KROMATOGRAFI

FILTRASI GEL

1
 PRINSIP PEMISAHAN
• Kromatografi Filtrasi Gel, juga dikenal sebagai
kromatografi saringan molekuler.
• Kromatografi Filtrasi Gel memisahkan molekul
berdasarkan ukuran dan bentuknya.
• Fase diam terdiri dari manik-manik (beads) yang
mengandung pori-pori berbagai ukuran yang relatif
sempit.
• Molekul yang lebih kecil menghabiskan lebih banyak
waktu di dalam manik-manik daripada molekul yang
lebih besar dan karena itu mengelusi kemudian
setelah volume yang lebih besar telah melewati fase
gerak dalam kolom).
2
PRINSIP PEMISAHAN

3
 CARA KERJA

size Molecular mass

(daltons)
10,000

30,000

100,000

4
 CARA KERJA

flow

5
 CARA KERJA

flow

6
 CARA KERJA

flow

7
 CARA KERJA

flow

8
 CARA KERJA

flow

9
 TEORI

Gel berpori

Matriks dalam kolom

Molekul besar “exclude" dari pori-pori dan bergerak paling cepat

melalui kolom
Molekul kecil “include" - dapat berdifusi ke dalam
pori-pori dan terelusi kemudian 10
 TEORI

Total Liquid Pore Volume

Void Volume Absorbance
Volume (Internal Volume)

Interacting with medium

High molecular weight

Low molecular weight

molecular weight
Sample injection

Intermediate
Vo
Ve
Vt – Vo- Vg
Vo Vt Vi = V t – V o - V g

Vc = Geometric column volume Isocratic elution

Gel berpori dalam kolom

11
12
Penentuan Ve

13
Gel filtration

14
 TEORI
Resolution: Ve
Ve
R=
( WA + WB ) / 2

WB WA

Good selectivity Large Ve

Low band broadening Small W
(good efficiency)

High Resolution

15
 TEORI
Selectivity & Efficiency: A

Poor selectivity

A
Good selectivity
High
efficiency
High
efficiency Low
efficiency
V

Low
efficiency

16
 TEORI
Penentuan efisiensi
Ve L
HETP =
N
Ve
N = 5.54 ( )2
W1/2 h W1/2

1/2 h
L= column length (cm)
N= number of theoretical plates
Ve = elution volume
W= peak width at half of the peak
height

17
 Faktor Efisiensi
Asymmetry factor As
Ve

b
As =
a
h

a = 1st half peak width at 10 % of peak height

0.1 h
a b b = 2nd half peak width at 10 % of peak height

18
 Syarat Gel
• Inert
• Stabil
• Kandungan gugus ionik rendah
• Ukuran partikel dan distribusinya harus
terkontrol baik
• Kekakuan butiran gel harus setinggi
mungkin

19
 Klasifikasi Gel
1 Gel kaku
- volume pori seragam dan tetap
- permeabilitas kolomnya tinggi
- dapat dibasahi oleh air ataupun pelarut organik
- contoh: silika atau gelas berpori
2 Gel setengah kaku
- permeabilitas kolom tinggi
- dapat dibasahi oleh pelarut air
- contoh : polistiren berikatan silang, resin penukar ion, dan polivinil
asetat
3 Gel lunak
- rentang permeabilitas tergantung pada besarnya “pengembangan
oleh pelarut”bila dimasukkan dalam pearut tersebut
- contoh : dekstran, kanji, karet polistiren ikatan silang, gel
poliakrilamida

20
 KEUNTUNGAN
Metode yang baik untuk pemurnian protein dengan perbedaan
BM karena:
• Tidak tergantung pada suhu, pH, kekuatan ion dan
komposisi buffer sehingga pemisahan bisa dilakukan di
segala kondisi
• Hanya sedikit terjadi adsorpsi
• Pelebaran pita lebih sedikit disbanding dengan metode lain
• Volume elusi berhubungan dengan BM

21
 APLIKASI

• Pemurnian enzim dan protein lain

• Perkiraan BM untuk protein globular

22
 JENIS OPERASIONAL
Metode Fraksinasi
• Pemisahan sempurna dari campuran molekul dengan
perbedaan K yang kecil sehingga memerlukan kolom-
kolom yang panjang, kecepatan alir yang lambat dan
waktu yang lama
• sephadex G-25, sephadex G-50, sephadex G-500,

23
 JENIS OPERASIONAL
Metode Desalting
• Menghilangkan garam-garam dan molekul-molekul
kecil dari molekul besar (makro)
• Perbedaan yang besar dalam K memungkinkan untuk
memakai kolom sederhana kecepatan alur yang
tinggi.
• sephadex G-25, sephadex G-50, Biogel P-6, Biogel P-
10
24