin mendekati keadaan aslinya
(saat masih hidup)
Efek fiksasi terhadap jaringan yang diproses:
1. Menghambat proses pembusukan dan autolisis
2. Pengawetan jaringan
3. Pengerasan jaringan
4. Pemadatan koloid
5. Differensiasi optik
6. Pengaruh terhadap pewarnaan

Cara melakukan fiksasi:

1. Supravital/intravital;
2. Merendam dalam larutan fiksatif.
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam fiksasi
jaringan histologi adalah:
1.Tebal irisan.
2.Volume larutan pengawet.
3.Jenis larutan pengawet.
Kelompok Zat Pengawet
• Formaldehyde
– Formaldehyde (Formalin), Paraformaldehyde, Glutaraldehyde,
• Picrates
– Picric Acid  Bouin’s Solution
• Mercurials
– Helly ‘s Fluid (Zenker Formol)
• Oxidizing Agents
– Osmium tetroxide
• Alcohol
– Methanol, Alcohol (etanol)
• Potassium Dichromate
– Muller
JENIS CAIRAN FIKSATIF
• FORMALIN
• MULLER
• BOUIN
• CARNOY
• ZENKER FORMAL (CAIRAN HELLY)
• ETANOL
• ASAM ASETAT-ALKOHOL-FORMALIN
(TELLYESNICZKY)
• dll
 FORMALIN
• Yg digunakan adalah bentuk monomer: dibuat
dengan menetralkan/alkalis larutan
• Mengakibatkan crosslink protein
• Formal saline, formal calcium, 10% neutral
buffered formalin, buffer formalin sukrosa
• Kelebihan dan kekurangan
Human, 10% Formalin, HE 612x
BOUIN

• Mengandung asam pikrat, meledak kalau

kering
• Mudah dikenali saat pemotongan  warna
kuning
• Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan
merata
• Jaringan mengalami pengerutan
Rat, Bouin’s Solution,HE, Testis 400x
 Zenker Formol (Cairan Helly)
• Mengandung merkuri klorida
• Daya fiksasinya cepat dan kuat, tetapi kecepatan
penetrasinya berkurang setelah meresap sejauh
beberapa milimeter pertama dan potongan jaringan
yang melebihi ketebalan 5 mm pada umumnya
cenderung untuk menjadi keras (rapuh), overfixed di
bagian pinggir sementara di bagian tengah menjadi
lunak karena underfixed
• Fiksatif ini sangat baik untuk fiksasi sumsum tulang dan
limpa, mitochondria.
Rat, Helly Fluid, HE 162x
Etanol

• Cytological fixatives
• Etanol 95%
• Digunakan untuk Pap test, swab
• Mempertahankan antigenisitas  cocok IHC
LARUTAN CARNOY

• mengawetkan substansia Nissl dan glikogen

• daya penetrasi yang cepat
• Fiksasi ini sering digunakan apabila suatu diagnosis
perlu ditegakkan dengan cepat, misalnya untuk
diagnosis kanker pada saat pembedahan. Fiksasi
umumnya selesai setelah 1-2 jam,sedangkan
potongan kecil selesai difiksasi dalam 15 menit.
• efek pengerutan: kuat
Mus musculus, Carnoy, Liver
Pasca fiksasi, jaringan yang keras mendapat
perlakuan khusus
•Tulang: dekalsifikasi  formic acid 8%
•Kulit: teknik lendrum
• Cuci dengan air kran mengalir/alkohol 90%
• Fenol 4% dalam akuades (v/v) selama 1 -3 hari
Dehidrasi

Gangguan dalam keseimbangan cairan atau air

pada tubuh. Hal ini terjadi karena pengeluaran
air lebih banyak daripada pemasukan air
(misalnya minum). Gangguan kehilangan cairan
tubuh ini disertai dengan gangguan
keseimbangan zat elektrolit tubuh. ...
kekurangan natrium dan air.
10 tahapan dalam pembutan preparat rutin
• Pengawetan
• dehidrasi (pengeluaran air dari dalam sel/organ)
• pembeningan (clearing)
• pembenaman (embedding)
• pencetakan (blocking)
• pengirisan blok jaringan (sectioning)
• penempelan irisan pada kaca objek, pewarnaan (staining)
• penutupan preparat dengan kaca penutup (mounting)
• pelabelan preparat (labeling).
Tahapan Dehidrasi

• Cara I
– Alkohol 70% 3 hari ( 3x ganti)
– Alkohol 95% 3 hari ( 3x ganti)
– Alkohol 100% 3 hari ( 3x ganti)
• Cara II
– Alkohol 70%, 80%, 90%, masing-masing 1 hari;
– Alkohol 95% 2 hari ( 2x ganti);
– Alkohol 100 % 2 hari ( 2x ganti).
• Sukrosa 20% (untuk cryostat): Sukrosa 20% selama 2 hari;
• Metanol: jarang digunakan tetapi dapat digunakan seperti etanol;
• Aseton : 3 x 20 menit.
PEMBENINGAN (CLEARING)

Bahan yang digunakan :

– Cedar wood oil;
– Chloroform;
– Benzene/benzol;
– Benzyl benzoat;
– Methyl benzoat;
– Xylene/xylol;
– Toluene
Cedar Wood Oil

• Keuntungan
• Sifat clearing-nya paling baik.
• Tak mengeraskan jaringan
– Jaringan yang halus sangat baik.
– Kadang digunakan untuk jaringan keras (kulit dan
jaringan ikat padat)
• Dapat disimpan dalam waktu lama (berbulan-
bulan)
Chloroform

• Keuntungan :
– Paling sering dipakai
• Bersifat toleran (dapat disimpan semalaman tanpa
menjadi keras)
• Kerugian
– Titik akhir tak dapat dilihat dengan mata
• Saat menjadi bening dan transparan tak jelas
• Cara mengatasi : waktu pembeningan diperpanjang
– Lebih mahal dari xylene dan benzene tetapi lebih murah dari
cedar wood oil.
Benzyl Benzoate

Metoda
•Benzyl benzoat I selama 24 jam hingga jaringan
tenggelam. Jaringan menjadi bening dan
transparan.
•Benzyl benzoat II selama 2-3 jam.
•Benzol-Paraffin selama ½ - 1 jam. Campuran
benzol dan paraffin cair dengan perbandingan
sama.
•Masukkan ke dalam paraffin cair.
Methyl Benzoate

Metode
•Methyl benzoat I sampai jaringan tenggelam.
– Daya penetrasi lebih cepat dari benzol benzoat;
– Jaringan mudah rapuh.
•Methyl benzoat II selama 1-2 jam.
•Benzol-Paraffin. Campuran benzol dan paraffin dengan
perbandingan sama.
•Masukkan ke dalam paraffin cair.
Benzene dan Xylene

• Keuntungan
– Waktu clearing cepat : ½ - 1 jam.
– Benzene lebih lambat dari xylene tetapi kerapuhan jaringan lebih
berkurang dibanding xylene
• Kerugian
– Karsinogenik
• Metode
– Direndam dalam xylol 2 kali @ 1 menit hingga bening dan transparan
– Volume 50 – 1000 kali volume jaringan
– Setelah itu masukkan ke dalam paraffin cair
Toluene

• Sama dgn xylene tetapi lebih lambat

• Menimbulkan sedikit pengerasan dan distorsi
jaringan
• Mudah menguap
PEMBENAMAN
• Impregnasi adalah proses pengeluaran cairan pembening
(clearing agent) dari jaringan dan menggantikannya dengan
paraffin.
• Dilakukan dengan menggunakan paraffin oven
• Clearing agent yang tersisa dapat mengkristal dalam jaringan
sehingga saat dipotong dengan mikrotom jaringan akan robek.
• Teknik Pembenaman
– Paraffin/ paraplast I selama 2 jam;
– Paraffin/ paraplast II selama 1 jam;
– Paraffin/ paraplast III selama 2 jam.
• Setelah pembenaman, proses dilanjutkan dengan pengecoran
(blocking).
 PENGECORAN (BLOCKING/CASTING)

Alat Cetak
•Besi potongan berbentuk L (Leuckhart)
•Susun 2 buah potongan besi si atas lembaran logam sehingga membentuk ruang
kubus;
•Tuangkan sedikit paraffin cair di bagian pinggir agar tidak bocor;
•Letakkan jaringan sesuai dengan keinginan saat jaringan diiris;
•Tuangkan paraffin secukupnya agar menutupi jaringan seluruhnya;
•Hindarkan terbentuknya air bubble.
•Histoplate dari plastik (casette) dan piringan logam (mold).
•Spatula untuk melekatkan blok paraffin.
•Beri label identitas jaringan saat blocking.
PENGIRISAN JARINGAN (SECTIONING)
Persiapan

- Microtome knive vs Microtome blade (disposable)

Letakkan pisau pada mikrotom dengan sudut tertentu.
Rekatkan blok paraffin yang akan dipotong pada holder dengan
menggunakan spatula atau scalpel blade yang panas. Letakkan holder
berikut blok preparat pada tempatnya di mikrotom.
- Siapkan coated slides:
Albumin (putih telur);
Gelatin;
SuperFrost
Poly-L-Lysine
- Waterbath berisi air hangat 55oC;
- Sengkelit.
Teknik Pemotongan

• ketebalan + 5 – 10 m (disesuaikan kebutuhan)

• Atur jarak preparat yang dipegang oleh holder ke arah pisau
sedekat mungkin;
• Gerakkan rotor (putaran) pada mikrotom secara ritmis,
• Buang pita-pita paraffin awal yang tanpa jaringan;
• Setelah potongan mengenai jaringan, potong blok preparat
secara hati-hati;
• pindahkan secara hati-hati dengan sengkelit ke atas air di dalam
waterbath yang diatur pada suhu 55oC;
• Setelah pita paraffin terkembang dengan baik, tempelkan
paraffin ke kaca objek;
• Simpan kaca objek berisi potongan paraffin dan jaringan sampai
saatnya untuk diwarnai.
Pewarnaan (Staining)

Pertimbangan Pewarnaan

Unsur yang akan didemonstrasikan

– Pigmen pengganggu
• Mis: melanin → bleaching
Fixing fluid/fixatives
– Muller fluid → jaringan dicuci dgn air mengalir selama 24 jam
– Zenker → lugol’s iodine → larutan hypo
Jenis Pewarnaan
• Hematoxylin & Eosin (Rutin)
• Khusus
– PAS, PTAH, Impregnasi perak
– Sudan → lipid
• Sitologik
– Pap test
– Blood smear
– Swab mucosa
• Imunohistokimia
Hematoxylin dan Eosin

• Paling banyak digunakan → rutin

• HE dapat menunjukkan sebagian besar
struktur histologi
• Demonstrasi nuklei adalah penting
• Variasi dalam hasil
• Hematein (oxidized hematoxylin) adalah zat warna
• Nucleus mengandung RNA dan DNA (bersifat asam)
• Hematoxylin mewarnai nuclei
• Afinitas hematein thd nuclei adalah jelek bila tanpa mordant.
– Mordant adalah penghubung haematoxyllin dan DNA
– Logam: Al, Fe, tungsten, molybdenum, lead
– Tipe mordant mempengaruhi tipe jaringan yang terwarnai dan hasil akhir
pewarnaan
• Klasifikasi didasarkan jenis mordant yg digunakan
– Al; Iron; Tungsten haematoxyllin, etc & tanpa mordant
• Natural ripening vs artificial ripening
• Artificial ripening: penggunaan mordant (Al, Fe, atau Pb)
• Warna pertama adalah merah gelap, menjadi biru
(blueing) bila diperlakukan dgn alkali lemah (air kran
atau lithium carbonate)
• Methods are
– regressive
– Progressive causing pale nuclei or colour cytoplasm
– Counterstain (IHC)
 Hematoxylin
• Penggunaan
– Pewarnaan Nuclei
– Struktur selain nuclei
• Jenis formula hematoxylin untuk pewarnaan nuclei
1. Dellafield (1885)
2. Ehrlich (1886)
3. Heidenhains (1896)
4. Harris (1900)
5. Mayer (1903)
6. Weigert (1904)
7. Carazzi (1911)
8. Cole (1943)
Haematoxyllin Mixtures
• Connective tissue
– Mallory phosphotungstic acid haematoxyllin
• Elastic fibers
– Verhoeff’s method
• Myelin
– Kultschitzky
– Loyez
– Spielmeyer
– Weigert
• Copper and lead
– Mallory
– Parker
• Mucin
– Mayer’s mucihematein
PEWARNAAN (STAINING)

• Formula Hematoxylin Mayer

– Haematoxylin kristal 1 gr
– Akuades 1000 ml
– Sodium Iodate 0,2 gr
– Ammonium/potassium alum 50 gr
– Citric acid 1 gr
– Chloral hydrate 50 gr
• Cara pembuatan Hematoxylin Mayer
– Larutkan ammonium/potassium alum di dalam akuades.
– Tambahkan hematoxylin dan campurkan secara baik (aduk).
– Tambahkan sodium iodate, citric acid dan chloralhydrate.
– Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik.
– Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya.
 Eosin
• Zat warna xanthene
• Ikatan Van der Waals
• Paling cocok dikombinasikan dgn alum haematoxyllin
• Memiliki nilai kemampuan differensiasi sendiri untuk
membedakan antara sitoplasma dari tipe sel dan serabut
jaringan ikat yang berbeda
• Differensiasi terjadi selama dehidrasi oleh alkohol
• Jenis eosin
– Eosin Y (yellowish), water soluble
– Eosin B (Bluish)
– Ethyl Eosin (eosin S, eosin alkohol absolut)
 Eosin Y
• water soluble
• Paling banyak digunakan
• Zat warna asam sehingga berikatan dgn protein (basa)
• Dapat berpenetrasi pada struktur padat dan bersifat metakromatik
• Terdapat dalam 2 bentuk
– Monomer: merah
– Dimer : oranye-merah
• Hasil pewarnaan
– Sitoplasma: merah
– Eritrosit : oranye-merah
– Nukleus piknotik: ungu
– Nucleolus: merah
Eosin

• Formula Eosin
– Eosin-alkohol Stok 1%
– Eosin y ws 1 gr
– Distilled water 20 ml
– Larutkan dan tambahkan alkohol 95% 80 ml
• Working Eosin Solution
– Eosin-alkohol stok 1 bagian
– Alkohol 80% 3 bagian
– Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam asetat glasial
0,5 ml untuk setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik.
Mewarnai Preparat

• Deparafinisasi dengan xylol (2 x 2 menit);

• Hidrasi dengan alkohol 100% (2x2 menit) – 95% (2 menit) – 90%(2 menit) – 80% (2
menit) – 70% (2 menit) – air kran (3 menit);
• Jaringan yang difiksasi dengan larutan yang mengandung merkuri klorida
mengandung presipitat merkuri yang berwarna hitam. Deposit merkuri dapat
dihilangkan sebelum pewarnaan. Irisan diinkubasi dalam larutan iodine 0,5%
dalam etanol 70% selama 5 – 10 menit. Irisan dibilas dengan air lalu diinkubasi
dalam sodium thiosulphate 5% selama 5 menit dan dicuci dengan air kran
mengalir.
• Inkubasi dalam larutan hematoxylin Mayer selama beberapa menit;
• Cuci dalam air mengalir selama 15-20 menit;
• Observasi di bawah mikroskop, Counterstaining dengan eosin working solution
selama beberapa menit. Dehidrasi dalam serial alkohol dengan gradasi meningkat
• Inkubasi dalam xylol 2x2 menit.
• mounting dengan entelan/balsam kanada.
• labelling
Acid Alcohol Rinse

• Mengurangi warna biru hematoxyllin (to

differentiate nuclear staining)
• 0.25 % acid rinse
– Akuades 975 ml
– HCl 25 ml
• HCl 1% dalam alkohol 70% (v/v)
Blueing
• Air kran (yang alkalis)
– Jakarta: pH air kran adalah 7.8
• Lithium carbonate
– Lithium carbonate……………….... 0,5 gr
– Akuades……………………………… 1000 ml
– Campurkan dengan baik.