BAHAN DAN METODE

1. Tanaman Varigata mutan P. aphrodite subsp. formosana (Orchidaceae)

merupakan tanaman induk asli yang penting digunakan untuk pembiakan
Phalaenopsis
2. Sepuluh individu mutan ini dikumpulkan dari ladang dan dibudidayakan di
Stasiun Penelitian dan Penyuluhan Pertanian Distrik Kaohsiung, Taiwan
3. Mikroskop Cahaya, dan Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)
4. Transmission Electron Microscopy (TEM)
 MIKROSKOP CAHAYA DAN MIKROSKOP
PEMINDAIAN LASER CONFOCAL (CLSM)
Cara kerja :

Diamati dengan mikroskop Atur panjang gelombang

Bagian sektor hijau cahaya (Leica DFC 480) dan
dan kuning diamati eksitasi dan emisi
mikroskop pemindaian laser masing-masing 633 dan
masing-masing confocal (CLSM) (Leica
individunya 640-700 nm
CTR 6500
 MIKROSKOP ELEKTRON TRANSMISI (TEM)

Daun dipotong
Ditambahakan Sampel ini dicampurkan campuran bahan-
kecil (1,0 mm
glutaraldehida 2,5% dan pada 1% OsO 4 dan 0,1 bahan ini lalu
× 1,0 mm)
bufer natrium fosfat 0,1 M natrium fosfat bufer tertanam di resin
diarea hijau
M (pH 7,3) dan biarkan selama 4 jam setelah Spurr (DER = 6.0)
dan kuning
semalaman suhu 4 ◦ C. dehidrasi seri etanol.
masing-masing
individu

Dipotong menjadi
bagian semi tipis Dipolimerisa
Diamati pada (1 µ m) dengan si pada 70 ◦
Sampel diwarnai
mikroskop cahaya Ultramicrotome C selama 12
dengan 1% toluidine
MTX (RMC, jam
(OLYMPUS BX- blue selama 2 menit
51, Tokyo, Jepang) Tucson, AZ,
Amerika Serikat)
MIKROSKOP ELEKTRON TRANSMISI (TEM)

diwarnai dengan 5%
Untuk pengamatan TEM Diamati menggunakan
uranyl asetat (dalam
lebih lanjut, dipotong TEM (JEOL JEM-
50% metanol) dan
bagian ultrathin (70 nm) 1400, Tokyo, Jepang
1% timbal sitrat
(dalam air)
 PERSIAPAN PROTEIN DAN ELEKTROFORESIS DUA
DIMENSI
Jaringan dasar dihomogenisasi selama 30
dibekukan detik dalam larutan yang mengandung 2,5 mL
Diambil jaringan dalam Tris (pH 8,8) -bahan fenol, 2,5 mL bufer Dipindahkan
daun varigata hijau nitrogen cair ekstraksi [0,1 M Tris-HCl (pH 8,8),1 mM ke tabung
dan kuning (1 g dari dan digiling EDTA, 1 µ g / mL leupeptin, 1 µ g / mL sentrifus 15
tiap daerah) di atas es. pepstatin, 1 mM benzamidine, dan 20 mM mL
DTT], dan a 25 µ Koktail penghambat
protease L (Sigma).

Dikocok di atas
es selama 30
menit
Lapisan bawah (fasa
Lapisan atas (fase
air) kemudian disentrifugasi
fenol)
Diinkubasi dicampur 2,5 mL fenol selama 30 menit
dikumpulkan
selama 5 menit berbahan Tris-bufer pada 6000 g jam
sebagai fraksi
di atas es (pH 8.8) dan bufer 4◦ C
fenol pertama
ekstraksi 2,5 mL
 PERSIAPAN PROTEIN DAN ELEKTROFORESIS DUA
DIMENSI

Campuran Digabungkan dengan larutan TCA /

disentrifugasi fasa fenol Disentrifugasi
aseton 10% volume tiga kali lipat
selama 10 dikumpulkan dan selama 10 menit
(aseton 90%, TCA 10%, DTT 20
menit pada digabungkan dengan pada 1000 g
mM) dan diinkubasi selama 1 jam,
6000 g di 4◦ C fraksi fenol pertama. disuhu 4◦C
suhu -20◦C

Endapan dihomogenisasi Aseton ditambahkan

dengan 100 µ L sampel untuk mencuci endapan
disentrifugasi
diinkubasi bufer [6 M urea, 2 M dan menghilangkan
selama 15-20 menit
selama 3 jam tiourea, 0,5% triton X-100, garam, sebanyak 3 kali
pada 20.000 g suhu
pada 37 ◦ C 10 mg / mL DTT dan 5 µ ulangan
4 ◦ C.
Buffer L IPG (pH 4–7)]
 PERSIAPAN PROTEIN DAN ELEKTROFORESIS DUA DIMENSI

Pemfokusan isoelektrik
(IEF) dilakukan pada gel
strip ReadyStrip IPG
(BioRad) 11-cm serta pada
gel Immobiline DryStrip
(GE Healthcare, Chalfont
St. Giles, Inggris Raya)
pada pH 4–7.
Strip dibiarkan untuk Protokol yang digunakan adalah 15
rehidrasi dalam Protein menit pada 250 V, 5 jam pada 4000
PROTEAN IEF Cell dipisahkan pada V, dan program akhir 12 jam pada
(BioRad) selama 12 pH 4–7 oleh IEF 50 V, 2 jam pada 100 V, 2 jam pada
jam pada 50 V 500 V, 2 jam pada 1000 V, 2 jam
pada 4000 V , dan 3 jam pada 8000
V, hingga total setidaknya 95.000
V tercapai

Strip IEF dicuci dengan air untuk

Diinkubasi menghilangkan minyak mineral dan
selama 15-20 Strip
kemudian ditempatkan ke dalam 2,5 mL Setelah
menit kemudian
kesetimbangan bu I [6 M urea, 375 mM pemfokusan, strip
ditahan pada
Tris-HCl (pH 8,8), 2% SDS, 20% gliserol, segera dibekukan
500 V.
2% ( w / v) DTT] suhu - 80 ◦ C.
 PERSIAPAN PROTEIN DAN ELEKTROFORESIS DUA
DIMENSI

Setiap strip disetimbangkan dalam 2,5 kemudian dioleskan ke sistem Ditutup dengan
mL kesetimbangan bu II er II [6 M elektroforesis gel natrium dodesil 1% agarosa
urea, 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 2% sulfat-poliakrilamida (SDS- mengandung
SDS, 20% gliserol, 2,5% (w / v) PAGE) 10% (Mini-P III; Bio- bromophenol
iodoacetamide] selama 15-20 menit Rad), blue.

Percobaan diulang tiga kali untuk

validasi, dan perbandingan ekspresi SDS-PAGE dilakukan pada 100
protein diuji dengan dua sampel t- V selama 90 menit setelah gel
pengujian dilakukan dengan SPSS diwarnai dengan Coomassie
V21.0. Blue
ANALISIS SPEKTROMETRI MASSA (MS)

1. Bintik protein dipilih dipotong dan protein dikurangi menggunakan 50 mM DTT

pada 37 ◦ C selama 1 jam.
2. Setelah supernatan dihilangkan, protein dialkilasi menggunakan 100 mM IAM
pada suhu kamar.
3. Setelah supernatan dikeluarkan, gel didehidrasi menggunakan asetonitril (ACN).
4. Setelah itu, gel dehidrasi diliofilisasi selama 5 menit dalam vakum untuk
menghilangkan ACN.
5. Potongan gel terliofilisasi direndam dalam 25 mM amonium bikarbonat dan
trypsin termodifikasi tingkat sekuensing ditambahkan pada rasio enzim / protein
1/20 (b / b),
6. kemudian campuran diinkubasi pada 37 ◦ C selama 16 jam.
7. Peptida triptik diekstraksi menggunakan 50% ACN dalam 1% asam trifluoroasetat
(TFA).
 ANALISIS SPEKTROMETRI MASSA (MS)

8. Campuran peptida yang dihasilkan dari hasil destruksi dalam gel dipisahkan menggunakan sistem
HPLC Kapiler (Waters), menggunakan 75 µ m id kapiler kolom yang dikemas dengan 5 µ m
partikel (MST, Taiwan).
9. Menghasilkan gradien dari 5 sampai 70% asetonitril yang mengandung 0,1% asam format selama
75 menit dengan laju aliran 300 nL /menit.
10. Peptida yang terpisah dianalisis pada spektrometer massa Q-TOF (Micromass, Inggris Raya) yang
dilengkapi dengan sumber nano ESI. Kisaran pemindaian adalah dari 400 hingga 1600 m / z untuk
MS dan 50 hingga 2000 m / z untuk MS / MS.
11. Data mentah MS / MS secara otomatis diproses menjadi file PKL dan file yang dihasilkan dicari
menggunakan mesin pencari Mascot v2.2. Parameter pencarian database diatur sebagai berikut: (1)
database protein ditetapkan sebagai NCBI; (2) taksonomi ditetapkan sebagai tumbuhan hijau; (3)
enzim ditetapkan sebagai tripsin; (4) satu belahan dada yang terlewat diizinkan; (5) prekursor dan
toleransi massa ion produk ditetapkan pada 0,1 dan 0,5 Da, masing-masing; (6) karbamidometil (C)
dipilih untuk modifikasi tetap; (7) oksidasi (M) dipilih untuk variable modifikasi; (8) protein
dengan skor di atas ambang signifikan ( p < 0,05) ditampilkan sebagai hit yang signifikan. Pukulan
dengan skor tertinggi dianggap sebagai protein yang teridentifikasi dari setiap tempat gel.
AMPLIFIKASI CEPAT BERAKHIR CDNA (RACE)
1. Untuk mengisolasi keduanya PsbO dan PsbP gen, primer yang terdegenerasi
dirancang secara terpisah untuk mengkloning fragmen DNA parsial P. aphrodite
menurut wilayah dari kedua gen yang digunakan dalam NCBI.
2. kedua gen ini secara utuh diisolasi dengan analisis RACE. Kit ampli fi kasi
SMART RACE cDNA (Clontech, Amerika Serikat) digunakan untuk mendapatkan
transkrip lengkap dan urutan PsbO dan PsbP gen tersedia dari GenBank (nomor
aksesi: MF346691untuk PsbO dan MF346690 dari PsbP).
3. Total RNA diekstraksi menggunakan kit RNeasy Plant Mini (Qiagen, Inc.,
Valencia, CA, Amerika Serikat), dan cDNA disintesis seperti yang
direkomendasikan oleh kit SMART RACE. Primer khusus gen (GSP): PsbO
(RAO1: 5 ′ - TACCCAAGCGGCTGACCTTCGACG-3 ′), PsbP (RAP1: 5 ′ -
GTGGCTGGGGGAGGGAGCATG-3 ′) dan Primer spesifik gen bersarang
(NGSP): PsbO (RAO2: 5 ′ - Sebuah CGTATACGGAGGTGAAAGGGTCGGG-3
′), PsbP (RAP2: 5 ′ - ATAAGGCGATGAGACCTGGAG-3 ′) dirancang untuk 5 ′ -
dan 3 ′ - RACE menggunakan software primer premier 5.0.
AMPLIFIKASI CEPAT
BERAKHIR CDNA (RACE
4. Urutan primer tercantum dalam Tabel Tambahan S1.
5. PCR putaran pertama dilakukan dengan primer GSP dan Universal Primer Mix
(UPM).
6. Produk PCR pertama yang diencerkan 1 / 1000X digunakan sebagai template
dalam PCR bersarang dengan NGSP.
7. Produk RACE dipisahkan pada gel agarosa dan dimurnikan menggunakan Gel-M
TM Kit sistem ekstraksi gel (Viogene, Taipei, Taiwan). CDNA yang telah
dimurnikan diikat ke dalam pGEM-T Easy Vector (Promega, Amerika Serikat)
dan diurutkan sepenuhnya dari kedua arah. Semua hasil RACE dikonfirmasi oleh
PCR ujung ke ujung.
ANALISIS EKSPRESI GEN
1. Total RNA diekstraksi dari daun varigata menggunakan kit RNeasy Plant Mini (Qiagen, Inc.,
Valencia, CA, Amerika Serikat) diikuti dengan DNase (Qiagen, Inc., Valencia, CA, Amerika
Serikat) mengikuti protokol pabrik, kecuali jika lama inkubasi adalah 20 menit.
2. Reverse transcript (RT) dilakukan dengan reverse transcriptase (Promega, Amerika Serikat)
menggunakan 500 ng dari total RNA dalam 10- µ Volume reaksi L A
3. 0,5 µ Larutan reaksi L digunakan sebagai template PCR untuk ekspresi gen.
4. Analisis PCR menggunakan campuran master hijau SYBR 2X Cepat (Applied Biosystems,
Amerika Serikat) dengan ABI 7900 PRISM Sequence Detection System.
5. RT-PCR semi-kuantitatif (qRT-PCR) mengukur ekspresi gen menggunakan primer spesifik (Tabel
Tambahan S1) dengan 18S rRNA sebagai kontrol internal.
6. Kondisi thermocycling adalah sebagai berikut: denaturasi awal terjadi pada 94 ◦ C selama 5 menit,
diikuti oleh 30 detik (untuk PsbP dan PsbO) dari 20 detik pada 94 ◦ C, 20 detik pada 59 ◦ C, 30
detik pada 72 ◦ C, dan diakhiri dengan perpanjangan akhir 7 menit pada 72 ◦ C. Setiap percobaan
diulang setidaknya tiga kali dan setiap sampel dikumpulkan dari setidaknya tiga individu.