Yogi Khoirul Abror S.Tr.

AK
STIKES NGUDIA HUSADA MADURA
 Immunoassay

• Sistem pemeriksaan yang mempergunakan

satu atau lebih produk atau reagen imunologik
• Prinsip dasar: ikatan antara molekul
imunoglobulin (Ab) dengan antigen (Ag)
• Hasil interaksi Ag – Ab (kompleks imun)
harus terlihat dan dapat diukur

2
• Dasar
Reaksi Ag dengan Ab spesifik
• Tujuan
Mendeteksi keberadaan Ag dalam serum memakai
Ab spesifik
Mendeteksi keberadaan Ab dalam serum memakai
Ag yang sesuai
• Manfaat
1. Menentukan status imunitas
2. Memperkirakan prevalensi penyakit
3. Mengetahui adanya invasi
mikroorganisme, jika isolasi kuman
tidak dapat dilakukan
4. Menunjang diagnosis penyakit

4
Macam :
1. Uji kualitatif hasil + / -
2. Uji kuantitatif hasil kadar

Pengenceran tertinggi hasil +

(uji semikuantitatif)
Contoh :
 pengenceran 1 dalam 8: 1 vol serum +7 vol
pengencer: titer 1/ 8 sampel diencerkan 8 X
 Bahan pemeriksaan

Serum, plasma, urin

Plasma hanya untuk pemeriksaan tertentu saja.
Serum harus dihindarkan dari hemolisis, lipemik &
kontaminasi bakteri (pengiriman < 2 jam)
Disimpan dalam
Suhu 2 – 8oC : 48 jam
-20oC s/d - 70oC: > 48 jam
Diberi label

6
 Teknik Pemeriksaan Imunoserologi

1. Imunopresipitasi
Non
Labelling 2. Aglutinasi, flokulasi
3. Fiksasi komplemen
4. Radioimmunoassay (RIA)
5. Enzyme immunoassay (EIA) atau
Enzyme linked immunosorbent assay
Labelling (ELISA)
6. Immunofluorescent (IF)
7. Immunochromatographic technique (ICT)

7
IMUNOASSAI
NON LABEL
 1. Imunopresipitasi

• Interaksi → Ag-Ab komplek tdk larut

(presipitat)
• Faktor yg mempengaruhi :
 Aviditas Ab → stabilitas komplek Ag-Ab
 Suhu (optimal 0-37o C)
 pH (netral = 6-7,5), pH < 6 ; >7,5 → mudah
disosiasi
 Molaritas (molaritas < 0,15 M) ; >0,15 M →
men-cegah presipitasi
 Imunopresipitasi…

Pembentukkan presipitat terjadi apabila

konsentrasi Ag dan Ab seimbang (zona ekivalen =
ZE)
Konsentrasi Ag berlebih → Komplek Ag-Ab yg
terbentuk larut kembali disebut postzone effect
Konsentrasi Ab berlebih → Komplek Ag-Ab yg
terbentuk tetap larut disebut prozone effect
ZE sempit → Ag bersifat mudah larut
ZE lebar → Ag bersifat tdk mudah larut, BM
besar, & multikomponen Ag
 Ekses antibodi Seimbang Ekses antigen
PRESIPITASI ANTIGEN-ANTIBODI

Prozone KONSENTRASI ANTIGEN Postzone

 2. Aglutinasi

– Umumnya : Ag bentuk partikel + Ab spesifik

→ Aglutinasi
– Reaksi 2 tahap :
1. Ab dgn salah satu antigen binding site (Fab)
bereaksi dgn Ag
2. Fab yg lainnya berikatan dgn Ag lain yg sudah
berikatan dgn Ab gumpalan (lattice)
– Aglutinasi lebih mudah terjadi pada IgM o/k
dibanding IgA dan IgG
 Ag Ab K.I

Tahap I
+

Tahap II Aglutinasi
 Imunoasai berlabel

 Imunoassai yang menggunakan indikator utk

melacak Ag atau Ab dengan konsentrasi rendah
 Mampu melacak interaksi primer Ag-Ab (initial
binding)
 Sensitifitas analitik lebih tinggi dibanding
imunoassai non label
 Label yg digunakan :
 isotop : I125, H3, C14
 non isotop : enzim (ALP, HRP), floresen
(fluorescein, rhodamine), kemiluminesen
 Selain uji kuantitatif, dpt digunakan pada uji
kualitatif (ANA tes, antitiroid Ab)
 Imunoasai Berlabel

1. Radioimunoassai (RIA/IRMA)

2. Imunofloresen (IF)

3. Enzyme Imunoassay (EIA/ELISA)

4. Imunokromatografi (ICT)
 1. Radioimunoasai

● Immunoassay berlabel radioisotop  membedakan Ag

yang terikat Ab dengan Ag bebas.
● Sensitif & spesifik untuk ttk kadar bahan yang amat
rendah dalam serum
● Yang diukur : - γ-ray → I125
- β particle → H3

Radiolabel pada imunoassai dibagi 2 kelompok:

a. Radioimmunoassay (RIA): radiolabelisasi pada
Ag
b. Immunoradiometric Assay (IRMA):
radiolabelisasi pada Ab
● Kerugian:
 Bahaya efek radiasi bahan radioaktif
 Waktu paruh reagen singkat, γ dan β counter
mahal

● Keuntungan:
 Presisi baik and high sensitivity
 Isotope conjugation lebih mudah
 Signal detection tanpa optimalisasi
 Lebih stabil terhadap interferensi environment
(pH, suhu)
 Prinsip dasar RIA

E E E
+ E + E
E E
E

cuci
Ab pd fase Ag
padat berlabel Ag

Radiaton
counter
 2. Imunofloresen assay (IFA)

 Merupakan teknik untuk deteksi Ag/Ab pada

cairan tubuh atau jaringan/sel
 Prinsip :
Molekul yg mampu menyerap energi radiasi
dan memancarkannya kembali dlm btk cahaya
(floresensi)
 Memerlukan alat fluorometer/mikroskop
 Menggunakan label:
• Fluorescein → warna hijau
• Rhodamin → warna merah
 Enzyme immunoassay

• Immunoassay dengan menggunakan label enzim

• Relatif murah, banyak tersedia, reagen bertahan lama,
mudah diotomatisasi, peralatan yang relatif murah
• Enzim yang digunakan dipilih berdasakan jumlah
molekul substrat yang dapat dirubah per satu
molekul enzim, mudah dan cepat mendeteksi serta
stabil.
• Dibaca dengan alat :
– Spektrofotometer ( λ = 492 m) → microELISA reader
– Fluorometer/Luminometer
 Kerugian:
 Reaksi enzim lebih kompleks dari pada label
isotop
 Masih dipengaruhi faktor environment (plasma
constituents)

 Keuntungan:
 Mudah dikerjakan
 Relatif murah, simultan dgn pemeriksaan yg lain
 Bahaya radioaktif (-)
 Imunokromatografi

Imunokromatografi
 Lateral flow test
 Membacanya cukup dgn mata saja
 Tidak membutuhkan substrat
 Penggunaan colloidal gold waktu inkubasi pendek (<15
menit)

Kerugian :
 Nitrocelulose membrane tdk stabil pada suhu ↑

Keuntungan :
 Prosedur cepat (<15 menit) dan praktis
 Nilai diagnostik baik
 Stabil untuk jangka panjang
 Relatif tidak mahal
 Prinsip dasar ICT

A. Melacak Analit (Ag)

a. Reaksi langsung (Double Antibody Sandwich)/Asai
Imunometrik  untuk melacak analit yang besar dan
memiliki > 1 epitop (LH,hCG dan HIV)
b. Reaksi kompetitif/Hambatan kompetitif (competitive
Inhibition)  untuk melacak molekul kecil dengan
epitop tunggal

B. Melacak Ab  Indirect Assay