KROMATOGRA

FI
Niken Dyahariesti , S.Farm.Apt.M.Si
 PENGERTIAN

 Kromatografi diturunkan dari bahasa

Greek
Chromato : warna
Grafe : tulisan
 SEJARAH
 Runge,F.F ( 1834 -1843 ) melakukan spot test
campuran zat warna dari ekstrak-ekstrak tumbuhan
pada pita kain dan atau kertas.

 Goppel Scoeder,F (1868) menganalisa zat warna,

hidrokarbon, alkohol-alkohol, beer, milk pada minuman

dan air minum mengunakan kertas.

 Day DT ( 1897 – 1903 ) menggunakan kolom yang diisi
serbuk tanah untuk pemisahan.

Dengan perkembangannya nama KROMATOGRAFI

tidak sesuai lagi.
 Dasar pemisahan :
Perbedaan kecepatan migrasi komponen
( senyawa-senyawa )yang dibawa oleh fase
gerak dan ditahan secara selektif oleh fase
diam.

 Tujuan kromatografi
Pemisahan senyawa-senyawa dengan
waktu yang tidak lama.
 KEUNTUNGAN METODE
KROMATOGRAFI
 Kromatografi merupakan suatu proses berlipat ganda
Artinya : selama proses kromatografi terjadi banyak
terulang kali kontak adsorbsi dan partisi komponen yang
dipisahkan.
 Jangkauan analisis kuantitatif dan kualitatif sangat luas
dari kadar sangat tinggi sampai sangat rendah.
 Dapat dilakukan dengan mudah,cepat, perlu
operator yang berketrampilan baik,
berpangalaman, pengetahuan teori memadai.
 Biaya relatif murah dengan bahan yang
mudah didapat bahkan pelarut pengembangan
dapat dipakai beberapa kali.
 Ketelitian dan ketepatan yang memadai.
 PENGGOLONGAN
KROMATOGRAFI
 Atas dasar mekanisme pemisahan
1. Kromatografi Serapan.
2. Kromatografi Partisi .
3. Kromatografi Ekslusi.
4. Kromatografi Penukar ion.
5. Kromatografi Afinitas.
 BEBERAPA ISTILAH:
Fase Diam : Padatan atau cairan tempat untuk
menotolkan campuran zat yang akan dipisahkan
 Fase Gerak : Zat cair atau gas yang membawa
zat yang akan di-elusi-kan / didistribusikan dan
akan dipisahkan pada fase diam sehingga
masing-masing komponen dapat memisah
 Elusi : Proses terbawanya solut dari puncak
kolom sampai akhir kolom
 Apabila detektor ditempatkan pada ujung akhir
kolom, akan diperoleh signal yang digambarkan
sebagai fungsi waktu yang disebut kromatogram.
 Waktu retensi adalah waktu yang menunjukkan
puncak signal.
 Volume retensi adalah volume fase gerak yang
dibutuhkan untuk membawa pita solute dari titik
injeksi hingga melalui kolom.
 Atas dasar bentuk fase gerak :
1. Kromatografi gas ( fase geraknya : gas )
2. Kromatografi cairan
( fase geraknya : zat cair )

 Atas dasar bentuk fase diam :

1. Kromatografi Planar
a. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
b. Kromatografi kertas
2. Kromatografi Kolom
a. Kolom terbuka.
b. Kromatografi gas
c. KCKT
 MEKANISME PEMISAHAN
1. Unsur elektronegatif
2. Ikatan kovalen
3. Momen dipol
4. Polar dan non polar
5. Ekstraksi pelarut
6. Koefisien distribusi = koefisien partisi
Kd = D
7. Counter Current Craig Extraction
( pemisahan secara partisi )
Pelarut organik yg sering digunakan sebagai fase gerak
( deret eluotropik )
non polar Parafin cair
PE
Sikloheksana
Karbon tetraklorida
Benzena
Toluenea
Kloroform
Dietileter
Etilasetat
Aseton
n-propanol
etanol
asetonitril
methanol
 FASE DIAM
 SILIKA
Silika gel tanpa pengikat ( silika gel H dan N )
silika gel dengan pengikat ( silika gel G )
silika gel dengan pengikat dan zat berfluorosensi ( silika gel GF )
silika gel untuk kolom kromatografi (preparatif)

 Alumina

 Selulosa
 KROMATOGRAFI SERAPAN
Untuk memisahkan suatu campuran, kolom diisi dengan penyerap
zat padat seperti alumina sebagai fase tetap dan dialiri pelarut
(benzena) sebagai fase gerak.

Kmd sejumlah kecil cuplikan dari campuran dimasukkan melalui

sebelah atas kolom yang kemudian membentuk jalur-jalur serapan
senyawa.

Kecepatan bergerak dari suatu komponen tergantung pada

berapa besarnya zat terhambat / tertahan oleh zat penyerap di
dalam kolom.
 Pemisahan terjadi karena perbedaan laju
turun masing-masing komponen dalam kolom,
yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau
koefisien partisi antara fasa mobil dan fasa diam
(stationer).
 Elusi aliran fasa gerak terus menerus hingga
campuran terpisah sempurna menjadi
komponen-komponennya
Mekanisme pemisahan secara adsorbsi

 Jika lebih terikat pada fase diam

senyawa akan lebih lama terikat
 Jika lebih terikat fase gerak

senyawa akan terlarut

MEKANISME SECARA PARTISI

( HB) faseatas
Kd 
( HB) fasebawah
 jika Kd = 1 , berat Hb total = 1000 mg
Maka yang terlarut dalam air : 500 mg
dalam eter : 500 mg

( HB)eter
Kd 
( HB) air
( HB)eter
1
( HB) air

(HB) air = ( HB ) eter

 Pemisahan:

1. Penggojokan ke sekian kali

2. Terpisahnya senyawa – senyawa yang

mempunyai Kd berbeda
 kd  0,2

kd  1,0
kd  5,0

20 40 60

Jika lebih dari 1 senyawa dengan kd

berbeda-beda , semakin besar kd maka
perpindahan akan lebih cepat
 MEKANISME PEMISAHAN SECARA
EKSLUSI
 Prinsip : pemisahan kopomnen oleh gel didasarkan pada perbedaan ukuran
besar atau kecil molekul-molekul komponen
 Molekul-molekul ( larut ) , komponen kecil masuk dalam jaringan polimer
( gel ) sehingga gerakan dihambat . Sedangkan molekul besar tidak dapat

memasuki jaringan polimer dan keluar kolom lebih cepat dibawa fase gerak.
 Fase diam ( dalam kolom )
Gel ionik : berpori banyak dan sama rata ukuran bentuk.
misal : sephadex
Dibedakan 2 gel :
1. Gel Filtrasi : polimer sukrosa atau dextran yang
membengkak dalam air.
2. Gel permeasi : polimer membengkak dalam pelarut organik.
 Mekanisme Pemisahan
Penukaran ion
 Dasar pemisahan :
perbedaan kekuatan interaksi ion terlarut dengan resina
( fase diam ).
 Senyawa terlarut ( linarut ) yang berinteraksi lemah akan
keluar lebih cepat, dan senyawa yang berinteraksi kuat
akan ditahan lebih lama di dalam kolom, maka keluar
kemudian.
 Fase diam : resin buatan organik atau an organik.
Contoh : polistirena kation
polistirena anion
polidextran : pemisahan protein
 Fase gerak

contoh : air + anion

air + kation
 PEMISAHAN SECARA AFINITAS
 Prinsip : interaksi yang sangat spesifik antara solute dengan
molekul yang terikat secara kovalen pada fase diam.
 Memisahkan senyawa yang sangat spesifik.
 Contoh :
molekul antibodi terikat secara kovalen dengan fase diam . Jika
campuran berisi 500 protein yang dilewatkan kolom , hanya satu
protein yang bereaksi dengan antibodi yang terikat pada kolom.
 Setelah pencucian ( 500 – 1) protein keluar dari kolom .
 Protein yang diinginkan dilepaskan dari antibodi dengan
perubahan PH fase gerak atau kekuatan mengionkan fase
gerak.
 Contoh :
Mol Coplanar mempunyai ggs Cis-diol dapat dipisahkan
dari campuran kompleks ( nukleotida) dengan cara
melewatkan pada kolom dengan asam fenil buronat terikat.
 Nukleotida yang tidak ada gugus cis-diol akan
keluar
 sedangkan nukleotida dengan gugus cis-diol
akan ditahan . Setelah dielusi buffer sitrat
nukleotida cis diolakan keluar.
TERIMA
KASIH